丹參通絡(luò)解毒湯對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子/成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)14通路的影響

王中超，何延忠，趙棟梁，周 淼

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科，河南 鄭州 450003)

肺纖維化是一種慢性肺部疾病，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)向間質(zhì)過度沉積，造成肺功能進行性損害，最終導(dǎo)致呼吸衰竭[1]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境污染、細(xì)菌感染、吸煙、胃食管瘺以及博萊霉素等藥物與肺纖維化的發(fā)病密切相關(guān)[2-3]。近年來，肺纖維化患者的病死率顯著增加，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將吡非尼酮和尼達尼布用于肺纖維化的治療，然而，吡非尼酮和尼達尼布雖然有助于穩(wěn)定患者的病情，但并不能逆轉(zhuǎn)纖維化的進展，且存在一定不良反應(yīng)，如胃腸道不適、皮疹光敏性等[4-5]。因此，有必要研究探索肺纖維化的新治療方法。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子超家族的一員，參與機體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、組織修復(fù)等；成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)14(fibroblast growth factor-inducible14，F(xiàn)n14)是TWEAK的主要受體，其通過激活下游信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能；研究顯示，TWEAK/Fn14信號通路可調(diào)控腎間質(zhì)纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及部分炎癥相關(guān)通路，而TWEAK抑制劑起到了緩解腎間質(zhì)纖維化進展的作用[6]；但目前關(guān)于TWEAK/Fn14信號通路在肺纖維化中的作用尚不清晰。丹參通絡(luò)解毒湯是在《溫病條辨》清營湯和《時方歌括》丹參飲基礎(chǔ)上結(jié)合葉天士絡(luò)病理論及臨床實踐而來的中藥方劑[7]。藥理研究證實，丹參通絡(luò)解毒湯具有調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制心肌纖維化、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的作用[8]，但其在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中的作用尚不明確,其是否可通過調(diào)控TWEAK/Fn14通路而改善肺纖維化尚不清楚。因此，本研究通過觀察丹參通絡(luò)解毒湯對肺纖維化小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)、肺組織病理、炎癥細(xì)胞因子、TWEAK/Fn14通路因子變化的影響，探討丹參通絡(luò)解毒湯對肺纖維化的作用效果及機制，旨在為肺纖維化的治療提供潛在的方法及靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡無特定病原體級C57B/L小鼠50只，體質(zhì)量20～24 g，購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號：SYXK(川)2019-189]。所有小鼠在20～24 ℃、相對濕度45%～55%、12 h/12 h明暗光周期條件下，給予普通顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器丹參通絡(luò)解毒湯(主要藥物組成：丹參15 g、玄參15 g、當(dāng)歸10 g、黃連6 g、生地黃15 g、金銀花10 g)由湖南君昊中藥飲片科貿(mào)有限公司提供，浸泡，去渣，水煎濃縮至藥液質(zhì)量濃度4 g·mL-1(含生藥)[藥材投料量(g)/藥液體積(mL)]，保存?zhèn)溆谩?,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3，純度≥99%]購自美國Sigma公司，注射用鹽酸博來霉素(國藥準(zhǔn)字H20055883)購自海正輝瑞制藥有限公司，TWEAK/Fn14受體抑制劑PDL192購自美國MedChem Express公司，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-4、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司,蘇木精染液、伊紅染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司,過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)購自上海晶天生物科技有限公司， TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，TNF-α、IL-1β、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、TWEAK、Fn14、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、母親信號蛋白同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3，Smad3)、磷酸化母親信號蛋白同源物3(phospho rylated Smad3，p-Smad3)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、酪氨酸磷酸化STAT3(tyrosine phosphorylated STAT3，p-STAT3)一抗抗體均購自英國Abcam公司，細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒購自美國Affinity公司；SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，JY200C電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠分組及肺纖維化模型制備小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、1，25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組，每組10只。建模步驟[9]：各組小鼠均禁食12 h，次日晨經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉2.5 g·L-1進行麻醉后，將小鼠仰臥固定于操作臺上，用碘球消毒頸部及其周圍皮膚，持消毒器械剝開小鼠頸部的皮膚，剝離肌肉組織暴露氣管。除空白組外，其余各組小鼠均采用一次性注射器，于甲狀軟骨下2個環(huán)狀軟骨之間的氣管軟骨環(huán)間隙進針，有突破感后緩慢水平進針，回抽未見血液等異常液體后，緩慢注入博萊霉素(3.5 mg·kg-1，溶于 0.1 mL生理鹽水)，迅速將小鼠保持直立，左右旋轉(zhuǎn)各30 s，使博萊霉素溶液均勻分布于雙肺。空白組小鼠采用一次性注射器于甲狀軟骨下2個環(huán)狀軟骨之間的氣管軟骨環(huán)間隙進針，注入0.1 mL生理鹽水，并將小鼠保持直立，左右旋轉(zhuǎn)各30 s。最后將各組小鼠的切口對齊縫合，并用無菌敷貼粘貼。待小鼠自然蘇醒后，每組隨機取2只小鼠處死，取肺組織，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色進行病理檢查，小鼠肺組織支氣管結(jié)構(gòu)較為模糊、部分支氣管上皮細(xì)胞壞死、間質(zhì)周圍炎癥細(xì)胞浸潤表明小鼠肺纖維化模型制備成功。

