白細(xì)胞介素-33對心力衰竭小鼠趨化因子2/趨化因子2受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)及心肌纖維化的影響△

李金賢，莫 煊，程新春，謝 榮

［1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院心理（精神）科，廣州 510700；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830000］

心力衰竭為多種心血管疾病的終末期階段，具有較高發(fā)病率和病死率［1-2］。心力衰竭可由多種原因引起，發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)激、纖維化等導(dǎo)致的心室重構(gòu)在心力衰竭過程中起到重要作用［3-4］。趨化因子2（chemokine 2，CCL2）又稱為單核細(xì)胞趨化因子，可識別趨化因子2 受體（CCL2 receptor，CCR2），刺激單核/巨噬細(xì)胞、活性T 細(xì)胞等炎性細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)［5-7］。大量研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)與機(jī)體纖維化呈正相關(guān)，隨著小鼠肺纖維化的發(fā)展，小鼠肺組織中炎癥反應(yīng)也增強(qiáng)［8］。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-33 為細(xì)胞因子IL-1 家族的新成員，是一種生物力學(xué)誘導(dǎo)蛋白，主要由心臟成纖維細(xì)胞合成［9］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33 可阻斷心肌纖維化，保護(hù)心臟組織，減輕心力衰竭［10-11］。然而CCL2/CCR2 通路在IL-33 治療心力衰竭過程中是否發(fā)揮作用，仍需進(jìn)一步研究。本研究通過構(gòu)建小鼠心力衰竭模型，采用重組IL-33 和IL-33 抑制劑處理，探究IL-33 對心力衰竭小鼠的影響以及對CCL2/CCR2 通路的影響，為心力衰竭臨床治療提供新的思路。

1 材料及方法

1.1 動 物

BALB/c 小鼠，雌雄兼有，體質(zhì)量18～20 g，購自北京北生研生物制品有限公司，許可證號：SYXK（京）2016-0051。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由采食飲水。

1.2 主要試劑

蘇木素伊紅（Hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（貨號：G1120）、Masson 染色試劑盒（貨號：G1340）、小鼠鼠重組IL-33（貨號：P00159）均購自北京索萊寶科技有限公司。IL-33 抗體（貨號：ab207737）購自英國Abcam 公司。CD4 抗體（貨號F1773），CD25 抗體（貨號：FCMAB189F）購自美國Sigma-Aldrich 公司。CCL2（貨號：14-7096-81）、CCR2（貨號：PA5-23037）一抗及二抗（貨號：31460），均購自美國Thermo Fisher公司。GADPH一抗（51332）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司，動物彩色多普勒超聲檢測儀購自上海麥本醫(yī)療科技有限公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司，蛋白電泳儀購自北京凱元信瑞儀器有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 心力衰竭小鼠動物模型制備 參考參考文獻(xiàn)［12］，采用冠狀動脈結(jié)扎法建立小鼠心力衰竭模型。用1.0%戊巴比妥鈉按1 mL/kg 劑量腹腔注射，將小鼠麻醉，常規(guī)消毒，連接心電圖，氣管插管，連接至小動物呼吸機(jī)，輔助通氣。經(jīng)左側(cè)剪開皮膚，于3～4 肋間鈍性分離肌肉組織，露出心臟，在左冠狀動脈前降支1～2 mm處結(jié)扎。當(dāng)心電圖顯示ST 段持續(xù)升高，左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜45%，表明造模成功。然后迅速將小鼠心臟放回胸腔，消毒縫合。假手術(shù)組只打開胸腔，露出心臟，不結(jié)扎冠狀動脈。

1.4.2 動物分組 按照隨機(jī)分組，將小鼠分成假手術(shù)組、模型組、IL-33 組和IL-33 抑制劑組，每組12 只。造模前1 h，IL-33 組尾靜脈注射400 μg/mL重組IL-33 5 μL，IL-33 抑制劑組注射400 μg/mL IL-33 抑制劑12.5 μL，假手術(shù)組和模型組注入5μL 磷酸鹽緩沖液。

1.4.3 各組小鼠心功能指標(biāo)檢測及樣本采集 造模24 h 后，將小鼠麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺，采用多普勒超聲心電圖進(jìn)行超聲觀察，并計算小鼠心臟收縮末期左心室內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs），舒張末期左心室內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricu?lar fractional shortening，LVFS）變化。

