喜炎平注射液對(duì)ARDS患者血清炎性因子和全血苦味受體水平的作用及機(jī)制*

湯娜娜，謝登海，楊國(guó)輝，寧睿，劉曉嫻，方昊，李莉，劉婷

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)科ICU，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

喜炎平注射液是由穿心蓮內(nèi)酯總磺化物制成的現(xiàn)代中藥注射液，具有抗病毒、抗菌及抗炎等作用，被廣泛用于呼吸系統(tǒng)感染性和炎癥性疾病的臨床治療[1-2]?？辔妒荏w(bitter taste receptors，TAS2R)是與人體感受苦味物質(zhì)密切相關(guān)的一類G蛋白偶聯(lián)受體，在全身多個(gè)組織器官中均有表達(dá)[3]，近年發(fā)現(xiàn)TAS2R在呼吸系統(tǒng)的防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4-5]。本課題組前期生物學(xué)研究表明，TAS2R亞型TAS2R39是膿毒癥并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的關(guān)鍵基因之一，提示TAS2R及其信號(hào)通路可能在ARDS發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用[6]。穿心蓮屬苦味類中藥[7]，喜炎平注射液可否通過(guò)調(diào)節(jié)TAS2R的表達(dá)、在治療ARDS中發(fā)揮抗炎效應(yīng)尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)觀察喜炎平注射液對(duì)ARDS 患者炎癥反應(yīng)的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年7月—2021年6月收治的ARDS患者，要求符合“ARDS柏林定義”診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，治療前ARDS分型為輕度或中度[氧合指數(shù)(the ratio of arterial blood partial pressure of oxygen to the fraction of inspired oxygen，PaO2/FiO2)為100 mmHg<～≤300 mmHg]、呼吸末正壓≥5 cm H2O、年齡為18～75歲，患者本人或授權(quán)委托人同意并簽署知情同意書；排除已知或懷疑對(duì)喜炎平注射液或相關(guān)成分過(guò)敏者，排除妊娠期和哺乳期女性患者，排除有免疫功能缺陷(如長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，惡性腫瘤等)，排除有嚴(yán)重肝腎功能異常，排除放棄積極搶救、不愿進(jìn)行常規(guī)治療者。共納入ARDS患者49例，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將患者分為對(duì)照組(n=25)和觀察組(n=24)，2組患者的臨床特征見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施[2020倫審第(268-01)號(hào)]。

1.2 研究方法

1.2.1治療方法 對(duì)照組ARDS患者接受ARDS常規(guī)治療，包括病因治療、機(jī)械通氣、抗感染及營(yíng)養(yǎng)支持治療等；觀察組ARDS患者在對(duì)照組常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合喜炎平注射液治療，治療方案為喜炎平注射液(江西青峰藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026249)250 mg加0.9%氯化鈉注射液250 mL稀釋，靜脈滴注，1次/d，療程7 d。

1.2.2基本資料和臨床指標(biāo)收集 收集2組患者治療前的基本資料，包括性別、年齡、病因分類(肺內(nèi)源性/肺外源性)、PaO2/FiO2及急性生理與慢性健康狀況評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluation scoring system Ⅱ，APACHE Ⅱ)，記錄2組患者治療過(guò)程中藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況(包括皮疹、過(guò)敏性休克及嚴(yán)重肝腎功能不全等)以及治療后的PaO2/FiO2。

1.2.3血清炎性因子檢測(cè) 分別于治療前及治療結(jié)束時(shí)抽取2組患者外周靜脈血標(biāo)本，3 000 r/min離心10 min，取上清，采用電化學(xué)發(fā)光法和免疫比濁法分別檢測(cè)2組患者血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)水平，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書執(zhí)行，IL-6和CRP試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Roche。

1.2.4全血TAS2R39 mRNA檢測(cè) 分別于治療前及治療結(jié)束時(shí)抽取2組患者外周全血標(biāo)本2 mL，采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)TAS2R39 mRNA的表達(dá)；全血標(biāo)本離心柱吸附法提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度和濃度；采用SYBR Green 染色法進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，健康志愿者全血RNA樣本作為空白對(duì)照，通過(guò)2-ΔΔCt公式計(jì)算TAS2R39 mRNA的相對(duì)表達(dá)量；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，TAS2R39上游引物為5′-TGATACCCTGGCTTCTGT-3′、下游引物為5′-TTAGTGGAGTTGGAGGAGTG-3′，GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′、下游引物為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本資料

2組患者性別、年齡、病因分類、治療前PaO2/FiO2及APACHE II評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示2組患者基本資料具有可比性。見表1。

表1 對(duì)照組和觀察組患者的基本資料

2.2 治療后PaO2 /FiO2水平及并發(fā)癥

2組患者在治療過(guò)程中均未發(fā)生皮疹、過(guò)敏性休克及嚴(yán)重肝腎功能不全等藥物不良反應(yīng)；治療后，觀察組患者的PaO2/FiO2[244.5(190.0，261.5)mmHg]較對(duì)照組[225.0(154.0，245.0)mmHg]升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.17，P=0.03)。

2.3 血清 IL-6和CRP水平

治療前2組患者血清 IL-6、CRP水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2組患者血清IL-6、CRP均較治療前下降(P<0.05)，且觀察組較對(duì)照組的水平更低(P<0.05)。見表2。

表2 對(duì)照組和觀察組患者血清IL-6和CRP水平比較[M(P25,P75)]

