蜂王漿中超氧化物歧化酶的活性測(cè)定與應(yīng)用

楊焱，胡九菊，李林霖，趙勛能，張健*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.北京金王健康科技有限公司，北京 100269）

蜂王漿（royal jelly）又名蜂皇漿、王漿，是由青年工蜂發(fā)達(dá)的下咽頭腺和上顎腺等腺體共同分泌的乳白色或淡黃色漿狀物，具有抗衰老、抗菌、抗疲勞、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病和抗突變等多種生理功能[1-2]。蜂王漿的質(zhì)量和生理功能由其成分決定，但蜂王漿成分復(fù)雜，且易受季節(jié)、產(chǎn)地、蜜源、蜂種和貯存條件等影響[3]，很難明確其成分與質(zhì)量或生理功能之間的相關(guān)性。盡管如此，人們發(fā)現(xiàn)新鮮蜂王漿的生理功能遠(yuǎn)高于貯存后的蜂王漿，且貯存時(shí)間越久，生理功能越低。可見(jiàn)蜂王漿極易變質(zhì)，其品質(zhì)和生理功效易受貯存條件的影響，若貯存條件不當(dāng)，則蜂王漿的物理性狀、化學(xué)組成和生理功效均會(huì)發(fā)生顯著變化。

為有效地評(píng)價(jià)蜂王漿的質(zhì)量，從而建立蜂王漿的分級(jí)和定價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以及改良銷(xiāo)售、流通各環(huán)節(jié)的貯存方法，科研人員進(jìn)行了大量試驗(yàn)，試圖找到一些有價(jià)值的蜂王漿新鮮度評(píng)價(jià)指標(biāo)，已報(bào)道的指標(biāo)包括色度[4]、糠氨酸[5]、糠醛[6]、游離氨基酸[7]、57 ku 蛋白[8]和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）及其降解產(chǎn)物[9-10]、酶類(lèi)物質(zhì)（超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶）[3，11]等，然而受各種因素的制約，目前仍沒(méi)有一種蜂王漿新鮮度評(píng)價(jià)指標(biāo)被世界公認(rèn)。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種能直接地、特異性地猝滅超氧化自由基的抗氧化酶，能顯著降低超氧陰離子對(duì)細(xì)胞的毒性作用，具有抗衰老、抗腫瘤和抗輻射等生理功能。袁耀東等[12]研究表明了蜂王漿中含有0.403 ng/g的SOD；龐紅金[11]、張映等[13]、張娟等[14]和唐朝忠等[15]分別研究了不同貯存溫度和時(shí)間條件下蜂王漿中SOD活性的變化，發(fā)現(xiàn)反復(fù)冷凍、解凍對(duì)蜂王漿SOD活性影響很大；蜂王漿中SOD活性隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且貯存溫度越高失活速度越快。在-18℃下貯存一個(gè)月，蜂王漿中SOD活性基本穩(wěn)定；在4℃下貯存10 d，SOD活性略有下降，但變化亦不顯著；在25℃下貯存10 d后SOD活性消失。

上述報(bào)道中，除張娟等[14]采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，其他研究均采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性。相比而言，黃嘌呤氧化酶法具有更好的靈敏度，檢測(cè)更為快速，干擾更少，更適合用于科研和仲裁[16]。蜂王漿成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾對(duì)SOD活性的測(cè)定影響很大，必須對(duì)蜂王漿預(yù)處理除去干擾物，才能保證SOD測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)在測(cè)定SOD時(shí)對(duì)蜂王漿的預(yù)處理卻鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定蜂王漿中SOD活性，優(yōu)化了蜂王漿的預(yù)處理方法，測(cè)定了蜂王漿在不同貯存時(shí)間和溫度下SOD活性變化，以及不同生產(chǎn)工藝和蜜源對(duì)SOD活性的影響，評(píng)價(jià)了SOD活性作為新鮮度指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂王漿：北京金王健康科技有限公司。試驗(yàn)中所使用蜂王漿包括以下幾種：粗品蜂王漿為采集后直接罐裝，含有雜質(zhì)的待加工原材料，包含以荊花、椴樹(shù)花、槐花為蜜源的新鮮蜂王漿；純品蜂王漿為以槐花為蜜源的新鮮蜂王漿，根據(jù)不同的加工方法，分為正常工藝（普通）、全鏈條低溫保存及速凍工藝（速凍）和過(guò)度加工（加工）3種。

