抑制長非編碼RNA 配對盒8 反義RNA 1 對心肌缺血再灌注細胞氧化應激和細胞凋亡水平的影響

朱新華，侯靜雯，劉蓓蓓，許慧娟，李秋影，張曉陽

（新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院老年病科，烏魯木齊 830000）

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfu?sion，MI/R）損傷是由于心肌長時間缺血，當恢復供血后造成冠狀動脈血流量下降，心臟收縮功能降低，血管反應性改變，進而造成嚴重的再灌注損傷和心肌功能障礙［1］。長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種內源性的細胞RNA，其長度在200 nt 到100 kb 之間，已有研究發(fā)現lncRNAs 在許多心血管疾病中發(fā)揮重要作用［2-3］。配對盒8（PAX8）是一種編碼胚胎發(fā)育過程中細胞生長和分化所需的轉錄因子，其異常表達已在多種類型的腫瘤中檢測到。PAX8 反義RNA 1（PAX8-AS1）是PAX8 的一個潛在調節(jié)因子，有研究發(fā)現PAX8-AS1 可能是宮頸癌的新型易感標記［4］。然而，目前關于PAX8-AS1表達對MI/R損傷的影響研究較少，因此，本研究探討抑制lncRNA PAX8-AS1 對MI/R損傷的保護作用，為臨床治療MI/R 提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要試劑

H9c2 心肌細胞、叔丁基過氧化氫（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）購自美國Sigma 公司；Trizol、Lipofectamin 2000 購自美國Invitrogen 公 司；si-PAX8-AS1 及對應siRNA 對照購自廣州市銳博生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosor?bent assay，ELISA）試劑盒、超氧化物歧化酶（su?peroxide dismutase，SOD）ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（TBA 法）購自北京百奧萊博科技有限公司；B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔單克隆抗體、Bcl-2 相關X 蛋白質（Bcl-2 associated X protein，Bax）兔單克隆抗體、β 肌動蛋白（β-actin）兔單克隆抗體購自美國Abcam 公司；山羊抗兔二抗購自美國LI-COR 公司。

1.2 細胞模型建立及分組

以H9c2心肌細胞為研究對象，將細胞分為4組：空白對照組、MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組。采用TBHP 構建MI/R 損傷細胞模型［5］：將細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的細胞（1×105個/孔）接種至6 孔板中，加入500 μL TBHP（100 μmol/L），培養(yǎng)12 h，模擬缺氧環(huán)境；培養(yǎng)后用DMEM 高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，進行再灌注。si-con 組：在MI/R 模型建立后培養(yǎng)24 h，采用轉染試劑脂質體Lipofectamin 2000 轉染si-con（5 nmol/L）；si-PAX8-AS1 組：在MI/R 模型建立后培養(yǎng)24 h，采用轉染試劑脂質體Lipofectamin 2000轉染si-PAX8-AS1（5 nmol/L）；轉染后5 h 更換新的DMEM 高糖培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗?？瞻讓φ战M：細胞不做處理。

1.3 qRT-PCR 檢測各組心肌細胞PAX8-AS1 的表達水平

取各組細胞分別加入1 mL Trizol，冰上靜置5 min，加入200 μL 氯仿上下混勻冰上靜置15 min，4 ℃條件下12 000 rpm 離心15 min。吸取上層清液至新的離心管中加入500 μL 異丙醇，混勻后冰上靜置20 min，4℃條件下12 000 rpm 離心10 min，棄去上清液加入1 mL 75%無水乙醇，4℃條件下12 000 rpm 離心5 min，棄去上清液，室溫靜置5 min至離心管干燥，加入DEPC 水溶解沉淀后檢測RNA的濃度和純度，并按照反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA 反轉成cDNA，取1 μL cDNA 作為模板進行實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴增。反應條件：預變性95℃5 min，95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，40 個循環(huán)后72℃延伸10 min。每個樣本重復檢測3 次。以GAPDH 為內參，每組基因的相對表達量按公式（2-△△Ct法）計算。引物設計見表1。

表1 qRT-PCR 檢測基因引物序列

1.4 檢測各組細胞MDA、SOD 和GSH-PX 濃度

收集各組對數生長期心肌細胞H9c2，加磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，進行超聲破碎。1 500 rpm 離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作步驟檢測各組細胞MDA、SOD 和GSH-PX 濃度。

1.5 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率

各組細胞按1×105個/孔接種于6 孔板，加磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2 次，加入0.25%胰蛋白酶進行消化，加入500 μL 心肌細胞培養(yǎng)液，1 000 rpm 離心5 min，棄上清液。加入300 μL Binding Buffer 重懸細胞，再加入5 μL Annexin V 和PI，輕輕混勻，室溫避光反應10 min，流式細胞儀檢測細胞熒光強度。

1.6 Western blot檢測各組細胞Bax、Bcl-2蛋白表達

收集各組對數生長期細胞棄培養(yǎng)基，用冰磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3 次，加入RIPA 裂解液，充分裂解后12 000 rpm 離心30 min，取上清并對蛋白進行定量。取40 μg蛋白與上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min 后通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，90 V 電壓轉膜至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入Bax、Bcl-2 一抗4℃過夜，加入二抗孵育2 h，用化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β-actin 為內參，每組實驗重復3 次。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，PAX8-AS1 mRNA 表達水平、MDA、SOD 和GSH-Px濃度和Bax、Bcl-2 蛋白表達結果用（）表示，采用單因素方差分析比較多組間差異，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。細胞凋亡率用［n（%）］表示，采用卡方（χ2）檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組H9c2 細胞PAX8-AS1 mRNA 表達水平比較

