雌性健康和絕經(jīng)小鼠長骨及頜骨來源骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的比較*

胡珊珊，張為，曹煒**，胡小華，林雪***，楊曉紅****

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 修復(fù)科，貴州 遵義 563006; 2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔科, 重慶 400038; 3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 頜面外科, 貴州 遵義 563006)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，POP)是指中老年婦女在雌激素降低、缺乏后的一種以全身骨量減少、骨組織微環(huán)境改變所致的骨脆性增加、并發(fā)骨折風(fēng)險上升的全身骨代謝性疾病[1]。一般情況下，絕經(jīng)后骨組織微環(huán)境會發(fā)生變化，骨髓間充質(zhì)干細胞等非造血干細胞發(fā)生特定生物學(xué)功能障礙，新骨形成不足，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[2]。有報道顯示，頜骨及長骨不僅在胚胎發(fā)育的組織來源和細胞的信號傳導(dǎo)機制存在差異，而且在細胞分化和成骨基因等表達方面也有不同[3-4]，但膜內(nèi)成骨的顱頜面骨和軟骨內(nèi)成骨的長骨兩者之間存在的具體差異未見深入研究。因此，本研究將絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松狀態(tài)與正常健康狀態(tài)下小鼠長骨來源的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)和頜骨來源的骨髓間充質(zhì)干細胞(jaw mandibular bone marrow mesenchymal stem cells，JMMSCs)進行增殖能力、成脂分化以及成軟骨分化性能對比，觀察兩種狀態(tài)下的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)生物學(xué)特性是否存在差異，為臨床頜骨骨缺損治療及修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

SPF級雌性健康C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司[許可證號 SCXK(京)2019-0010]。α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)以及青鏈霉素均購自Hyclone公司，CKK-8檢測試劑盒購自碧云天公司，茜素紅染液、油紅O染液和阿利新藍染液均購自Solarbio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠動物模型的構(gòu)建 雌性C57BL/6小鼠(6月齡)36只，麻醉后剃除其背部毛發(fā)，用碘伏消毒剃毛部的皮膚，剪開背部皮膚，分層剝離皮下、脂肪及腹腔層，其中18只小鼠找到臟層的雙側(cè)卵巢，結(jié)扎和剪棄，作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型組(ovariectomies group，OVX組)，另外18只小鼠僅剪去卵巢周圍組織作為正常對照組(sham-operated group，SHAM組)，兩組小鼠低鈣飼養(yǎng)12周后用于本次實驗。

1.2.2BMSCs的分離、純化與培養(yǎng) 將已成功建模的OVX組及SHAM組小鼠飼養(yǎng)12周后采用頸部脫臼法處死，取其下頜骨和長骨(包括股骨及脛骨)，去凈黏附于骨的軟組織和筋膜，然后用1 mL注射器和α-MEM完全培養(yǎng)基(20%FBS，100 U/mL青鏈霉素混合液)反復(fù)沖洗骨髓腔，制成骨髓單細胞懸液，共4組，分別為OVX-BMMSCs組、SHAM-BMMSCs組、OVX-JMMSCs組以及SHAM-JMMSCs組。長骨組骨髓單細胞懸液直接放入T25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，頜骨組骨髓單細胞懸液則連同剪碎后的下頜骨組織一同放入T25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液均為5 mL，每3 d換1次培養(yǎng)液，待細胞融合生長達85%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，本實驗所用細胞主要為第3代。

1.3 觀察指標

1.3.1骨組織形態(tài)學(xué) 將已成功建模的OVX組及SHAM組小鼠飼養(yǎng)12周后采用頸部脫臼法處死，取其下頜骨和長骨并去凈粘附于骨的軟組織和筋膜；4%多聚甲醛室溫固定 48 h，然后用 EDTA 脫鈣液常溫下脫鈣3周，每3 d更換1次脫鈣液；將脫鈣好的標本在流水下沖洗8 h，用酒精行梯度脫水后進行石蠟包埋，以約10 μm切片，HE染色，觀察骨凹陷窩、骨小梁排列形態(tài)等病理學(xué)指標。

1.3.2BMSCs增殖能力(CCK-8法) 將頜骨及長骨來源的BMSCs以6×103個/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，每組每天設(shè)5個復(fù)孔，7 d共接種7個96孔板，每3 d換1次培養(yǎng)液；第1～7天，每天同一時間取出一個板，每個培養(yǎng)孔加入CCK-8液10 μL和完全培養(yǎng)基90μL，37 ℃孵育2 h，用酶標儀490 nm 波長檢測吸光度值(OD值)，繪制增殖曲線。

