基于生物信息學(xué)方法篩選散發(fā)性克雅氏病神經(jīng)炎癥相關(guān)關(guān)鍵基因

程雅靜，劉瑩，王菲

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052）

散發(fā)性克雅氏病（sporadic Creutzfeldt-Jakob disease，SCJD）是一種快速進展的具有傳染性的致命性神經(jīng)退行性疾病，其特征是大腦中朊病毒蛋白（PrP）的錯誤折疊和聚集[1]。SCJD是最常見的人類朊病毒病（約占90%的病例），發(fā)病率約為每年1.5人/百萬人~2.0人/百萬人[1]。正如許多研究對朊病毒疾病動物模型的報道一樣，神經(jīng)炎癥是神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的重要部分[2]。對朊病毒疾病模型的研究表明，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達的基因在炎癥、新陳代謝、呼吸應(yīng)激以及其他功能調(diào)節(jié)中起主要作用[3]。因此，探索神經(jīng)炎癥在SCJD中的作用機制有重大的意義。本研究旨在利用生物信息學(xué)方法篩選SCJD炎癥相關(guān)的差異基因，并進一步鑒定關(guān)鍵基因，探索SCJD發(fā)展過程中神經(jīng)炎癥的作用并為該病的診斷和治療提供新思路。

1 對象和方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取及差異表達基因的篩選通過GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫檢索“Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease”和“Neuroinflammation”，最終選擇與SCJD炎癥相關(guān)的GSE160208數(shù)據(jù)集，它由與神經(jīng)炎癥相關(guān)的800個基因在27例SCJD患者和20名正常人的腦組織中的表達數(shù)據(jù)組成。用GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）的“l(fā)imma”包篩選SCJD和正常腦組織的差異表達基因（DEGs），篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|Log2FC|>1，adj.P<0.05。用R語言的“ggplot2”包對DEGs進行可視化。若DEGs對應(yīng)的Log2FC>0，則該基因在SCJD腦組織中表達升高；若DEGs對應(yīng)的Log2FC<0，則該DEGs在SCJD腦組織中表達降低。

1.2 功能富集分析用R語言的“cluster Profiler”和“DOSE”包對SCJD的DEGs分別進行KEGG通路分析和GO富集分析，其中GO富集分析涵蓋生物學(xué)的3個方面，即生物過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）。本研究中P<0.05作為篩選條件，選取排名前十的通路探索DEGs的生物學(xué)功能。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及hub基因的篩選將DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（http://string.embl.de/），構(gòu)建DEGs蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），用Cytoscape軟件及MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析和可視化，以MCODE評分最高且節(jié)點個數(shù)最多的模塊作為PPI網(wǎng)絡(luò)的樞紐模塊，然后計算該樞紐模塊中基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)和相關(guān)性P值并鑒定SCJD的候選hub基因。

1.4 驗證候選hub基因在SCJD腦組織的表達用SCJD相關(guān)的GSE124571數(shù)據(jù)集驗證15個基因在人腦組織的RNA水平表達情況，該數(shù)據(jù)集有SCJD和對照腦組織樣本各10例。采用t檢驗和R語言的“ggplot2”包對候選hub基因的表達進行分析和可視化。

1.5 構(gòu)建候選hub基因的靶基因-轉(zhuǎn)錄因子（TF）和靶基因-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為了探究候選hub基因中與轉(zhuǎn)錄因子和miRNA在SCJD中的相互作用，筆者利用miRnet數(shù)據(jù)庫（https://www.mirnet.ca/）對14個候選hub基因進行了靶基因-轉(zhuǎn)錄因子（TF）和靶基因-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.6 繪制候選hub基因的ROC曲線鑒定關(guān)鍵基因用R語言的“pROC”和“ggplot2”包分析并可視化候選hub基因的受試者工作特征（ROC）曲線，比較候選hub基因在SCJD中的診斷效能。ROC曲線的曲線下面積（AUC）在0.5~1。AUC越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9以上時有較高準(zhǔn)確性。本研究中關(guān)鍵基因選取標(biāo)準(zhǔn)為：AUC＞0.9。最終根據(jù)候選hub基因的AUC鑒定出SCJD神經(jīng)炎癥相關(guān)的hub基因。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選用GEO2R工具來篩選SCJD患者的DEGs，得到127個DEGs，包括上調(diào)DEGs109個和下調(diào)DEGs18個。如圖1A所示，紅色表示上調(diào)DEGs，藍(lán)色表示下調(diào)DEGs，黑色表示非DEGs。運用R語言的“Complex Heatmap”包對TOP50DEGs的表達水平進行可視化（圖1B）。