總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，TSOD）測(cè)試盒（羥胺法）：南京建成生物工程研究所；冰乙酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑公司；氯化鈉（分析純）：天津市北方天醫(yī)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；UV-3100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀動(dòng)力測(cè)試儀器有限公司；QL-902渦旋振蕩儀：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SOD粗提液的制備

將蜂王漿從-18℃冰箱中取出，于4℃下解凍2 h，無(wú)冰碴即可用于后續(xù)試驗(yàn)。以將蜂王漿3倍稀釋為例，首先在EP管內(nèi)加入生理鹽水2 mL，緩慢加入蜂王漿，直至液面漲至3 mL，加入玻璃珠后，置于渦旋振蕩儀上渦旋混勻。離心取上清液在同樣條件下再次離心，上清液即為SOD粗提液。

1.3.2 酶活測(cè)定

本試驗(yàn)使用T-SOD測(cè)試盒檢測(cè)酶活，試劑盒采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定SOD活性，具體測(cè)定方法參照南京建成總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2－·），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其吸光度[16]。因酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線(xiàn)關(guān)系，故在確定稀釋倍數(shù)時(shí)，應(yīng)取百分抑制率在45%～55%的樣本濃度作為最佳取樣濃度。通過(guò)公式（1）可計(jì)算出吸光度抑制率，根據(jù)抑制率通過(guò)公式（2）計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活性。

式中：R1為氧化抑制率，%；A0為對(duì)照管吸光度；A1為對(duì)照管吸光度。

式中：U1為總 SOD 活性，U/mL；R1為氧化抑制率，%；V1為反應(yīng)液總體積，mL；V2為測(cè)定樣品體積，mL；n為樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以粗品槐花蜂王漿為原料，優(yōu)化的因素包括研磨時(shí)間、稀釋倍數(shù)、稀釋液成分、離心次數(shù)、離心轉(zhuǎn)速。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，以在4℃下，使用蒸餾水對(duì)樣品進(jìn)行2倍稀釋?zhuān)心r(shí)間控制在20 s，以6 000 r/min進(jìn)行1次離心，單次離心時(shí)間20 min，作為基礎(chǔ)反應(yīng)條件。單一改變基礎(chǔ)反應(yīng)條件中的變量，分別測(cè)定研磨時(shí)間為 0、10、20、60 s時(shí)；稀釋倍數(shù)為 2、3、4、5 倍時(shí)；稀釋液為蒸餾水、生理鹽水時(shí)；轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，離心1次或2次時(shí)；離心1次，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min或12 000 r/min時(shí)，蜂王漿樣品粗提液SOD的活性。每個(gè)水平測(cè)定3次取平均值，每個(gè)因素均以酶活力最高的水平為100%計(jì)，其它水平實(shí)際酶活與最高水平實(shí)際酶活的比值的百分?jǐn)?shù)即為該水平下的相對(duì)酶活力，以相對(duì)酶活力反映試驗(yàn)效果。

1.3.4 不同溫度和存放時(shí)間對(duì)蜂王漿SOD活性的影響

以粗品和純品的槐花蜂王漿為原料，其中純品槐花蜂王漿以正常工藝制備。采用優(yōu)化后的預(yù)處理方法提取蜂王漿中SOD，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。分別考察新鮮蜂王漿在4℃和25℃下不同貯存時(shí)間的SOD相對(duì)酶活力，每2 d測(cè)定一次，以每個(gè)因素中酶活力最高者為100%計(jì)。

1.3.5 不同蜜源對(duì)蜂王漿SOD活性的影響

采用優(yōu)化后的預(yù)處理方法提取蜂王漿中SOD，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。測(cè)定荊花、椴樹(shù)花、槐花蜜源的新鮮粗品蜂王漿中的SOD相對(duì)活性，以活性最高者為100%計(jì)。

1.3.6 蜂王漿不同生產(chǎn)工藝對(duì)蜂王漿SOD酶活力的影響

采用優(yōu)化后的預(yù)處理方法提取蜂王漿中SOD，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。考察不同生產(chǎn)工藝的純品槐花蜂王漿中SOD活性，以酶活力最高者為100%。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)方法

每組數(shù)據(jù)均平行3次，采用Origin 2018進(jìn)行繪圖；差異的顯著性通過(guò)采用Graphpad Prism 8.0.1中單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨時(shí)間對(duì)SOD活性的影響

