高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母在丟糟酒中的應(yīng)用

韓雨辰，劉小敏，肖冬光

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

中國傳統(tǒng)白酒發(fā)酵生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物為蒸餾提取殘留物丟糟，每產(chǎn)1噸白酒，就產(chǎn)生2噸～4噸丟糟[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，我國白酒年產(chǎn)量約為800萬噸，副產(chǎn)品丟糟的年產(chǎn)量為2 500萬噸左右[3-4]。丟糟酸度較大，水分含量高，不易儲存易腐敗，如不及時有效地進(jìn)行加工處理，易造成環(huán)境的嚴(yán)重污染，影響生態(tài)平衡[5]。對酒糟充分利用，既可以減輕環(huán)境污染，又可以節(jié)約糧食、降低生產(chǎn)成本[6-8]?？梢姡圃愕木C合利用對我國的資源開發(fā)和環(huán)境保護(hù)具有十分重要的意義[9]。尤其是在低碳經(jīng)濟(jì)時代，如果可以實現(xiàn)白酒丟糟的充分利用就可以促使傳統(tǒng)白酒產(chǎn)業(yè)成為更合理的無廢棄物的全新生態(tài)產(chǎn)業(yè)[10-11]。

白酒糟中水分含量約65%～70%，還含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和粗淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)以及醇、酯、酸等風(fēng)味物質(zhì)[12-13]。丟糟中含有約70%的乳酸乙酯未被蒸餾出，用酒糟作原料進(jìn)行再發(fā)酵能帶入大量的呈香呈味物質(zhì)，對白酒的生產(chǎn)具有重要的意義[14]。宗緒巖等[15]比較了不同糖化酶在芝麻香型丟糟酒中的應(yīng)用，優(yōu)化后的出酒率提高了3.26%。賈盼等[16]研究了安琪釀酒曲發(fā)酵白酒丟糟，試驗結(jié)果顯示糟醅淀粉利用率提高了0.7%。目前丟糟再發(fā)酵利用方式主要為添加酵母和糖化酶強(qiáng)化出酒率，但是往往忽略了對丟糟酒風(fēng)味物質(zhì)和產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)注。高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母的使用，可以顯著提高白酒中乙酸乙酯含量，同時均衡白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯的比例，減少酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇的生成，提高酯醇比及丟糟酒的質(zhì)量[17]。

本文研究高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母在丟糟酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，優(yōu)化不同的糖化劑比例、不同釀酒酵母菌種和酵母接種量，以提高丟糟酒的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益，對降低白酒工業(yè)糧耗、改善丟糟酒品質(zhì)、提高我國釀酒工業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)水平和市場競爭力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐高溫釀酒酵母（ADY）：安琪酵母股份有限公司；液化酶（2萬 U/mL）、糖化酶（10萬 U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；玉米粉：市售；丟糟：某白酒廠提供；硫酸銨、磷酸氫二鉀（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硫酸鎂（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠。麩曲UV-11：以黑曲霉UV-11制作麩曲UV-11，其糖化酶活力為2 400 U/g，以下簡稱麩曲UV-11。菌種：高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母PY-1、MY-15、PYY-1均由天津科技大學(xué)現(xiàn)代釀造實驗室選育。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890C氣相色譜儀、LZP-930柱（50 m×0.32 mm×1.00 μm）色譜柱：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母種子培養(yǎng)基配制

將玉米粒粉碎，玉米粉∶水=1∶4（g/mL），加液化酶21U/g，85℃保溫15min，加熱煮沸30min，冷卻至60℃，加糖化酶 300 U/g，保溫 4 h，過濾，調(diào)糖度至 18 °Bx，添加硫酸銨6 g/L、硫酸鎂1.2 g/L、磷酸氫二鉀2.4 g/L，攪勻，115℃滅菌15 min。

1.3.2 酵母種子培養(yǎng)

從斜面劃下一環(huán)酵母接入5 mL的酵母種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，30℃靜止培養(yǎng)24 h，至產(chǎn)生部分渾濁；再將一級種子液全部轉(zhuǎn)接至裝有45 mL酵母種子培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行二級培養(yǎng)，30℃靜置培養(yǎng)16 h。

1.3.3 丟糟發(fā)酵試驗

將新鮮的糟拌入糖化劑、接入酵母二級種子液，裝入600 mL小壇，每壇裝料量250 g糟，水封，30℃下發(fā)酵7 d。測定酒醅酒精度、殘淀粉、酸度和主要風(fēng)味物質(zhì)。

1.3.3.1 不同糖化劑發(fā)酵試驗

耐高溫釀酒活性干酵母接種量6億/100 g糟，糖化酶活力單位4 000 U/100 g糟，糖化劑分別為100%糖化酶（糖化酶0.04 mL/100 g糟）、100%麩曲UV-11（1.67 g/100 g糟）、50%麩曲UV-11（0.83 g/100 g糟）和50%糖化酶（0.02 mL/100 g糟）。