圖1 差異基因的可視化分析Fig 1 Visual analysis of differentially expressed genes

2.2 功能富集分析結(jié)果為了探索DEGs的生物學(xué)功能，對127個DEGs進行KEGG通路分析后，得到的生物學(xué)信號通路為Tuberculosis（結(jié)核?。?、Osteoclast differentiation（破骨細(xì)胞分化）、Phagosome（吞噬體）、Staphylococcus aureus infection（金黃色葡萄球菌感染）、NF-kappa B signaling pathway（NF-κB信號通路）和B cell receptor signaling pathway（B細(xì)胞受體信號通路）等（圖2A）。此外，對127個DEGs進行GO分析后，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在與炎癥細(xì)胞的激活和炎癥有關(guān)的生物學(xué)功能，包括：在BP中主要富集在leukocyte proliferation（白細(xì)胞增殖）、neutrophil degranulation（中性粒細(xì)胞脫顆粒）和neutrophil activation involved in immune response（中性粒細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)）等；CC分析表明，這些基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置主要富集在secretory granule membrane（分泌顆粒膜）、endocytic vesicle（內(nèi)吞泡）和phagocytic vesicle（吞噬小泡）等；在MF分析中，這些基因主要富集在amyloid-beta binding（淀粉樣β蛋白結(jié)合）、immune receptor activity（免疫受體活性）和IgG binding（IgG結(jié)合）等的作用（圖2B）。

圖2 差異基因功能富集分析Fig 2 Functional enrichment analysis of differentiallyexpressedgenes

2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及候選hub基因的篩選如圖3A所示，該PPI網(wǎng)絡(luò)包括116個節(jié)點和727條邊。然后，用Cytotype的MCODE插件進一步分析，結(jié)果顯示在PPI網(wǎng)絡(luò)中鑒定出包括16個節(jié)點的樞紐模塊（圖3B）。計算該樞紐模塊中基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)和相關(guān)性P值后，結(jié)果提示TYROBP與其他15個基因的Pearson相關(guān)系數(shù)r＜0.5，且P＞0.05（圖3C）。因此，TYROBP不能作為該PPI網(wǎng)絡(luò)的候選hub基因，其他15個基因可作為SCJD的候選hub基因待進一步分析。

圖3 SCJD差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和篩選樞紐基因Fig 3 Protein-protein interaction network of DEGs of SCJD and screening hubgenes

2.4 候選hub基因在SCJD腦組織中的表達如圖4所示，15個候選hub基因中的14個基因（TLR2、C1QA、ITGAM、C3AR1、FCER1G、CD163、C1QB、C1QC、FCGR1A、TREM2、MSR1、CTSS、CYBB、AIF1）（圖4A~4N）在SCJD腦組織中表達上調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05，t檢驗），而FCGR3A在SCJD腦組織中的表達無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4O）。因此，這14個基因可作為SCJD的候選hub基因待進一步分析。

圖4 15個SCJD候選Hub基因在與SCJD相關(guān)的GSE124571數(shù)據(jù)集的腦組織樣本中的表達Fig 4 The expression of fifteen candidate hub genes of SCJD in brain tissue samples from GSE124571 dataset related to SCJD

