腫瘤微環(huán)境中免疫與基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因在肺腺癌中的預(yù)后價(jià)值

李世雄，耿華，徐美林

（1.天津醫(yī)科大學(xué)胸科臨床學(xué)院，天津 300041;2.天津市胸科醫(yī)院病理科，天津 300300）

肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌又可分為兩種主要病理亞型，即鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。在肺腺癌中，約25%的腫瘤中檢測到表皮生長因子受體（EGFR）突變和EML4-ALK重排。此外，還有一些罕見的肺癌驅(qū)動基因，如ROS1、RET、BRAF等?；诨蚪M研究和分子通路分析，靶向治療和臨床試驗(yàn)取得快速進(jìn)展[1]。近年來，免疫治療在肺癌患者中的應(yīng)用越來越廣泛。免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡1（PD-1）證明了治療效應(yīng)和安全性[2]。雖然肺腺癌患者已有多種治療方式，但患者預(yù)后仍較差。因此，迫切需要為肺腺癌患者尋找新的、有效的、更準(zhǔn)確的預(yù)后生物標(biāo)志物。

腫瘤微環(huán)境（TME）由多種成分組成，包括基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤成分、先天免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞[3]。近年來，越來越多的研究表明患者不同的腫瘤微環(huán)境特性在介導(dǎo)晚期轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和免疫治療抑制中發(fā)揮著重要作用?；|(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞是TME中的兩種非腫瘤成分[4]。TME中的免疫細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞直接作用或通過細(xì)胞因子和趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用，進(jìn)而影響腫瘤的生物學(xué)行為和治療反應(yīng)?；|(zhì)細(xì)胞是TME中的另一重要細(xì)胞，有研究表明，基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間存在著動態(tài)、雙向、復(fù)雜的關(guān)系[5]。Yoshihara等[6]通過分析TME中免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)水平，首創(chuàng)了一種名為ESTIMATE的算法來計(jì)算腫瘤患者的基質(zhì)、免疫評分，利用該評分來預(yù)測非腫瘤細(xì)胞的浸潤情況。目前已有相關(guān)報(bào)道將ESTIMATE應(yīng)用于胃癌[7]，揭示了這種基于大數(shù)據(jù)的算法的有效性。

在本研究中，筆者對肺腺癌患者臨床病理數(shù)據(jù)以及基質(zhì)和免疫評分進(jìn)行相關(guān)性分析。根據(jù)肺腺癌患者的基質(zhì)和免疫評分高低篩選出差異表達(dá)基因，對差異基因構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行富集分析。最后利用生存分析篩選出一組TME相關(guān)基因預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和預(yù)處理 501例肺腺癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)中女性患者270例（53.9%），男性患者231例（46.1%），年齡38～89歲。利用Illumina平臺分析肺腺癌RNA表達(dá)譜，所有數(shù)值均用log2轉(zhuǎn)換。使用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段（FPKM）對在TCGA數(shù)據(jù)庫中注釋的19 745個蛋白編碼基因進(jìn)行表達(dá)定量。臨床資料包括性別、年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、臨床分期、生存時(shí)間和隨訪結(jié)局。此外，丟失臨床病理信息或生存數(shù)據(jù)的樣本將被刪除。

1.2 基質(zhì)和免疫評分ESTIMATE評分系統(tǒng)包括基質(zhì)評分和免疫評分。評分基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的基因表達(dá)情況。評分可以通過在線網(wǎng)站（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease）下載。ESTIMATE算法可以通過分析腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推斷在TME中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤情況。

1.3 臨床病理特征與基質(zhì)、免疫評分之間的相關(guān)性根據(jù)臨床病理特征對患者進(jìn)行分組，分析各組基質(zhì)和免疫評分高低差異，χ2檢驗(yàn)分析基質(zhì)、免疫評分與臨床病理特征之間的相關(guān)性。用評分的中位數(shù)將這些樣本分為高基質(zhì)評分組、低基質(zhì)評分組，免疫評分同前分為兩組，采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)分析兩組總生存率的差異。