1.3.3脂滴含量檢測(油紅O染色) 將頜骨及長骨組BMSCs以每毫升1×105個接種于24孔板，每3 d換1次液，待細胞長至板底85%～90%時，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。14 d后吸棄誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入細胞固定液固定30 min，加入新配制的60%異丙醇作用5 min；棄去60%異丙醇后加入新制備的ORO Stain液，染色15 min，PBS輕輕洗3 min；加入Mayer蘇木素染色1 min，PBS反復(fù)洗滌3遍；加入ORO Buffer液靜置1 min后棄去加入蒸餾水，鏡下觀察脂滴分布圖樣并拍照；拍照完畢后進入定量，加入適量的異丙醇溶液于孔中，靜置10 min，收集溶解的液體，加入96孔專用板中，使用酶標儀在520 mm處檢測溶解的液體的OD值。

1.3.4軟骨基質(zhì)含量檢測(阿利新藍染色) 將頜骨及長骨組BMSCs以每毫升1×105個的劑量接種于24孔板，每3 d換1次液，待細胞長至板底85%～90%時，更換為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3d替換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基，21 d后棄去誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入細胞固定液作用30 min，PBS輕輕洗滌2遍，加入阿利新藍染色液作用30 min；PBS沖洗3 min，Alcian酸化工作液(工作液∶蒸餾水=1∶2，提前5 min配好)處理1 min；PBS沖洗2次，倒置顯微鏡下觀察軟骨球形成的樣貌并拍照。阿利新藍染液是一種能附著于軟骨細胞的基質(zhì)藍色染液，其染色越深代表其軟骨基質(zhì)含量越多。ALP定量分析：去除原培養(yǎng)液，加入適量細胞裂解液(不含蛋白酶抑制劑)，置于搖床，冰上裂解30 min；取上清液，測定總蛋白濃度，按照ALP試劑盒說明書測定405 nm處OD值。根據(jù)標準品的OD值繪制曲線，計算獲得各組ALP定量結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

小鼠的下頜骨、股骨 HE染色結(jié)果顯示：與SHAM組相比，OVX組小鼠的骨小梁排列較紊亂，骨吸收明顯，出現(xiàn)了較多大小規(guī)則不同的骨凹陷窩，見圖1。

注：A為OVX組頜骨，B為SHAM組頜骨；C為OVX長骨，D為SHAM長骨。

2.2 BMSCs的分離、純化與培養(yǎng)

經(jīng)全骨髓貼壁法培養(yǎng)后，在光學(xué)顯微鏡下觀察4組BMSCs的生長情況及細胞形態(tài)，可見4組BMSCs 均能貼壁生長，傳至第3代的4組BMSCs形態(tài)相似，呈三角形或梭形，有參差不齊的細胞突起。見圖2。

注：A、B 為OVX-BMMSCs組，C、D為SHAM-BMMSCs組；E、F為OVX-JMMSCs組，G、H為SHAM-JMMSCs組。

2.3 BMSCs增殖能力

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，4組BMSCs細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的增殖活性呈升高趨勢(圖3，P=0.034)。從培養(yǎng)第4 天開始，OVX組和SHAM組細胞增殖速度達對數(shù)生長期，且JMMSCs的增殖能力明顯強于BMMSCs組(OVX-JMMSCs組與OVX-BMMSCs組比較，P<0.05；SHAM-JMMSCs組與SHAM-BMMSCs組比較，P<0.05)。

注：A為OVX組，B為SHAM組。

2.4 脂滴含量

油紅O定量分析結(jié)果表明：JMMSCs形成的脂滴含量均較少于BMMSCs(P<0.001)。見圖4。

注：A 為SHAM-BMMSCs組,B為SHAM-JMMSCs組,C為OVX-BMMSCs組,D為OVX-JMMSCs組，E為4組細胞油紅O定量結(jié)果；(1)與SHAM組BMMSCs比較，P<0.001；(2)與OVX組BMMSCs比較，P<0.001。

2.5 軟骨基質(zhì)含量

阿利新藍染色結(jié)果顯示：4組BMSCs均可見染成藍色的成軟骨基質(zhì)，呈異染性著色(見圖5)。ALP定量顯示SHAM組和OVX組的JMMSCs與BMMSCs的軟骨基質(zhì)含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(SHAM組JMMSCs與BMMSCs比較，P=0.203；OVX組JMMSCs與BMMSCs比較，P=0.776)。見圖5。

注：A為SHAM-BMMSCs組,B為SHAM-JMMSCs組,C為OVX-BMMSCs組,D為OVX-JMMSCs組,E為4組細胞ALP定量；(1)與SHAM組BMMSCs比較，P=0.203；(2)與OVX組BMMSCs比較，P=0.776。