1.3.3.2 不同酵母發(fā)酵試驗

以100%麩曲UV-11為糖化劑（1.67 g/100 g糟），耐高溫釀酒活性干酵母（接種量6億/100 g糟）為對照，在酵母接種量保持不變的情況下，進(jìn)行高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母PY-1、MY-15、PYY-1對比試驗。

1.3.3.3 不同酵母接種量試驗

以100%麩曲UV-11為糖化劑（1.67 g/100 g糟），高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母PY-1為菌種，比較接種量為 4、6、8、10億/100 g糟的試驗效果。

1.3.4 檢測方法

1.3.4.1 酒精度的測定

采用酒精計測量法[18]測定酒精度。

1.3.4.2 殘淀粉的測定

采用斐林試劑法[19]測定殘淀粉。

1.3.4.3 酸度的測定

采用酸堿滴定指示劑法[20]測定酸度。

1.3.4.4 主要風(fēng)味物質(zhì)分析

檢測條件：檢測器為氫火焰離子化檢測器，色譜柱為 HP-INNOWAX（30 m×0.320 mm×0.25 μm），載氣為高純度氮?dú)?，流?.8mL/min，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器溫度210℃，進(jìn)樣量 1 μL，分流比 10∶1。起始色譜柱溫度50℃并維持8 min，然后按照5℃/min的速度升溫到180℃，維持10 min[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設(shè)置3組平行組，準(zhǔn)確性試驗的數(shù)據(jù)均由Excel 2020計算并繪制圖得出，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同糖化劑發(fā)酵試驗

不同糖化劑發(fā)酵試驗結(jié)果如圖1～圖3所示。

圖1 糖化劑種類對酒醅理化指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of saccharifying agents on physicochemical indexes of fermented grains

圖2 糖化劑種類對酯類風(fēng)味物質(zhì)影響Fig.2 Effect of saccharifying agent types on ester flavors

圖3 糖化劑種類對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)影響Fig.3 Effect of saccharifying agent on flavor substances of higher alcohols

由圖1可知，不同糖化劑對酒醅酸度影響不大。與其它兩種糖化劑相比，50%糖化酶+50%麩曲UV-11作為糖化劑時，酒醅酸度略有升高，對酒精度和殘淀粉有較大影響。當(dāng)糖化劑為50%糖化酶+50%麩曲UV-11時，酒精度達(dá)到最高值，為3.2%vol，其次是100%麩曲UV-11，使用100%糖化酶的酒精度最低；使用50%糖化酶+50%麩曲UV-11時，殘淀粉含量最低，為6.9%，100%麩曲UV-11組次之，100%糖化酶最高。

如圖2所示，使用100%糖化酶作為糖化劑時，乙酸乙酯含量非常少，僅為2.6 mg/kg，乳酸乙酯含量為262.7 mg/kg；當(dāng)使用100%麩曲UV-11作為糖化劑時，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分別為36.8 mg/kg和273.5 mg/kg，與100%糖化酶相比，乙酸乙酯含量提高14倍；使用100%麩曲UV-11作為糖化劑時，總酯含量為310.3 mg/kg，與使用100%糖化酶相比，總酯含量提高了14.5%。

如圖3所示，不同糖化劑對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響相對較小，除正丙醇外，其余高級醇類風(fēng)味物質(zhì)含量均低于100%糖化酶，使用100%麩曲UV-11和50%糖化酶+50%麩曲UV-11的總高級醇含量比使用100%糖化酶低6.67%左右。綜合理化指標(biāo)與主要風(fēng)味物質(zhì)含量，100%麩曲UV-11為最佳糖化劑。

2.2 不同酵母發(fā)酵試驗

2.2.1 酵母種類對理化指標(biāo)的影響

酵母種類對理化指標(biāo)的影響結(jié)果見圖4。

圖4 酵母種類對酒醅理化指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of yeast specie on physical and chemical indexes of fermented grains

由圖4可知，不同酵母對酒醅酸度影響不大，均在2.5 mmol/10 g糟左右，對酒精度和殘淀粉的影響較大。當(dāng)使用釀酒酵母PY-1時，酒精度最高，達(dá)3.4%vol；使用釀酒酵母PYY-1次之，使用MY-15與對照組最低；使用釀酒酵母PY-1殘淀粉含量最低，為6.5%，其次是釀酒酵母PYY-1，MY-15與對照組較高。

2.2.2 酵母種類對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響

酵母種類對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖5。

圖5 酵母種類對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of yeast specie on ester flavor substances

由圖5可知，使用釀酒酵母MY-15的總酯含量、乙酸乙酯含量與對照組相差不大，但乳酸乙酯含量有所降低。使用釀酒酵母PY-1和PYY-1的總酯含量有所提高，分別為339.7 mg/kg和335.6 mg/kg。其中使用釀酒酵母PY-1的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量分別為53.8 mg/kg和285.7 mg/kg，分別比對照組提高了46.2%和4.5%。