1.4 篩選差異表達(dá)基因?qū)⒎蜗侔┗颊邩颖痉譃閮山M，即高基質(zhì)（或免疫）評分組和低基質(zhì)（或免疫）評分組。以基因表達(dá)差異倍數(shù)變化>2.0和P<0.01作為篩選差異表達(dá)基因（DEGs）的臨界值。使用TBtools將DEGs顯示在熱圖上（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）[8]。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用基因相互作用檢索工具（STRING，https://string-db.org/）[9]檢索DEGs的相互作用網(wǎng)絡(luò)。并通過Cytoscape軟件（版本3.7.2）進(jìn)行基因相互作用的可視化[10]。然后使用Cytoscape的分子復(fù)合體檢測（Mcode）插件，根據(jù)拓?fù)湓韺ふ易钪匾哪K即為連接最密集的區(qū)域。選擇設(shè)置為MCODE分?jǐn)?shù)>5，度截?cái)嘀?2，節(jié)點(diǎn)截?cái)嘀?0.2，最大深度=100，k-分?jǐn)?shù)=2。

1.6 基因本體論和KEGG通路富集分析可用于基因注釋、可視化和集合探索的數(shù)據(jù)庫（DAVID v.6.8）被用來進(jìn)行基因的富集分析[11]。對基質(zhì)評分組差異基因和免疫評分組差異基因分別進(jìn)行細(xì)胞成分、分子功能、生物過程等基因本體論分析和KEGG通路的富集分析。FDR校正后的P<0.05被認(rèn)為在基因本體論分析和KEGG通路富集分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 關(guān)鍵基因的生存分析采用log-rank方法評價(jià)關(guān)鍵基因的預(yù)后價(jià)值。與肺腺癌患者總生存率顯著相關(guān)的基因被確定為預(yù)后相關(guān)基因。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均通過SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用χ2檢驗(yàn)分析基質(zhì)、免疫評分與臨床病理特征之間的相關(guān)性，采用t檢驗(yàn)和Cytoscape軟件篩選差異表達(dá)基因，Kaplan-Meier方法評價(jià)肺腺癌TME中關(guān)鍵基因的預(yù)后價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)、免疫評分與肺腺癌臨床病理特征性分析501例肺腺癌患者的基質(zhì)評分在-1 959.31~2 098.77，免疫評分分布于-1 355.85~2 905.30。如圖1A~D所示，除淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期之外，免疫評分與T分期、M分期、臨床分期顯著相關(guān)（均P<0.05）。而基質(zhì)評分與M期顯著相關(guān)（P<0.05）。肺腺癌患者根據(jù)評分分為高低兩組。如圖1E所示，在相同時(shí)間高免疫評分組總生存率較低免疫評分組更高（P=0.0093）。

圖1 基質(zhì)、免疫評分與肺腺癌患者臨床病理特征和總生存率的相關(guān)性Fig 1 Association of stromal/immune scores with clinicopathological features and overall survival rate

2.2 基于免疫、基質(zhì)評分的DEGs圖2顯示高免疫評分、基質(zhì)評分組和低免疫評分、基質(zhì)評分組之間表達(dá)水平有顯著差異的基因。與免疫低評分組相比，高評分組共出現(xiàn)257個基因表達(dá)上調(diào)，5個基因表達(dá)下調(diào)（表達(dá)差異倍數(shù)>2.0；P<0.01）。此外，與基質(zhì)低評分組相比，基質(zhì)高評分組中有392個基因表達(dá)上調(diào)，但沒有基因表達(dá)下調(diào)（表達(dá)差異倍數(shù)>2.0；P<0.01）。利用韋恩圖顯示免疫評分組和基質(zhì)評分組共有74個共同的DEGs。

圖2 肺腺癌患者基于基質(zhì)評分和免疫評分的基因表達(dá)熱圖和韋恩圖Fig 2 Heat maps and Venn diagrams of gene expression based on stromal score and immune score in lung adenocarcinoma

2.3 DEGs的功能富集分析基因本體論對基質(zhì)評分差異表達(dá)基因的分析顯示與免疫反應(yīng)有很強(qiáng)的相關(guān)性（表1）。生物過程（BP）分析主要富集于“補(bǔ)體激活”、“免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)”、“免疫反應(yīng)”等。細(xì)胞成分（CC）分析主要包括“細(xì)胞外區(qū)域”、“細(xì)胞外泌體”、“細(xì)胞膜”等。分子作用（MF）分析包括“抗原結(jié)合”、“絲氨酸型內(nèi)肽酶激活”等。