1.3.2 給藥方法及標(biāo)本采集造模成功后，空白組和模型組小鼠每日灌胃生理鹽水10 mL·kg-1；1，25(OH)2D3組小鼠每日經(jīng)腹腔注射5 μg·kg-1的1，25(OH)2D3；丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠每日灌胃丹參通絡(luò)解毒湯湯劑0.039 mL·g-1(按成人60 kg體質(zhì)量計算，相當(dāng)于生藥15.65 g·kg-1)；丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠每日灌胃丹參通絡(luò)解毒湯湯劑0.039 mL·g-1，并經(jīng)腹腔注射PDL192 3 mg·kg-1；各組小鼠均每日給藥1次，連續(xù)給藥28 d。各組小鼠末次給藥后12 h測體質(zhì)量，然后經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，將小鼠固定于操作臺上，將其氣管上段切開一T形小口，放進硅膠管，使用1 mL注射器通過氣管插管將0.5 mL的生理鹽水注入氣管，回抽采集肺支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，灌洗3次，將收集的BALF合并備用。然后用手術(shù)剪打開實驗鼠胸腔，分離氣管后取出整個肺組織，測肺組織質(zhì)量后分離左右肺組織，將左肺組織用40 g·L-1多聚甲醛固定，將右肺組織置于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于后續(xù)檢測。

1.3.3 5組小鼠肺系數(shù)計算根據(jù)5組小鼠末次給藥后12 h的體質(zhì)量及肺組織質(zhì)量計算小鼠肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.4 5組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平檢測取采集的BALF約1.5 mL，3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔，其中空白孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標(biāo)準(zhǔn)品孔加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，然后加入辣根過氧化物酶100 μL；待測樣品孔加入樣本50 μL，然后加入辣根過氧化物酶100 μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。揭膜，棄去液體，于每孔加滿洗滌液后靜置1 min，棄去液體，重復(fù)5次。每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。在15 min內(nèi)，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長依序測量各孔的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平。