2.4 全血TAS2R39 mRNA

治療前2組患者全血TAS2R39 mRNA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組患者治療后全血TAS2R39 mRNA水平與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組患者治療后全血TAS2R39 mRNA水平較治療前明顯升高，且高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1)與同組治療前比較，P<0.01；(2)與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較，P<0.01。

2.5 TAS2R39 mRNA水平與炎性因子的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析表明，觀察組患者治療后TAS2R39 mRNA的表達(dá)分別與 IL-6(rs=-0.728,P<0.001)和CRP(rs=-0.622，P<0.001)水平呈負(fù)相關(guān)；對(duì)照組患者治療后全血TAS2R39 mRNA的表達(dá)與炎性因子IL-6(rs=0.166,P=0.429)和CRP(rs=0.100,P=0.633)的水平無(wú)秩相關(guān)。

3 討論

ARDS是一種臨床常見的急危重癥，是由于炎癥反應(yīng)失控造成的急性彌漫性肺損傷，多種肺內(nèi)、肺外原因均可誘發(fā)ARDS，最常見的病因?yàn)榧?xì)菌性或病毒性肺炎[9]。例如目前全球疫情依然嚴(yán)峻的新冠肺炎，重癥患者機(jī)體可出現(xiàn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，引起ARDS等嚴(yán)重并發(fā)癥，導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡[10-11]。我國(guó)在此次抗擊新冠肺炎疫情中取得了重大戰(zhàn)略成果，中西醫(yī)結(jié)合治療起到重要作用。在多版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中，喜炎平注射液被推薦用于治療重型新冠肺炎患者[12-14]。既往研究表明，喜炎平注射液有多種抗炎機(jī)制，如抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB/絲裂原活化蛋白激酶(nuclear transcription factor-κB/mitogen activated protein kinase，NF-κB/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)及Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(the Janus kinase/signal transducer of activators of transcription，JAK/STAT)等多條信號(hào)通路[15-16]；抑制多種細(xì)胞多種促炎基因的表達(dá)，包括環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase，COX-2)、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[17]；減少氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)等的生成[7,18-20]。目前有關(guān)喜炎平注射液治療ARDS的研究報(bào)道少見，在本研究中，觀察組ARDS患者聯(lián)合使用喜炎平注射液治療期間未發(fā)生明顯藥物不良反應(yīng)，治療后血清炎性因子IL-6和CRP水平低于對(duì)照組、PaO2/FiO2高于對(duì)照組，這一結(jié)果提示聯(lián)合喜炎平注射液治療ARDS，臨床安全性好，能有效改善患者氧合，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。

TAS2R屬于G蛋白偶聯(lián)受體，是味覺(jué)受體家族成員，人類基因組共編碼25種TAS2R亞型[3]。過(guò)去認(rèn)為TAS2R只存在于口腔味蕾，僅與苦味識(shí)別相關(guān)，近年發(fā)現(xiàn)在呼吸、循環(huán)、免疫、消化、中樞神經(jīng)及生殖等多種系統(tǒng)和組織中均有TAS2R表達(dá)，并且發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[21]；呼吸系統(tǒng)氣道上皮細(xì)胞的TAS2R能增加氣道纖毛搏動(dòng)頻率，并可作為前哨受體檢測(cè)入侵的革蘭氏陰性菌，觸發(fā)防御性殺菌反應(yīng)[22]；TAS2R可減少依賴免疫球蛋白(immunoglobulinE，IgE)活化的肥大細(xì)胞釋放組胺和前列腺素D2，抑制肺巨噬細(xì)胞釋放炎性因子[23]；激活TAS2R及其下游信號(hào)通路，可舒張氣道平滑肌，作用強(qiáng)于β2受體激動(dòng)劑[4]。因此，通過(guò)多種防御功能，TAS2R有望成為慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等氣道炎癥性疾病新的防治靶點(diǎn)，但TAS2R及其信號(hào)通路是否也與ARDS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前少有研究報(bào)道。本課題組前期生物信息學(xué)研究結(jié)果表明，TAS2R39可能在ARDS發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用[24]。此外，已有研究認(rèn)為苦味中藥可經(jīng)TAS2R途徑遏制氣道炎癥過(guò)程[25]。喜炎平注射液屬于苦味中藥，為研究喜炎平注射液能否通過(guò)TAS2R在治療ARDS中發(fā)揮抗炎作用，本研究檢測(cè)了2組患者治療前、后全血TAS2R39 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)照組ARDS患者治療前、后全血TAS2R39 mRNA的表達(dá)水平無(wú)差異，但觀察組ARDS患者經(jīng)喜炎平注射液聯(lián)合治療后全血TAS2R39 mRNA表達(dá)上調(diào)且與IL-6、CRP水平均呈負(fù)相關(guān)，此外這2種炎性因子水平較治療前及對(duì)照組治療后的水平均有降低，提示喜炎平注射液可能通過(guò)上調(diào)TAS2R39表達(dá)發(fā)揮抗炎效應(yīng)。

綜上所述，喜炎平注射液能改善ARDS患者的氧合功能，其機(jī)制可能是通過(guò)激活TAS2R途徑來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，故本研究結(jié)果可為喜炎平注射液輔助治療ARDS的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。但本研究尚存不足，如樣本量偏少，未納入重度ARDS患者，只檢測(cè)了全血標(biāo)本TAS2R39 mRNA表達(dá)，故后續(xù)還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步深入研究。