檢測完成后，各組小鼠摘眼球取血，肝素抗凝，用于后續(xù)流式細(xì)胞檢測。每組小鼠隨機(jī)選取6 只，取心臟組織置于甲醛中固定，取另外6 只小鼠心臟于液氮中速凍，置于-80℃中保存。

1.4.4 流式細(xì)胞檢測免疫功能指標(biāo) 取1.4.3 制備的抗凝血，加入表面標(biāo)記抗體CD4 和CD25 混合液，避光孵育加溶血素，900 rmp/min 離心10 min，棄上清，加磷酸鹽緩沖液清洗，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106個細(xì)胞/mL，使用流式細(xì)胞儀檢測。其中CD4+CD25+標(biāo)記的為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T regulatory cell，Treg cell）。

1.4.5 蘇木素伊紅染色觀察各組小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)變化 取出甲醛固定的心臟組織，脫水、透明，石蠟包埋，切片，使用HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠的心臟組織病理變化。

1.4.6 Masson 染色觀察并檢測膠原容積分?jǐn)?shù) 取病理組織切片，根據(jù)Masson 染色試劑盒進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并計算膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。Masson 染色后，心肌組織為紫紅色，膠原纖維被染為藍(lán)色，CVF=膠原纖維面積/切片面積×100%。

1.4.7 Western blot 法檢測小鼠心臟組織蛋白水平變化 取-80℃中保存的心臟組織，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，液氮研磨，提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取20 mg 蛋白上樣十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與CCL2、CCR2、GAPDH 一抗孵育，在4℃下過夜，然后洗膜，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。曝光顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量，以GAPDH 為內(nèi)參蛋白。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞介素-33 對小鼠心功能指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠LVIDs 和LVIDd顯著升高（P＜0.05），LVEF 和LVFS 顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，IL-33組LVIDs和LVIDd顯著降低（P＜0.05），LVEF 和LVFS 顯著升高（P＜0.05），IL-33 抑制劑組LVIDs 和LVIDd 顯著升高（P＜0.05），LVEF 和LVFS 顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較 ［］

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較 ［］

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，1）*P＜0.05

2.2 白細(xì)胞介素-33 對小鼠外周血中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞百分比的影響

與假手術(shù)組相比，模型組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，IL-33組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05），IL-33 抑制劑組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

表2 各組小鼠外周血中Treg 細(xì)胞水平比較 ［］

表2 各組小鼠外周血中Treg 細(xì)胞水平比較 ［］

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，1）*P＜0.05

2.3 白細(xì)胞介素-33 對小鼠心臟組織病理變化的影響

HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心臟組織正常，心肌細(xì)胞排列整齊，肌纖維完整，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大變性，排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，間隙增大，出現(xiàn)壞死及纖維化，有大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，IL-33 組小鼠心臟組織病變程度減輕，炎性浸潤程度降低；IL-33 抑制劑組小鼠心臟組織病變程度更加嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤程度升高，見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織HE 染色結(jié)果（×200）（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：IL-33 組；D：IL-33 抑制劑組）

2.4 白細(xì)胞介素-33 對小鼠心臟組織纖維化及膠原容積分?jǐn)?shù)的影響

Masson 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織正常，幾乎無纖維化。模型組小鼠心肌纖維斷裂，可見大量膠原纖維沉積。與模型組相比，IL-33 組小鼠心肌組織中膠原纖維沉積減少；IL-33 抑制劑組小鼠心肌組織膠原纖維沉積增加，見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織Masson 染色結(jié)果（×200）（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：IL-33 組；D：IL-33 抑制劑組）

與假手術(shù)相比，模型組小鼠心肌組織CVF 顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，IL-33 抑制劑組小鼠心肌組織CVF 顯著升高（P＜0.05），IL-33 組小鼠心肌組織CVF 顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠心臟組織CVF 比較 ［］

表3 各組小鼠心臟組織CVF 比較 ［］

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，1）*P＜0.05

2.5 白細(xì)胞介素-33 對小鼠心臟組織CCL2、CCR2蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠CCL2 和CCR2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，IL-33 組CCL2 和CCR2 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），IL-33 抑制劑組CCL2 和CCR2 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 小鼠心臟組織蛋白western blot 檢測結(jié)果（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：IL-33 組；D：IL-33 抑制劑組）