空白對照組、MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1組H9c2 細胞PAX8-AS1 mRNA 表達水平分別為1.00±0.06、2.59±0.04、2.63±0.08、1.41±0.03。單因素方差分析結果顯示，與空白對照組相比，MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組PAX8-AS1 mRNA 表達水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=687.811，P＜0.05）；進一步組間兩兩比較結果顯示，與si-con組相比，si-PAX8-AS1 組H9c2 細胞PAX8-AS1 mRNA 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（LSD-t=27.281，P＜0.05），見圖1。

圖1 各組細胞PAX8-AS1 mRNA 表達水平比較（n=3）

2.2 各組H9c2細胞MDA，SOD和GSH-PX濃度比較

單因素方差分析結果顯示，與空白對照組相比，MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組H9c2 細胞MDA 濃度顯著升高，SOD 和GSH-Px 濃度均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；進一步組間兩兩比較結果顯示，與si-con 組比較，si-PAX8-AS1組H9c2 細胞MDA 濃度降低，SOD 和GSH-Px 濃度均升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組H9c2細胞MDA，SOD和GSH-PX的濃度比較［n=3，］

表1 各組H9c2細胞MDA，SOD和GSH-PX的濃度比較［n=3，］

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與si-con 組比較，1）*P＜0.05

2.3 各組H9c2 細胞凋亡率比較

單因素方差分析結果顯示，與空白對照組（5.88%±0.88%）相比，MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組H9c2 細胞凋亡率（22.41%±1.11%、21.71%±1.12%、11.20%±1.60%）顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=135.784，P＜0.05）；進一步組間兩兩比較結果顯示，與si-con 組相比，抑制PAX8-AS1 表達后，H9c2 細胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（LSD-t=10.680，均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組H9c2 細胞凋亡率流式細胞圖比較（n=3）

2.4 各組H9c2 細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達比較

單因素方差分析結果顯示，與空白對照組（0.20±0.02、1.41±0.07）相比，MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組H9c2 細胞Bax 蛋白表達（1.21±0.06、1.19±0.06、0.90±0.06）顯著升高，（F蛋白=281.403，P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達（0.35±0.03、0.33±0.04、1.00±0.06）顯著降低（F蛋白=325.397，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；進一步組間兩兩比較結果顯示，抑制PAX8-AS1 表達后H9c2 細胞Bax 蛋白表達降低（LSD-t蛋白=7.158，P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表達升高（LSD-t蛋白=16.223，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3 各組H9c2 細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達比較（n=3）

3 討論

細胞內氧化還原狀態(tài)調節(jié)著細胞功能的各個方面，有研究發(fā)現，MI/R 損傷細胞模型中MDA 濃度升高，SOD、GSH-Px降低［6］。因此，減少氧化應激是改善心肌MI/R損傷的關鍵治療策略。Zhang等［7］研究發(fā)現，厚樸酚減少了心肌的氧化損傷和細胞凋亡，從而改善了核因子E2 相關因子2 信號依賴途徑中MI/R 損傷。Kosuru 等［8］研究發(fā)現，紫檀可通過激活糖尿病大鼠體內二磷酸腺苷（AMP）依賴的蛋白激酶信號通路抑制心臟氧化應激和細胞凋亡，減輕心肌MI/R 損傷。

近年來，越來越多的研究表明，氧化應激與lncRNA 具有緊密的聯系，lncRNA 被認為是涉及氧化應激、炎癥等過程的重要因子。PAX蛋白在胚胎發(fā)育過程中的器官發(fā)生中起著轉錄因子的作用，調節(jié)細胞增殖和自我更新，抵抗凋亡，調控胚胎前體細胞遷移以及特定分化程序［9-10］。本研究構建MI/R損傷細胞模型后轉染si-PAX8-AS1構建PAX8-AS1表達抑制模型，結果發(fā)現與空白對照組相比，MI/R組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組PAX8-AS1 mRNA 表達水平均顯著升高；與si-con組相比，si-PAX8-AS1組PAX8-AS1 mRNA 表達水平顯著降低，提示本研究成功轉染si-PAX8-AS1。此外，MI/R 組MDA 濃度顯著升高，SOD 和GSH-Px 濃度與空白對照組相比降低；抑制PAX8-AS1表達后細胞中MDA濃度降低，SOD 和GSH-Px 濃度均升高，提示降低PAX8-AS1 表達可抑制MI/R 損傷細胞氧化應激水平。

細胞凋亡是缺血性心肌細胞損傷的重要指標，可反映心肌組織的情況，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。有研究表明，氧化應激和MI/R 損傷不僅導致心肌壞死，而且誘導心肌細胞凋亡［11］。本研究采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平，與空白對照組相比，MI/R 組、si-con 組心肌細胞凋亡率顯著升高；與si-con 組相比，抑制PAX8-AS1 表達后，心肌細胞凋亡率顯著降低；此外，MI/R 組、si-con 組、si-PAX8-AS1 組Bax 蛋白表達均顯著高于空白對照組，而Bcl-2 蛋白表達均顯著降低；抑制PAX8-AS1 表達后，Bax 蛋白表達均降低，而Bcl-2 蛋白表達均升高，提示抑制PAX8-AS1 表達后可降低MI/R 損傷細胞凋亡率。

綜上所述，抑制PAX8-AS1 表達后可抑制MI/R 損傷細胞氧化應激水平并降低細胞凋亡率，為臨床治療MI/R 提供新思路。