二草清肝湯抑制LPS引起肝損傷的TLR4及其下游信號(hào)分子表達(dá)*

萬(wàn) 苗 歐陽(yáng)欽 吳春明 劉三海 趙安靜

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院 浙江 溫州 325000

已故浙南地區(qū)名老中醫(yī)任俠民先生以溫州地道藥材——雞骨柴和平地木，創(chuàng)立“雞平合劑”[1]，臨床證實(shí)對(duì)急性肝衰竭（ALF）有一定的療效；結(jié)合《內(nèi)經(jīng)》《傷寒論》有關(guān)“黃疸”論述，以“濕蘊(yùn)熱郁、不得越發(fā)”為病機(jī)，創(chuàng)制二草清肝和劑（ercao qinggan decoction，EQD），臨床研究證實(shí)EQD能降低免疫性肝損害大鼠的肝損傷，其機(jī)制與肝細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體4（TLR4）及其下游信號(hào)分子受抑制不無(wú)關(guān)系[2，3]。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建ALF模型，從分子和細(xì)胞水平研究TLR4通路中相關(guān)信號(hào)分子在肝損傷及肝損傷修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)水平，探討EQD對(duì)該通路的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：雌性小鼠21只，BALB/C型，SPF級(jí)，體重18～20g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，遵倫理要求進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物：雞骨草、垂盆草、茵陳各15g，制大黃3g，茯苓、澤瀉、蒼術(shù)各10g，陳皮、甘草各6g，以上中藥均來(lái)自溫州永安堂中藥飲片公司，按常規(guī)劑量使用，水煎2次后藥液合并、過(guò)濾并濃縮，兩種濃度生藥含量分別為3.3g/ml、6.6g/ml。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分4組：EQD小劑量組（n=6），EQD大劑量組（n=5），空白對(duì)照組（n=3），內(nèi)毒素模型組（n=7），適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.4 模型驗(yàn)證：取6只正常BALB/C小鼠隨機(jī)分成內(nèi)毒素脂多糖（LPS）高（15mg/kg）、中（10mg/kg）、低(5mg/kg)劑量組，每組2只，另外取1只作為空白對(duì)照組。高中低劑量組依次按1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml劑量的LPS聯(lián)合80mg/ml D-氨基半乳糖（D-GalN）的混合藥液（1ml/100g）進(jìn)行腹腔注射，觀察24h。結(jié)果，高劑量組小鼠全部死亡，中劑量組小鼠死亡1只，中劑量組存活1只和低劑量組的2只均狀態(tài)不佳。存活小鼠處死后取出肝臟稱重，HE染色觀察病理改變。HE結(jié)果顯示LPS中劑量組模型成功，LPS低劑量組1只成模1只未成模。根據(jù)模型驗(yàn)證的結(jié)果選用LPS10mg/kg和7.5mg/kg兩個(gè)劑量做毒性實(shí)驗(yàn)，前述劑量造模死亡率達(dá)80%，后述劑量造模死亡率是14%，故選用7.5mg/kg的LPS劑量造模。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法：①EQD高、低劑量組分別予生藥含量6.6g/ml、3.3g/ml的EQD溶液每只3ml/kg灌胃，每日1次，連續(xù)12天；②空白對(duì)照組和內(nèi)毒素模型組給予每只3ml/kg的生理鹽水灌胃12天，每日1次；③末次灌胃4h后，除空白對(duì)照組外，其余所有小鼠均腹腔注射LPS和D-GalN混合液進(jìn)行造模。④造模24h后處死所有小鼠，并剖取肝標(biāo)本稱重，加入10%福爾馬林液固定組織。

1.6 HE染色：取組織流水沖洗，乙醇脫水3次，進(jìn)行石蠟滲透包埋，顯微切片組織處理、溫水浴，然后脫膠、水化。蘇木素染色3min，鹽酸乙醇分化液進(jìn)行可選區(qū)分化15s，稍水洗，將玻片暴露在pH值為堿性的發(fā)藍(lán)溶液中返藍(lán)15s，流水沖洗，伊紅染色3min；流水沖洗，酒精漂洗、脫水，蓋玻片封片，鏡檢。

1.7 免疫組化：切片脫蠟，水化；抗原修復(fù)應(yīng)用在檸檬酸緩沖液（pH6.0）中使用壓力鍋的熱誘導(dǎo)方法。切片放在孵育盒中，加入3% H2O2；IxPBS緩沖液（PBS）洗滌，5% BSA切片封閉；PBS中再次洗滌，一抗 TLR4（1∶200）4℃孵育過(guò)夜。PBS液洗滌，二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)（1∶100）37℃孵育30min；PBS淋洗完全后用DAB顯色劑處理載玻片，然后復(fù)染、脫水和封固。