2.5 候選hub基因的靶基因-TF和靶基因-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如圖5A所示，在TF靶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，有TF的靶基因是TLR2、ITGAM、CD163、FCGR1A、MSR1、CTSS和CYBB。CYBB與SPI1等8個TF相互作用；CD163與SPI1、SP1等4個TF相互作用；TLR2與SP1等3個TF相互作用。如圖5B所示，在miRNA靶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，有miRNA的靶基因是TLR2、ITGAM、C3AR1、FCER1G、C1QB、C1QC、TREM2、MSR1、CTSS、CYBB和AIF1。C3AR1和QKI均與has-mir-107和hsa-mir-16-5p相互作用；C1QB和FCER1G均與hsa-mir-124-3p相互作用。

圖5 14個hub基因的靶基因-TF和靶基因-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 5 TF-target gene and miRNA-target gene regulatory network of fourteen hub genes

2.6 hub基因的鑒定用ROC曲線的AUC值比較14個候選hub基因在SCJD中診斷效能。TLR2、C1QA、ITGAM、C3AR1對SCJD的診斷有較高的準(zhǔn)確性（AUC>0.9，圖6A~6D）；FCER1G、CD163、C1QB、C1QC、FCGR1A、TREM2、MSR1、CTSS、CYBB、AIF1對SCJD的診斷有一定的準(zhǔn)確性（0.9＞AUC>0.7，圖6E~6N）。TLR2、C1QA、ITGAM、C3AR1為SCJD的神經(jīng)炎癥過程中的hub基因。

圖6 14個SCJD樞紐基因的受試者工作特征曲線Fig 6 Receiver operating characteristic curves of fourteen hub genes of SCJD

3 討論

據(jù)有關(guān)研究報道，免疫系統(tǒng)反應(yīng)、新陳代謝、發(fā)育生物學(xué)和囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程參與了克雅氏病的發(fā)病[4]。然而，關(guān)于人類SCJD發(fā)病過程中神經(jīng)炎癥相關(guān)機制的研究報道較少，具體機制尚未清楚。因此，探究神經(jīng)炎癥在SCJD發(fā)病過程中的作用機制具有重要的意義。本研究通過生物信息學(xué)分析方法鑒定出TLR2、C1QA、ITGAM、C3AR1為SCJD神經(jīng)炎癥過程中的hub基因，為SCJD神經(jīng)炎癥發(fā)展過程中的機制研究提供了新思路。

研究報道，朊病毒感染會刺激模式識別受體（PRR）相關(guān)分子和信號通路，包括Toll樣受體（TLRs）、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）和一些細(xì)胞因子[5]。此外，在SCJD中，星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用和PrP-鐵蛋白聚集體的自噬可以保護細(xì)胞免受毒性，因此吞噬體在SCJD發(fā)病過程中對神經(jīng)元有保護作用[6]。一項研究顯示在SCJD和SCJD MM1小鼠中炎癥相關(guān)的NF-κB/IKK和JAK/STAT細(xì)胞信號通路被激活[7]。然而，在本研究中，KEGG通路分析結(jié)果提示SCJD神經(jīng)炎癥的發(fā)生與細(xì)菌和病毒的感染、吞噬體、NF-κB信號通路和B細(xì)胞受體信號通路等有關(guān)。GO分析結(jié)果提示SCJD的發(fā)生與炎癥細(xì)胞的激活和炎癥反應(yīng)有關(guān)。由此可知，細(xì)菌和病毒的感染以及相關(guān)的免疫反應(yīng)生物學(xué)過程在SCJD發(fā)展過程中有重要作用，但這些通路在SCJD中的具體機制仍需要進一步研究。

細(xì)胞膜上表達的TLR2在TLR家族的10個功能成員中占有特殊的地位，它可以檢測多種微生物物種的病原體相關(guān)分子模式（PAMP），從而能夠感知最廣泛的PAMP。一項研究報道，TLR2是Aβ觸發(fā)神經(jīng)炎癥激活的主要受體，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR2的表達對阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病有益；在AD淀粉樣前體轉(zhuǎn)基因小鼠中，TLR2的缺失能將小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型炎癥激活轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型炎癥激活，這種轉(zhuǎn)變可以改善神經(jīng)元的功能[8]；此外，TLR2在帕金森病[9]和多發(fā)性硬化[10]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有重要的作用，這些發(fā)現(xiàn)表明TLR2在神經(jīng)退行性疾病的炎癥激活過程中有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)TLR2在SCJD中表達上調(diào)，且對SCJD有較高的診斷效能，因此，TLR2可能是SCJD發(fā)病過程中神經(jīng)炎癥相關(guān)的關(guān)鍵基因。