1.3.5 5組小鼠肺組織病理學(xué)變化觀察取多聚甲醛固定的各組小鼠左肺組織，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯透明，梯度乙醇水化(體積分?jǐn)?shù)50%乙醇2 h，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇1 h，體積分?jǐn)?shù)85%乙醇 1 h，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇1 h，體積分?jǐn)?shù)100%乙醇 1 h)，進行HE染色(蘇木精染色10 min、伊紅染色3 min、體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化3 s)和Masson三色法染色(天青石藍染色液滴染2～3 min，蘇木精染色液滴染2～3 min，麗春紅品紅染色液滴染10 min，切片不水洗，直接滴入苯胺藍染色液染5 min)，中性樹脂封片后，采用數(shù)碼三目攝像顯微鏡觀察小鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.3.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測5組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA表達取-80 ℃保存的各組小鼠右肺組織100 g，加入1 mL RNA提取試劑，冰上勻漿 30 s，加入0.2 mL氯仿，充分震蕩混合30 s，室溫下15 000 r·min-1離心15 min，取上清液，在上清液中加入異丙醇，混合后，12 000 r·min-1離心10 min，獲取總RNA。使用Takara TB Green PreMix Ex Taq定量檢測基因表達水平，以β-actin為內(nèi)參，TWEAK上游序列：5′-TCACCCGGGCTGGGCTCTAC-3′，下游序列：5′-CGAGGGAACTGGCCGCAGTG-3′；Fn14上游序列：5′-ACCTGGACAAGTGCATGGACTGC-3′，下游序列：5′-GCGTGAGGCTCCTTTCTGTT-3′；TGF-β1上游序列：5′-CCTTGCCCTCTACAACCAACAC-3′，下游序列：5′-CTTGCAGGAGCGCACGATC-3′；β-actin上游序列：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游序列：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃初始變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s；45個循環(huán)；記錄循環(huán)閾值(threshold cycle，CT)值，采用2-△△Ct法計算TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達水平。

1.3.7 Western blot法檢測5組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量取-80 ℃保存的各組小鼠右肺組織100 g，于勻漿器中剪碎，加入400 μL裂解液置于冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃煮10 min后置于-20 ℃冰箱保存，使用等量蛋白質(zhì)上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1一抗(稀釋比例為1500)，4 ℃孵育過夜，然后滴加二抗稀釋液(稀釋比例為15 000)，室溫孵育1 h，使用ECL暗室顯色。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.8 Western blot法檢測5組小鼠肺組織TWEAK/Fn14通路因子TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量取-80 ℃保存的各組小鼠右肺組織100 g，于勻漿器中剪碎，加入400 μL裂解液置于冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃煮10 min后置于-20 ℃冰箱保存，使用等量蛋白質(zhì)上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3一抗(稀釋比例為1500)，4 ℃孵育過夜，然后滴加二抗稀釋液(稀釋比例為15 000)，室溫孵育1 h，使用ECL暗室顯色。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)比較結(jié)果見表1?？瞻捉M、模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺系數(shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組與空白組小鼠肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3組與模型組小鼠肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與1,25(OH)2D3組比較，丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯組與1,25(OH)2D3組小鼠肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組與丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5組小鼠體質(zhì)量及肺系數(shù)比較

2.2 5組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平比較結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平顯著升高，丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠BALF中IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠BALF中TNF-α、IL-4水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與1,25(OH)2D3組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹參通絡(luò)解毒湯組比較，丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 5組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平比較

2.3 5組小鼠肺組織病理變化結(jié)果見圖1?？瞻捉M小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無結(jié)締組織增生，無明顯膠原沉積(圖1A)。模型組小鼠肺組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管結(jié)構(gòu)較為模糊，部分支氣管上皮細(xì)胞壞死，間質(zhì)周圍炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織有大量膠原沉積(藍色)(圖1B)。1,25(OH)2D3組小鼠肺組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域肺泡腔較為狹窄，內(nèi)含大量細(xì)胞碎片和炎癥細(xì)胞，部分區(qū)域可見成纖維細(xì)胞增生，膠原沉積明顯減少(圖1C)。丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠部分區(qū)域肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管結(jié)構(gòu)較為完整清晰，部分肺泡結(jié)構(gòu)模糊，肺泡腔狹窄，間質(zhì)及周圍未見水腫或炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉積明顯減少(圖1D)。丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較為正常，各級支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，肺泡腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞散在分布，間質(zhì)及周圍未見水腫或炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉積明顯減少(圖1E)。

A：空白組；B：模型組；C：1,25(OH)2D3組；D：丹參通絡(luò)解毒湯組；E：丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組。

2.4 5組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量比較結(jié)果見表3。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量及1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TWEAK mRNA相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織中Fn14 mRNA相對表達量及丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1mRNA相對表達量與丹參通絡(luò)解毒湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 5組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1 mRNA相對表達量比較