KEGG信號通路分析顯示，許多通路與免疫應(yīng)答相關(guān)（表1），包括“ECM受體相互作用”、“PI3KAkt信號通路”、“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”等。同樣，在免疫評分差異表達(dá)基因中，BP分析主要富集在“免疫反應(yīng)”、“炎癥反應(yīng)”和“多肽或多糖的抗原處理和遞呈”等。CC分析主要包括“細(xì)胞膜”、“質(zhì)膜的組成部分”、“MHCⅡ類蛋白質(zhì)復(fù)合物”等。MF分析包括“受體激活”、“受體結(jié)合”、“跨膜信號受體激活”等。KEGG通路分析確定了與“金黃色葡萄球菌感染”、“吞噬體”和“同種異體排斥反應(yīng)”相關(guān)的通路（表2）。

表1 基于基質(zhì)評分的DEGs功能富集分析Tab1 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes based on stromal scores（BPs，CCs and MFs）

表2 基于免疫評分的DEGs功能富集分析Tab 2 Functional enrichment analysis of differentially expressed genes based on immune scores（BPs，CCs and MFs）

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因圖3A顯示了基質(zhì)評分的DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，并顯示了網(wǎng)絡(luò)中排名前35位的差異基因。篩選出最值得關(guān)注的10個節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是關(guān)鍵基因，包括COL1A2、COL4A2、COL3A1、COL1A1、COL4A1、COL5A1、THBS2、BGN、DCN和POSTN。同樣，圖3B給出了基于免疫評分的DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，顯示出中排名前29位的基因表達(dá)蛋白。排在前10位的關(guān)鍵基因?yàn)镮TGB2、GSF1R、CD86、SPI1、PLEK、TYROBP、LY86、ITGAM、HCK和CTSS。

圖3 基于基質(zhì)、免疫評分差異表達(dá)基因和關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 3 PPI networks of differentially expressed genes and key genes based on stromal and immune scores

2.5 生存分析在20個基因中，共有4個DEGs顯示與OS時(shí)間顯著相關(guān)（圖4），PLEK、LY86、HCK高表達(dá)與較好的總生存率顯著相關(guān)（均P<0.05），POSTN被認(rèn)為是一個預(yù)后不良相關(guān)基因（P<0.05）。這4個基因均為上調(diào)的DEGs基因。

圖4 篩選出的4個關(guān)鍵基因在肺腺癌患者中的生存分析Fig 4 Survival analysis of four key genes screened in patients with lung adenocarcinoma

3 討論

預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后仍然是研究人員和臨床醫(yī)生面臨的挑戰(zhàn)。惡性腫瘤細(xì)胞與TME的相互作用極大地影響了腫瘤的發(fā)展，進(jìn)而影響了腫瘤的復(fù)發(fā)、耐藥和患者的總體、無進(jìn)展生存率[12]。免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤已被證實(shí)與肺腺癌患者的預(yù)后有關(guān)[13]。隨著知識、技術(shù)，甚至臨床實(shí)踐標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展，分子表達(dá)譜在過去幾年中經(jīng)歷了巨大的變化。檢測廣泛的分子表達(dá)水平對所有轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤患者都是必要的。因此，本研究嘗試從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出影響肺腺癌患者預(yù)后的免疫、基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因。本研究創(chuàng)新點(diǎn)在于，這些基因與TME中的基質(zhì)和免疫成分相關(guān)。這將有助于臨床工作者分析和預(yù)測患者的預(yù)后。

筆者通過ESTIMATE數(shù)據(jù)庫獲取肺腺癌患者基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的評分，探討該評分與肺腺癌患者的臨床病理特征和總生存期的相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著T分期、M分期和臨床分期的進(jìn)展，患者的免疫評分隨之顯著降低，但與N分期無相關(guān)性。同時(shí)，M1期肺腺癌患者的基質(zhì)評分相較M0期顯著下降，但與T分期、N分期和臨床分期無關(guān)。先前研究表明，晚期肺腺癌患者出現(xiàn)免疫細(xì)胞減少，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞[14]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，免疫評分和基質(zhì)評分與肺腺癌患者的臨床特征，包括T期、M期、病理分期和總生存時(shí)間顯著相關(guān)[15]。有較多免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞浸潤的肺腺癌患者分期較早，預(yù)后較好。此外，基于免疫、基質(zhì)評分的生存分析也顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。較低的基質(zhì)、免疫評分與肺腺癌患者較差的總生存率相關(guān)。免疫細(xì)胞的存在起到了殺死腫瘤細(xì)胞和抑制腫瘤生長的作用，因此，從理論上講，免疫評分高的患者生存期應(yīng)該會提高。筆者的研究與這一假設(shè)是一致的。