補體蛋白C1QA是組成C1Q的重要部分，C1Q是經(jīng)典補體激活途徑的亞單位復(fù)合體C1的識別成分。研究報道，補體蛋白的表達在神經(jīng)元損傷后、衰老期間和AD等神經(jīng)退行性疾病的早期上調(diào)，隨著損傷的增加，補體蛋白的過度表達介導(dǎo)的突觸消除與神經(jīng)元變性[11]與各種衰老和神經(jīng)疾病小鼠模型的認(rèn)知喪失以及精神分裂癥等有關(guān)[12]。C1QA不僅在精神分裂癥的高炎癥患者的腦中高表達[13]，還與家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病的晚期發(fā)病有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)C1QA在SCJD患者腦組織中表達上調(diào)且對SCJD有較高的診斷效能。因此，認(rèn)為C1QA的高表達與SCJD的神經(jīng)炎癥有較大的相關(guān)性。

ITGAM（CD11b）是整聯(lián)蛋白受體CD11b/CD18的α鏈，在先天免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）的表面高度表達，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其并發(fā)癥的易感性密切相關(guān)[15]。據(jù)報道，小膠質(zhì)細(xì)胞中的CD11b對β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性至關(guān)重要，因為CD11b的敲除可顯著減弱Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活、超氧化物的產(chǎn)生和體內(nèi)、體外神經(jīng)變性[16]。ITGAM調(diào)節(jié)與缺血性腦損傷相關(guān)的分子，如纖維蛋白 原、TNF、IL6、ITGB2、NF-kB、STAT3、MAPK3和MAPK1有關(guān)，此外，ITGAM在大鼠大腦中段閉塞模型中表達上調(diào)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)ITGAM在SCJD患者的腦組織中表達上調(diào)且對SCJD有較高的診斷效能。因此，認(rèn)為ITGAM的高表達與SCJD的炎癥反應(yīng)相關(guān)，并且可能也參與了SCJD患者腦組織中神經(jīng)毒性的發(fā)生。

C3AR1是趨化和炎癥肽過敏毒素C3a的受體，位于補體系統(tǒng)的末端，調(diào)節(jié)趨化性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。C3AR1在AD的PS19小鼠模型中的缺失可減輕tau病變、神經(jīng)炎癥、突觸缺陷和神經(jīng)變性[18]，其選擇性靶向有望調(diào)節(jié)炎癥而不會對吞噬、清除（C3b）和膜攻擊復(fù)合物（C5b/MAC）等其他關(guān)鍵補體過程產(chǎn)生不利影響[19]。在tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，通過內(nèi)皮細(xì)胞增強C3a/C3aR信號通路表達會促進血管炎癥和BBB功能障礙，并導(dǎo)致小鼠衰老和神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)炎癥[20]。此外，C3AR1可作為肌萎縮側(cè)索硬化的潛在生物標(biāo)志物[21]。本研究發(fā)現(xiàn)C3AR1在SCJD患者的腦組織中表達上調(diào)且對SCJD有較高的診斷效能。盡管C3AR1與SCJD相關(guān)的報道較少，但C3AR1的上調(diào)會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)炎癥，提示C3AR1在SCJD中有重要的作用。因此，認(rèn)為C3AR1的高表達與SCJD發(fā)病過程中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)有很大的相關(guān)性，C3AR1在SCJD中的具體作用機制需要進一步研究。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)分析篩選出SCJD炎癥相關(guān)的4個hub基因，提示TLR2、C1QA、ITGAM、C3AR1可能為SCJD的早期診斷提供新思路，其作用有待進一步探究。本文為探索SCJD神經(jīng)炎癥相關(guān)發(fā)展的分子機制、診斷和治療提供了理論依據(jù)。