2.5 5組小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量比較結(jié)果見表4和圖2。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量及1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β蛋白相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量及丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與1,25(OH)2D3組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中IL-1β蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯組和丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹參通絡(luò)解毒湯組比較，丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織中IL-1β蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組小鼠肺組織中TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 5組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1蛋白相對表達量比較

1：空白組；2：模型組；3：1,25(OH)2D3組；4：丹參通絡(luò)解毒湯組；5：丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組。

2.6 5組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較結(jié)果見表5和圖3。與空白組比較，模型組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組與空白組小鼠肺組織中Smad3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TWEAK、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中Fn14、Smad3蛋白相對表達量與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、α-SMA、p-Smad3、STAT3蛋白相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織中Fn14、TGF-β1、Smad3、p-STAT3蛋白相對表達量與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中p-Smad3蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、STAT3、Smad3、p-STAT3蛋白相對表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3蛋白相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中Smad3、p-STAT3蛋白相對表達量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織中Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、p-STAT3蛋白相對表達量及丹參通絡(luò)解毒湯小鼠肺組織中TWEAK、STAT3蛋白相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織中TWEAK、STAT3蛋白相對表達量顯著低于1,25(OH)2D3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組與丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、Smad3、p-Smad3、p-STAT3、STAT3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 5組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、TGF-β1、α-SMA、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較

1：空白組；2：模型組；3：1,25(OH)2D3治療組；4：丹參通絡(luò)解毒湯組；5：丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組。

3 討論

肺纖維化是一種慢性、不可逆的致命性疾病，其病死率超過了許多癌癥，但肺纖維化的治療選擇有限。隨著環(huán)境惡化等因素的影響，肺纖維化的發(fā)病率在全球呈上升趨勢，已成為嚴(yán)峻的健康問題[10]。盡管吡非尼酮、尼達尼布治療對肺纖維化有較好的效果，但其不可避免地會導(dǎo)致胃腸道不適、皮疹光敏性等不良反應(yīng)，從而限制了其臨床應(yīng)用。丹參通絡(luò)解毒湯具有調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制心肌纖維化、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的作用，但其治療肺纖維化的療效及機制尚不明確。因此，探討丹參通絡(luò)解毒湯治療肺纖維化的效果及作用機制，對于丹參通絡(luò)解毒湯的臨床應(yīng)用及開發(fā)肺纖維化的有效治療靶點、提高患者的生存率具有重要意義。

博萊霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化模型被廣泛用于研究肺纖維化的發(fā)病機制和評價新的治療策略[11]，因此，本研究采用了博萊霉素誘導(dǎo)制備小鼠肺纖維化模型。1,25(OH)2D3是最具活性的維生素D形式，其具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝、激素分泌、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化和凋亡等生物學(xué)功能，且與間質(zhì)性肺疾病嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可以改善實驗性肺纖維化[12-13]。因此，本研究采用1,25(OH)2D3干預(yù)作為陽性對照。PDL192是TWEAK受體抑制劑，起到抑制TWEAK/Fn14通路的作用，本研究設(shè)置丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組，旨在觀察丹參通絡(luò)解毒湯對博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的影響是否是通過TWEAK/Fn14通路而發(fā)揮作用。