1.8 熒光定量PCR檢測(cè)：①逆轉(zhuǎn)錄：在RNase-free的離心管中加入Total RNA 1pg-1μg、4×gDNA wiper Mix 4μl、RNase-free ddH2O 16μl配制混合液，42℃下進(jìn)行去除基因組DNA。加入5×HiScriptⅡ qRT SuperMixⅡ 4μl，移液器吹打混勻；再將離心管小心正確置入干式電加熱器中，50℃15min，而后換到85℃條件下持續(xù)5s，以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程。②組織樣品處理及RNA提?。杭羧?0mg組織樣品置于用液氮預(yù)冷的研磨器中研磨成細(xì)粉置于離心管內(nèi)，將細(xì)粉立即與1ml的TRlzon Reagent裂解緩沖液混合，標(biāo)記好冷藏于-20℃防止被降解。上述離心管內(nèi)加入氯仿(1∶1)，倒置1～2min混合均勻；然后將離心管放置4℃下，12000rpm低溫高速離心機(jī)（離心半徑9cm，離心半徑、溫度、轉(zhuǎn)數(shù)下同）離心15min，收集無(wú)色上水相層于新的預(yù)冷1.5ml RNase-Free離心管中，加入70%乙醇混勻，離心30s棄流出液；依次加入700μl RW1、500μl RW2、500μl RW2三次洗滌沉淀并均離心30s后棄流出液；冰盒上放置5min，干燥后將RNA顆粒裝入預(yù)冷的1.5ml RNase-Free離心管中，加入35μl無(wú)RNase水重新溶解，-80℃條件下保存。使用紫外分光光度儀在OD260和OD280下測(cè)定、計(jì)算數(shù)據(jù)。③熒光定量PCR：TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）的引物序列及長(zhǎng)度、產(chǎn)物長(zhǎng)度、退火溫度見表1；常規(guī)三步法反應(yīng)程序，三步法：變形95℃10s，退火30s，延伸30s，以上三步循環(huán)40次。

表1 PCR引物序列、引物長(zhǎng)度、產(chǎn)物長(zhǎng)度及退火溫度

1.9 Western Blot（WB）檢測(cè)：取50mg組織樣品，加入細(xì)胞裂解緩沖液混合，使顆粒破碎，渦旋樣品放置20s，在冰上孵化20min，保持每5min鐘旋轉(zhuǎn)一次樣品。然后在4℃下放置15min后，吸取上清液以獲得蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物，丟棄顆粒沉淀。蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物應(yīng)始終保存在冰塊上，并儲(chǔ)存在-80℃。采用試管檢測(cè)法定量檢測(cè)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸光度，用吸光度值測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；然后創(chuàng)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白濃度。配置分離膠、濃縮膠，上樣，煮沸5min蛋白變性，電泳60V壓縮蛋白（30min），80V分離蛋白（60min），剪好聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在甲醇中搖動(dòng)15s激活，ddH2O沖洗。按順序在轉(zhuǎn)印盒的黑色一側(cè)建立轉(zhuǎn)印堆棧，確保所有部件都用傳輸緩沖器完全濕潤(rùn)。通過(guò)在傳輸堆上滾動(dòng)玻璃管或吸管，確保不存在氣泡。用300mA恒流傳輸［3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、TLR4、NF-κB分別為1h30min、2h、1h30min］；在胭脂紅染色溶液中搖動(dòng)膜約30s，檢查蛋白質(zhì)是否已成功轉(zhuǎn)移到膜上，然后PBS洗滌薄膜，然后用牛奶封閉；一抗（1∶2000）溶液孵育4℃過(guò)夜，二抗（1∶2000）溶液中孵育室溫2h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用“ImageJ”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：PCR中各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量數(shù)值用SPSS 19.0進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表示為平均值±SD；組間的顯著性差異經(jīng)One-way和Two-way ANOVA分析，以P＜0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物體重和肝重：如表2示，小鼠LPS處理造模后，體重、肝重有所下降，加入EQD后體重和肝重有所上升。

表2 小鼠肝重均值多重比較分析

2.2 病理分析：空白對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整；肝竇散布有序、較寬，肝上皮細(xì)胞排列規(guī)整、呈多邊型，胞質(zhì)染色均勻，胞核清晰分明，未見明顯腫脹變性，庫(kù)普弗細(xì)胞分布均勻，未見周部大量聚集；內(nèi)毒素模型組中巨噬細(xì)胞聚集，肝小葉結(jié)構(gòu)較混亂；肝細(xì)胞脂肪沉積、水腫較前明顯加重；二草清肝湯組病變則明顯改善。