觀(guān)察發(fā)現(xiàn)粗品槐花蜂王漿樣品中含有結(jié)晶狀顆粒物，為使其完全溶解，提高SOD提取收率，采用研缽對(duì)其進(jìn)行研磨，考察研磨時(shí)間對(duì)SOD活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 研磨時(shí)間對(duì)SOD活性的影響Fig.1 Effect of grinding time on SOD enzyme activity

由圖1可知，60 s內(nèi)研磨時(shí)間對(duì)酶活性無(wú)明顯影響。王粉琴等[17]認(rèn)為蜂王漿中結(jié)晶狀顆粒物為10-羥基-2-癸烯酸晶體，它是王漿中很重要的一種脂肪酸，析出程度隨蜂王漿新鮮度以及品質(zhì)的不同而變化。既然該物質(zhì)不影響SOD測(cè)定，此步驟可以省略。

2.2 樣品稀釋倍數(shù)以及稀釋液對(duì)SOD活性的影響

粗品槐花蜂王漿樣品濃稠且黏度較高，為取抑制率在45%～55%的樣本濃度作為最佳取樣濃度，故對(duì)樣品梯度稀釋?zhuān)豢紤]到蛋白質(zhì)的鹽溶作用，故比較生理鹽水與蒸餾水作為稀釋劑的效果，以提高SOD提取收率，考察樣品不同稀釋液和稀釋倍數(shù)下的抑制率，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 不同稀釋液和稀釋倍數(shù)對(duì)抑制率的影響Fig.2 Effects of different diluents and dilution times on inhibition rates

使用生理鹽水和蒸餾水3倍稀釋后抑制率可分別達(dá)46.78%和47.84%，與龐紅金[11]、唐朝忠等[15]試驗(yàn)結(jié)果相似，由圖2可知，生理鹽水作為稀釋劑效果更好。其原因可能是鹽溶作用促進(jìn)SOD在水中的溶解，或與酶活性中心的金屬離子發(fā)生拮抗作用[18]，由圖3可知，對(duì)3倍稀釋樣品SOD相對(duì)酶活力計(jì)算，在測(cè)定新鮮蜂王漿SOD活性時(shí)采用生理鹽水3倍稀釋最佳。

圖3 稀釋3倍樣品中SOD相對(duì)活性Fig.3 Relative activity of SOD in samples diluted 3 times

2.3 離心對(duì)測(cè)定SOD活性的影響

在預(yù)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)離心后上清液中可能有干擾酶活測(cè)定的顆粒物質(zhì)，故嘗試提高離心轉(zhuǎn)速或增加離心次數(shù)以除去干擾物質(zhì)，測(cè)定轉(zhuǎn)速或離心次數(shù)對(duì)SOD活性的影響，結(jié)果分別見(jiàn)圖4a和圖4b。

圖4 離心對(duì)測(cè)定SOD活性的影響Fig.4 Effect of centrifugation on the determination of SOD activity

由圖4a可知，12 000 r/min離心后SOD相對(duì)酶活力降低，可能是因?yàn)镾OD離心損失所致，于是仍然維持原有6 000 r/min的轉(zhuǎn)速，將離心后的上清液在相同條件下重復(fù)離心1次，測(cè)定離心次數(shù)對(duì)SOD活性的影響。由圖4b可知，離心1次相對(duì)酶活力僅為88.14%，離心2次相對(duì)酶活力明顯提高，說(shuō)明該條件下檢測(cè)靈敏度更高，故在后續(xù)試驗(yàn)中將蜂王漿在6 000 r/min下離心2次后測(cè)定酶活。

2.4 不同溫度下存放時(shí)間對(duì)蜂王漿SOD活性的影響

酶是生物活性物質(zhì)，不同貯存條件會(huì)影響其活性，本試驗(yàn)探究蜂王漿在不同溫度下貯存不同時(shí)間后SOD活性的變化，結(jié)果見(jiàn)圖5a和圖5b。

圖5 存放時(shí)間對(duì)蜂王漿SOD活性的影響Fig.5 Effect of storage time on SOD activity of royal jelly