本研究首先從小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)及肺組織病理角度進行觀察，結(jié)果顯示，博萊霉素引起了小鼠明顯的肺損傷，表現(xiàn)為注射博萊霉素后小鼠肺系數(shù)升高，而體質(zhì)量呈下降趨勢，小鼠肺組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管結(jié)構(gòu)較為模糊，部分支氣管上皮細(xì)胞壞死，間質(zhì)周圍炎癥細(xì)胞浸潤，表明小鼠模型誘導(dǎo)成功。本研究結(jié)果顯示，模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠的肺系數(shù)與空白組比較顯著增高，提示小鼠肺組織受損，發(fā)生了肺水腫；丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192對控制小鼠肺水腫有良好效果；1,25(OH)2D3組小鼠肺系數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺系數(shù)與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)與丹參通絡(luò)解毒湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)呈下降趨勢，其中丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)與模型組比較顯著降低，丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺系數(shù)與1,25(OH)2D3組比較顯著降低，說明丹參通絡(luò)解毒湯控制肺水腫的效果與1,25(OH)2D3組相當(dāng)，而丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192控制肺水腫的效果優(yōu)于1,25(OH)2D3組。同時，病理組織學(xué)觀察顯示，模型組小鼠肺組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺組織有大量的膠原沉積；1,25(OH)2D3組小鼠肺組織基本形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域肺泡腔較為狹窄，內(nèi)含大量細(xì)胞碎片和炎癥細(xì)胞，部分區(qū)域可見成纖維細(xì)胞增生，膠原沉積明顯減少；丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠部分區(qū)域肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管結(jié)構(gòu)較為完整清晰，部分肺泡結(jié)構(gòu)模糊，肺泡腔狹窄，間質(zhì)及周圍未見水腫或炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉積明顯減少；丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)較為正常，各級支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，肺泡腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞散在分布，間質(zhì)及周圍未見水腫或炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉積明顯減少；提示1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192對小鼠肺組織損傷均有改善作用，其中丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192的改善效果更佳。

炎癥反應(yīng)是肺纖維化的重要誘因，在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中，炎癥細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[14]。巨噬細(xì)胞會分泌趨化因子，募集炎癥細(xì)胞和促纖維化細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-4，從而形成纖維化的微環(huán)境[15]。ICAM-1和其受體淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1的相互作用可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并浸潤到支氣管，ICAM-1的高表達影響炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的內(nèi)皮轉(zhuǎn)移，且ICAM-1的高表達有助于肺泡腔內(nèi)活化的T細(xì)胞和多核白細(xì)胞的連接，從而刺激肺泡上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[16-17]。ICAM-1與TGF-β和結(jié)締組織生長因子在肺纖維化早期發(fā)揮協(xié)同作用，參與肺組織炎癥反應(yīng)和肺纖維化的修復(fù)[18]。VCAM-1是甚晚抗原4的內(nèi)皮配體，表達于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附并促進其向內(nèi)皮下遷移，是重要的炎癥募集分子[19]。博萊霉素可導(dǎo)致VCAM-1過表達，進而促進炎癥細(xì)胞向內(nèi)皮下浸潤，發(fā)揮炎癥募集作用，抑制VCAM-1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠減輕炎癥反應(yīng)[20]。此外，VCAM-1還在白細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用[21]。博萊霉素促進肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達和中性粒細(xì)胞的黏附[22]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平顯著升高，提示模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)；1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-4水平與模型組比較顯著降低，提示1,25(OH)2D3、丹參通絡(luò)解毒湯、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192均對控制小鼠肺組織炎癥反應(yīng)具有一定效果；丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平與1,25(OH)2D3組比較顯著降低，而TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示丹參通絡(luò)解毒湯、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192 干預(yù)控制小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的效果優(yōu)于1,25(OH)2D3組。丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠BALF中IL-1β、IL-4水平與丹參通絡(luò)解毒湯組比較顯著降低，而TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠BALF中TNF-α、IL-4水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192控制炎癥反應(yīng)的效果優(yōu)于單獨使用丹參通絡(luò)解毒湯。

研究認(rèn)為，肺纖維化的主要病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)沉積；肺損傷后，在炎癥細(xì)胞因子的刺激下，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)[23]。α-SMA作為血管平滑肌細(xì)胞的主要成分，是肌成纖維細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志蛋白，是肺纖維化的主要生物標(biāo)志物，可作為肺纖維化的指標(biāo)[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織α-SMA蛋白相對表達量顯著增高，提示模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠可能發(fā)生肺纖維化。丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織α-SMA蛋白相對表達量較模型組顯著降低，說明丹參通絡(luò)解毒湯、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192具有抑制小鼠肺纖維化的作用；但丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織α-SMA蛋白相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織α-SMA蛋白相對表達量與丹參通絡(luò)解毒湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192抑制小鼠肺纖維化效果與1,25(OH)2D3相當(dāng)。