3 討論

心力衰竭是心臟結(jié)構(gòu)、功能、節(jié)律或傳導(dǎo)異常的結(jié)果，主要是由心肌梗死（收縮功能障礙）、原發(fā)性高血壓（高血壓）（舒張功能障礙和收縮功能障礙）引起，或者兩者兼而有之［13］。心室重構(gòu)會引起心排血量不足、心肌舒張和收縮功能障礙、血液循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生淤血等具體臨床特征，心肌代謝、心臟收縮舒張功能、心臟負(fù)荷、耗氧量、血管擴(kuò)張等指標(biāo)對分析心功能損傷的程度具有關(guān)鍵作用［1］。心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化是心力衰竭常見的病理生理過程，研究發(fā)現(xiàn)，抑制心肌纖維化能有效改善心力衰竭小鼠心功能［14］。本研究采用冠狀動脈結(jié)扎法建立小鼠心力衰竭模型，結(jié)果顯示小鼠心肌細(xì)胞肥大變性，排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，間隙增大，出現(xiàn)壞死及纖維化，有大量炎性細(xì)胞浸潤，LVIDs、LVIDd 和CVF 升高，LVEF、LVFS 降低，表明心力衰竭小鼠心肌組織纖維化，造成心臟功能障礙，說明模型建立成功。Treg 細(xì)胞可分泌IL-10等抗炎性細(xì)胞因子，抑制對自身和非自身抗原的異常或過度免疫反應(yīng)［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液可改善慢性心力衰竭患者心功能，可能與提高Treg 細(xì)胞比例有關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭小鼠外周血中Treg 細(xì)胞百分比顯著降低，表明心力衰竭小鼠免疫失衡，可能與心功能受損有關(guān)。

纖維化是長期存在的心肌負(fù)荷過重的標(biāo)志，心肌纖維化與心肌細(xì)胞病理生理之間的關(guān)系尚不完全清楚。IL-33/ST2 信號通路在自身免疫性疾病過程中，對心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化具有抑制作用［17］。本研究中分別注射重組IL-33 和IL-33抑制劑，結(jié)果顯示，與模型組相比，IL-33 組小鼠心肌組織病變程度減輕，膠原纖維沉積減少，LVIDs、LVIDd 和CVF 顯著降低，LVEF、LVFS 和Treg 細(xì)胞百分比顯著升高；IL-33 抑制劑組小鼠心肌組織病變程度更加嚴(yán)重，纖維化及壞死面積增大，LVIDs、LVIDd 和CVF 顯著升高，LVEF、LVFS 和Treg 細(xì)胞百分比顯著降低，表明IL-33 可減輕心肌組織纖維化及其他損傷，改善心功能，可能與提高Treg 細(xì)胞百分比有關(guān)。

CCL2 是一種具有廣泛生物學(xué)活性的低分子蛋白質(zhì)，CCR2 是CCL2 的主要受體，CCL2 與CCR2相互作用［18］。在肝纖維化中，CCR2 缺失，可明顯減輕CCL4 誘導(dǎo)的纖維化程度，說明CCR2 可參與肝纖維進(jìn)程［19］。Bajpai 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，心肌損傷后，CCR2/CCL2 表達(dá)量顯著升高。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠心臟組織中CCL2、CCR2 蛋白水平顯著升高，表明心力衰竭小鼠心臟組織CCL2、CCR2 處于活化狀態(tài)，可能與心肌纖維化及心功能受損有關(guān)。在肝硬化/肝纖維化中，IL-33 可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生微蛋白，降低CCR2/CCL2 表達(dá)，防治肝損傷和纖維化［21］。本研究中，心力衰竭小鼠經(jīng)IL-33和IL-33 抑制劑處理后，IL-33 組小鼠心臟組織CCL2 和CCR2 蛋白水平顯著降低，IL-33 抑制劑組CCL2 和CCR2 蛋白水平顯著升高，表明IL-33 刺激可抑制心力衰竭小鼠心臟組織中CCL2/CCR2 通路活化，減輕纖維化程度。

綜上所述，IL-33 可能通過抑制CCL2/CCR2 通路，減輕心力衰竭小鼠心肌組織纖維化，保護(hù)心功能，為研究心力衰竭作用機(jī)制提供了新思路，但目前IL-33 在心力衰竭過程中的作用尚不十分明確，具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。