2.3 TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)PCR檢測(cè)：擴(kuò)增曲線平滑、柔順，且都在20～40個(gè)循環(huán)內(nèi)，表明PCR擴(kuò)增反應(yīng)敏感性良好，可用于定量計(jì)算；熔解曲線分析顯示，TLR4、NF-κB的Tm值分別為81℃和78℃，在熒光強(qiáng)度600以上，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫均一、峰形比較銳利，表明擴(kuò)增的特異性良好。相對(duì)于空白組，內(nèi)毒素性肝損傷模型組中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)顯著下降，加入二草清肝湯后明顯上升，以高劑量組最為明顯，具有顯著性差異，如表3、表4所示。

表3 TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量多重比較分析

表4 NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量多重比較分析

2.4 TLR4蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)：與空白組比較，內(nèi)毒素性肝損傷模型組中TLR4蛋白表達(dá)明顯較高，而二草清肝湯高、低劑量組的TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量均較模型組低，加入二草清肝湯后表達(dá)有所下降（P＜0.05），如表5所示。

表5 TLR4蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果多重比較分析

2.5 TLR4、NF-κB表達(dá)WB法檢測(cè)：內(nèi)毒素肝損傷模型組的TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)均較高，加入二草清肝湯后表達(dá)有所下降，結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見表6。

表6 TLR4、NF-κB的表達(dá)結(jié)果多重比較分析

3 討論

EQD是選用浙南地區(qū)特有的“雞骨柴”和“垂盆草”為君藥加用其他清熱解毒利濕之藥配制而成，具體方藥：雞骨草、垂盆草、蒼術(shù)、茵陳、制大黃、澤瀉、茯苓、陳皮、甘草。其中雞骨草和垂盆草屬于溫州道地藥材，其地域特色十分鮮明。溫州地域多濕熱天氣，許多嶺南中醫(yī)名家應(yīng)用地道草藥清熱利濕治療肝病，如邱健行基于嶺南濕熱論辨治慢性乙型肝炎[4]。EQD中雞骨草，性味淡微辛涼，功能清熱利濕、疏肝解郁；垂盆草，性味甘淡微酸涼，功能清熱解毒、利濕。二者共為君藥，配加茵陳、制大黃、茯苓、澤瀉、蒼術(shù)、陳皮、甘草清熱解毒、健脾滲濕，從而達(dá)到清熱利濕、解毒退黃的治療效果。

課題組前期研究顯示，TLR4和NF-κB作為TLR4通路上起始和終極因子，其蛋白表達(dá)變化反應(yīng)了TLR4通路在二草清肝湯作用下受到抑制，TLR4信號(hào)通路下游分子的產(chǎn)生亦減少，使炎癥減輕。本次結(jié)果表明，無(wú)論是在個(gè)體水平，還是在病理水平，均顯示EQD對(duì)肝損傷有抑制及促進(jìn)恢復(fù)的作用。免疫組化結(jié)果顯示，內(nèi)毒素性肝損傷模型組中TLR4蛋白表達(dá)顯著上升，加入EQD后小劑量組TLR4稍有下降，大劑量組明顯下降；而雖然此次WB檢測(cè)結(jié)果提示，LPS處理后的模型組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著上升，加入二草清肝湯后TLR4、NF-κB的表達(dá)下降，但不同處理組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著性差異；而與上述TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)先上升后在EQD作用下下調(diào)的趨勢(shì)并不相同的是，此研究PCR結(jié)果顯示，模型組中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)卻呈下降趨勢(shì)，加入二草清肝湯后其表達(dá)明顯上調(diào)，提示EQD干預(yù)作用可能是在蛋白翻譯層面，而非轉(zhuǎn)錄水平，即可能是影響了TLR4信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)。

總之，我們的研究表明，小鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)，其肝組織中TLR4、NF-κB基因在大量LPS刺激下表達(dá)程度顯著上升，而EQD能抑制肝細(xì)胞內(nèi)TLR4、NF-κB等信號(hào)分子活化，因此我們的結(jié)論是，EQD對(duì)LPS導(dǎo)致的急性肝損害具有一定的保護(hù)修復(fù)作用，其機(jī)制可能是EQD影響TLR4基因轉(zhuǎn)錄后蛋白的翻譯過(guò)程。