TGF-β1與其受體Ⅱ結(jié)合時，TGF-β受體Ⅰ激酶被激活，磷酸化Smad2和Smad3形成Smad4復(fù)合物，然后復(fù)合物被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進而參與纖維化的發(fā)生、發(fā)展以及膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的沉積[25]。本研究顯示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白相對表達量顯著升高，1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白相對表達量顯著升高，提示模型組、1,25(OH)2D3組小鼠TGF-β1高表達與肺纖維化有關(guān)。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織TGF-β1mRNA相對表達量顯著降低，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白相對表達量顯著降低，提示丹參通絡(luò)解毒湯、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192干預(yù)可能通過抑制TGF-β1表達進而抑制肺纖維化進展。丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織TGF-β1mRNA及蛋白相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明丹參通絡(luò)解毒湯及丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192抑制肺纖維化的效果與 1,25(OH)2D3組相似。

TWEAK可以誘導(dǎo)酪氨酸705位點的STAT3磷酸化和核易位，并促進炎癥細(xì)胞因子的分泌，而Fn14是TWEAK的主要受體，當(dāng)TWEAK與Fn14耦合時，可使游離的Fn14活化，激活下游多條信號通路(包括Smad通路)而發(fā)揮生物學(xué)作用[26]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織TWEAK、Fn14 mRNA相對表達量及1,25(OH)2D3組小鼠肺組織TWEAK mRNA相對表達量顯著升高；模型組小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量顯著升高，1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中TWEAK、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量顯著升高，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織TWEAK、p-Smad3、STAT3蛋白相對表達量顯著升高，說明模型組、1,25(OH)2D3組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠TWEAK/Fn14通路相關(guān)因子表達有變化。與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組Fn14 mRNA相對表達量及丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織TWEAK、Fn14 mRNA表達顯著降低，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織TWEAK、Fn14 mRNA相對表達量與1,25(OH)2D3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組抑制TWEAK、Fn14 mRNA相對表達量的效果與1,25(OH)2D3組相似。1,25(OH)2D3組小鼠肺組織中p-Smad3蛋白相對表達量較模型組顯著降低，丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192組小鼠肺組織TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3蛋白相對表達量顯著降低，說明1,25(OH)2D3干預(yù)可抑制小鼠肺組織中p-Smad3蛋白表達，丹參通絡(luò)解毒湯、丹參通絡(luò)解毒湯+PDL192干預(yù)可抑制小鼠肺組織中TWEAK、Fn14、p-Smad3、STAT3蛋白表達；與1,25(OH)2D3組比較，丹參通絡(luò)解毒湯組小鼠肺組織TWEAK、Fn14Smad3、p-Smad3、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示丹參通絡(luò)解毒湯與1,25(OH)2D3組干預(yù)效果相當(dāng)。丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192組小鼠肺組織TWEAK、STAT3蛋白相對表達量較1,25(OH)2D3組顯著降低，說明丹參通絡(luò)解毒湯+ PDL192較1,25(OH)2D3更顯著抑制TWEAK、STAT3蛋白表達。此外，研究報道TWEAK和TGF-β1可誘導(dǎo)STAT3通路激活氣道平滑肌細(xì)胞，在調(diào)節(jié)氣道重塑過程中促炎癥細(xì)胞因子的分泌中起重要作用[27]；通過siRNA沉默TWEAK，促進了STAT3磷酸化的抑制[28]。因此，提示丹參通絡(luò)解毒湯可能通過TWEAK/Fn14途徑調(diào)節(jié)肺纖維化過程中STAT3的活化，減輕博萊霉素對肺纖維化的影響。

綜上所述，丹參通絡(luò)解毒湯能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，其機制可能與抑制肺部炎癥和抑制TWEAK/Fn14信號通路有關(guān)。丹參通絡(luò)解毒湯可能是治療肺纖維化的一種有價值的藥物。