2.2.3 酵母種類對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響

酵母種類對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖6。

圖6 酵母種類對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of yeast specie on flavorsubstances of higher alcohols

由圖6可知，不同高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)有影響，除異丁醇含量比對照組稍高，其余高級醇含量均低于對照組，總高級醇含量使用高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母PY-1、MY-15、PYY-1分別比對照組下降了34.4%、28.6%、19.0%。綜合理化指標(biāo)與主要風(fēng)味物質(zhì)含量，最佳釀酒酵母應(yīng)選擇PY-1。

2.3 不同酵母接種量發(fā)酵試驗

2.3.1 酵母接種量對理化指標(biāo)的影響

酵母接種量對理化指標(biāo)的影響結(jié)果見圖7。

由圖7可知，不同酵母接種量對酒醅理化指標(biāo)略有影響，隨著酵母接種量的增加，酒精度和酸度有升高趨勢，殘淀粉稍有下降。當(dāng)酵母接種量達(dá)6億/100 g糟時3個理化指標(biāo)變化明顯，此時殘淀粉含量降低至6.4%，酒精度為3.4%vol，比對照組酒精度提升了30.8%；酵母接種量高于6億/100 g糟后趨于平穩(wěn)，酒精度均在（3.4±0.1）%vol范圍內(nèi)。

圖7 酵母接種量對酒醅理化指標(biāo)的影響Fig.7 Effect of yeast addition on physical and chemical index of fermented grains

2.3.2 酵母接種量對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響

酵母接種量對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖8。

圖8 酵母接種量對酯類風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.8 Effect of yeast addition on ester flavor substances

由圖8可知，隨著酵母接種量的增加，乙酸乙酯、乳酸乙酯和總酯均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，當(dāng)酵母接種量為6億/100 g糟時各項酯類風(fēng)味物質(zhì)含量均為最高值，乙酸乙酯、乳酸乙酯、總酯含量分別為53.8、285.7、339.7 mg/kg，分別比對照組提高了21倍、8.8%、28.0%。

2.3.3 酵母接種量對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響

酵母接種量對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖9。

如圖9所示，不同酵母接種量對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響相對較大，隨著酵母接種量的增加，總高級醇含量呈先減少后增加的趨勢，當(dāng)接種量為6億/100 g糟時，總高級醇含量最低，為55.4 mg/kg，比對照組降低38.5%。綜合理化指標(biāo)與主要風(fēng)味物質(zhì)含量，最佳酵母接種量應(yīng)為6億/100 g糟。

圖9 酵母接種量對高級醇類風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.9 Effect of yeast addition on flavor substances of higher alcohols

3 討論與結(jié)論

通過研究高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母在丟糟酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，確定了最佳糖化劑為100%麩曲UV-11，接種量為1.67 g/100 g糟，最適酵母為PY-1，接種量為6億/100 g糟。在此發(fā)酵條件下，酒醅中酒精含量為3.4%vol，殘淀粉降低至6.4%。與使用普通ADY酵母和糖化酶作為發(fā)酵劑相比較，酒精度由2.6%vol提升至3.4%vol，酒精度提高了30.8%；乙酸乙酯從2.6 mg/kg提高至53.8 mg/kg，提高了21倍，總酯含量由265.4mg/kg提高至339.7mg/kg，提高了28.0%；主要高級醇類物質(zhì)均有所降低，其中苯乙醇含量降低最為顯著，從30.9 mg/kg降低至17.0 mg/kg，總高級醇類物質(zhì)降低約38.5%。采用丟糟再發(fā)酵工藝，并使用高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母，對丟糟中殘留的風(fēng)味物質(zhì)及殘余淀粉進(jìn)行充分利用，使乙酸乙酯含量得到明顯提高，同時適當(dāng)降低高級醇的含量，有效提高了丟糟酒的品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)效益。

雖然高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母在丟糟酒生產(chǎn)中的產(chǎn)酒能力和生香能力突出，但是基于目前研究并不能使酒體風(fēng)味物質(zhì)協(xié)調(diào)。清香型麩曲UV-11白酒的乙乳比應(yīng)當(dāng)控制在1.5～2.0之間最佳[7]，顯然本試驗所得丟糟酒乙酸乙酯含量還有提升空間。除此之外，該丟糟酒的酸度只有2.28 mmol/10 g糟。隨著糧糟質(zhì)量比的增大，酒醅酸度和丟糟酒中乙酸乙酯含量會隨之升高。由此可見，未來可在利用高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母的同時，采用在丟糟中加入少量糧食的方法，提高酒醅酸度及丟糟酒中乙酸乙酯含量，進(jìn)一步優(yōu)化丟糟酒的品質(zhì)。