按基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的評分分為高分組和低分組，總共篩選了579個DEGs。隨后的GO分析發(fā)現(xiàn)它們大多參與免疫和炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)調(diào)控、T細(xì)胞共刺激、抗原與受體結(jié)合。這證實(shí)了免疫系統(tǒng)在肺腺癌微環(huán)境形成中的重要作用。KEGG通路分析也顯示大部分的DEGs與免疫應(yīng)答顯著相關(guān)，這與之前的報(bào)道一致。為了更好地理解DEGs之間的相互作用，筆者構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。在由基質(zhì)和免疫的差異基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，MCODE被用來選擇最重要的網(wǎng)絡(luò)模塊。本研究基于免疫評分確定了10個與免疫細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵基因，基于基質(zhì)評分確定了10個與基質(zhì)成分相關(guān)的關(guān)鍵基因。在肺腺癌患者中篩選出4個TME相關(guān)基因，結(jié)合生存分析這4個基因的表達(dá)與總生存時(shí)間顯著相關(guān)。

普列克底物蛋白（PLEK）位于人類染色體2q14，在心血管疾病、牙周炎、潰瘍性結(jié)腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中顯著過表達(dá)，表明其在慢性炎癥性疾病中具有重要作用[16]。淋巴細(xì)胞抗原（LY86），又被稱為MD1、MD-1或MMD-1，敲除LY86導(dǎo)致單核細(xì)胞向MCP-1遷移減少，這可能是念珠菌易感性增加的基礎(chǔ)。LY86缺乏在結(jié)腸炎的進(jìn)展中至關(guān)重要，因此LY86可能是未來炎癥性腸病介入治療的一個潛在靶點(diǎn)[17]。造血細(xì)胞激酶（HCK）編碼的蛋白是Src家族酪氨酸激酶的成員。它在中性粒細(xì)胞遷移和中性粒細(xì)胞脫粒中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)HCK的高表達(dá)與大腸癌患者的低生存率有關(guān)，并與活化的巨噬細(xì)胞具有相關(guān)性[18]。HCK活性的升高也在許多實(shí)體惡性腫瘤中被觀察到，包括乳腺癌和結(jié)腸癌，并與患者存活率降低相關(guān)。HCK的過度激活可能是由外周免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子刺激腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)腫瘤的活化，促進(jìn)TME的形成。骨膜蛋白（POSTN）的過表達(dá)通過促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲與胃癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[19]。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）通過負(fù)向調(diào)控miR-202-3p促進(jìn)POSTN的表達(dá)，該生物傳導(dǎo)軸與宮頸癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲以及上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控密切相關(guān)[20]。在本研究中，POSTN被確定為與肺腺癌不良預(yù)后相關(guān)的基因。而在肺腺癌患者中，PLEK、LY86和HCK的高表達(dá)預(yù)示著較好的預(yù)后。這為闡明腫瘤發(fā)展的分子機(jī)制提供依據(jù)，也對預(yù)測患者預(yù)后具有重大意義。

在患者的預(yù)后預(yù)測和個體化治療時(shí)，分子遺傳特征與臨床病理特征相結(jié)合往往發(fā)揮重要作用[21]。免疫治療促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別，刺激免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞生長增殖進(jìn)行抑制[22]。與以往關(guān)注腫瘤細(xì)胞本身內(nèi)在基因激活如何影響TME的報(bào)道相比，該研究更多關(guān)注于TME中的基因標(biāo)志物，哪些基因會影響肺腺癌的進(jìn)展，從而影響患者的預(yù)后。該研究為分析肺腺癌和其所在的TME之間復(fù)雜的相互作用提供新的思路。

這項(xiàng)研究也有一些局限性。首先，這是一項(xiàng)基于公開數(shù)據(jù)庫的回顧性研究，很難包涵不同地理人種間的差異。其次，考慮到不同腫瘤區(qū)域的微環(huán)境可能不同，在腫瘤的核心和侵襲邊緣進(jìn)行免疫和基質(zhì)評分也往往存在不同。最后，筆者的發(fā)現(xiàn)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。