由圖5 a和圖5 b可知，不同蜂王漿隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD的活性逐步降低，且純品蜂王漿中SOD的相對(duì)酶活比粗品中失活更快。在4℃下貯存時(shí)，貯存時(shí)間8 d時(shí)，純品槐花蜂王漿中SOD的相對(duì)酶活力接近于0%；在25℃下貯存時(shí)，相對(duì)酶活力在2 d內(nèi)急劇下降；貯存時(shí)間4 d時(shí)，純品槐花蜂王漿中SOD的相對(duì)酶活接近于0%。有報(bào)道蜂王漿中SOD活性隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且貯存溫度越高失活越快[11，13，15，19-20]。與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

2.5 不同蜜源對(duì)蜂王漿SOD活性的影響

蜂王漿中的多種生物活性成分大部分來(lái)源于蜜蜂食物中的蛋白質(zhì)，因此，王漿的質(zhì)量和生物活性成分受蜜源的影響非常顯著[21]?？疾觳煌墼磳?duì)SOD活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同蜜源對(duì)蜂王漿SOD活性的影響Fig.6 Effect of different honey plant on the SOD enzyme activity of royal jelly

由圖6可知，飼喂荊花蜜蜂所產(chǎn)蜂王漿SOD活性最高，與其它蜜源蜂王漿SOD活性有顯著差異（P≤0.05），而飼喂椴樹(shù)花或槐花蜜蜂所產(chǎn)蜂王漿中SOD活性無(wú)明顯差異。由于本研究蜂王漿均為北京金王健康科技有限公司提供，樣品有限且產(chǎn)地單一，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大蜂王漿樣品產(chǎn)地范圍和數(shù)量，以排除其它潛在因素對(duì)SOD活性的影響。

2.6 不同生產(chǎn)工藝對(duì)蜂王漿SOD活性的影響

鮮蜂王漿容易受外界光、熱等因素的影響[22]，因此加工生產(chǎn)工藝會(huì)對(duì)SOD活性產(chǎn)生較大影響。對(duì)正常工藝（普通）、全鏈條低溫保存及速凍工藝（速凍）和過(guò)度加工（加工）3種工藝條件下生產(chǎn)的純品槐花蜂王漿中SOD活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同生產(chǎn)工藝對(duì)蜂王漿SOD活性的影響Fig.7 Effect of different production processes on the SOD enzyme activity of royal jelly

由圖7可知，速凍工藝與正常工藝生產(chǎn)的蜂王漿中SOD活性有顯著差異（p≤0.01），與過(guò)度加工工藝生產(chǎn)的蜂王漿中SOD活性有高度顯著差異（p≤0.01），而正常工藝和過(guò)度加工工藝生產(chǎn)的蜂王漿中SOD活性無(wú)明顯差異，使用速凍工藝生產(chǎn)的蜂王漿中SOD活性最高。這說(shuō)明蜂王漿中SOD在加工過(guò)程中易失活，而冷凍可以抑制其失活，如果條件允許，采漿后迅速冷凍可以有效保持蜂王漿中SOD活性。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)優(yōu)化了黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）檢測(cè)蜂王漿中SOD活性時(shí)的預(yù)處理方法，為使用生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行3倍稀釋?zhuān)?℃下以6 000 r/min對(duì)樣品2次離心，單次離心20 min。采用該方法，測(cè)定蜂王漿在不同貯存時(shí)間和溫度下SOD活性變化，隨著貯存時(shí)間的增長(zhǎng)，貯存溫度的上升，蜂王漿中SOD活性有非常明顯的降低。速凍生產(chǎn)工藝能最大程度保持蜂王漿中SOD活性，荊花蜜源的蜂王漿SOD活性最高。

本試驗(yàn)首次優(yōu)化了蜂王漿樣品的預(yù)處理方法，提高了試劑盒法檢測(cè)蜂王漿SOD活性的靈敏度，這對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)SOD活性至關(guān)重要。采用本研究?jī)?yōu)化的方法，驗(yàn)證了前人的研究成果，證明SOD在蜂王漿貯存過(guò)程中極易失活；加工方法和蜜源會(huì)影響蜂王漿中SOD活性。事實(shí)上，其它諸如蜂王漿產(chǎn)地和蜂種等因素也會(huì)影響蜂王漿中的SOD活性，這將在以后繼續(xù)研究。蜂王漿在25℃下貯存6 d后SOD已經(jīng)基本失活，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23-25]，很多生理功能在如此短的貯存時(shí)間內(nèi)并未失活，因此，SOD指標(biāo)只適合在其完全失活前評(píng)價(jià)同種蜂王漿新鮮度。