3 討論

近年來，中國社會老齡化趨勢迅猛，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為危害老年人健康的重大慢性病之一。據(jù)統(tǒng)計，中國人群中患絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥并發(fā)骨折的80歲以上人群數(shù)量比在50～59歲人群上升4倍多，這為家庭及社會造成巨大的經(jīng)濟負擔[5]。頜骨作為全身骨骼系統(tǒng)改建較為活躍的一部分，同樣會受到骨質(zhì)疏松的影響，發(fā)生頜骨骨質(zhì)疏松的危害在口腔相關(guān)疾病中的表現(xiàn)主要在于會促使牙槽骨的快速吸收和加快牙周炎的發(fā)展，從而對義齒修復(fù)、種植和頜面外科手術(shù)等口腔科治療帶來困難[6-7]。現(xiàn)今，對骨質(zhì)疏松癥治療方式主要為藥物治療，包括雌激素替代療法、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，但是這些藥物主要針對全身性的骨質(zhì)疏松癥，且藥物的毒副作用、長期運用的安全性都給臨床治療帶來了挑戰(zhàn)[8-9]。隨著干細胞生物醫(yī)學(xué)的深入研究，針對干細胞的醫(yī)學(xué)治療正在興起。

BMSCs作為具有強增殖、自我更新及多向分化潛能的干細胞，能在特定培養(yǎng)條件下向成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞等多向分化，在移植物抗宿主免疫、修復(fù)組織損傷及基因靶向治療等方面具有較大應(yīng)用前景[10-11]；盡管均屬于全身骨骼的一部分，但是在組織發(fā)生方面，頜骨來源于外胚層的神經(jīng)嵴細胞，長骨來源于中胚層的間葉細胞；在組織成骨方式方面，頜骨的形成以膜內(nèi)成骨為主，而長骨則以軟骨內(nèi)成骨為主[12-14]。在本研究中，將兩種來源的BMSCs分開研究，在同樣的培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)無論是在健康狀態(tài)還是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松狀態(tài)下JMMSCs的成脂能力都比BMMSCs弱，分析其原因可能一是兩種細胞的骨形成方式不同，可能造成了頜骨對微環(huán)境刺激、細胞因子等生物調(diào)節(jié)的敏感度不同于長骨；二是頜骨受到咀嚼、言語和吞咽所產(chǎn)生的持續(xù)機械刺激，從而刺激骨重塑，使頜骨與長骨之間的骨重塑率不同，有研究發(fā)現(xiàn)在犬模型中，下頜骨的周轉(zhuǎn)率是脛骨的10倍[15]，因此可能造成JMMSCs增殖能力強于BMMSCs。此外，本研究所采用的動物模型為嚙齒類動物，其頜骨存在終身生長發(fā)育的特點，骨骼肌的不斷刺激使得咀嚼系統(tǒng)不斷改建與完善，這有利于觀察到骨質(zhì)疏松時骨微環(huán)境的變化；而人在出生后，頜骨的生長發(fā)育主要有兩種方式，即髁突的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，這使得頜骨向垂直、內(nèi)外及前后不同方向生長，但在青少年時期則發(fā)育完全，最晚發(fā)育完全的髁突也在20～25歲就停止了[16]。骨形成與破壞的原因主要在于BMSCs分化功能在成脂與成骨等方向不平衡，使得骨微環(huán)境中破骨細胞與成骨細胞產(chǎn)生差異，因此本研究模型對今后研究其他種屬的骨改建仍有一定參考意義。

本實驗中發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下BMSCs的生物學(xué)特性發(fā)生了改變，但調(diào)控其分化的機制卻有許多[17-18]。首先在經(jīng)典的信號通路研究中，BMP/Smads信號通路及OPG/RANK/RANKL信號通路與BMSCs分化有著密不可分的關(guān)系[19-21]，Hu等[22]更是發(fā)現(xiàn)BMP I型受體蛋白也參與了下頜骨骨代謝平衡。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子也參與了BMSCs分化，其中轉(zhuǎn)錄因子Runx2是BMSCs分化的重要決定因子，Lai等[23]發(fā)現(xiàn)Runx2和Osterix上調(diào)可以加速骨代謝，促進骨折愈合。近年來，有關(guān)非編碼RNA的研究正在興起，研究發(fā)現(xiàn)這類RNA能通過調(diào)控骨相關(guān)信號通路對BMSCs分化產(chǎn)生控制[24]，本課題組前期研究就發(fā)現(xiàn)敲低小鼠頜骨骨髓間充質(zhì)干細胞中的miR-705表達，可上調(diào)成骨相關(guān)基因表達，促進BMSCs向成骨分化[25]。

綜上所述，無論是健康狀態(tài)還是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松狀態(tài)下，小鼠頜骨及長骨來源的BMSCs確實存在增殖及成脂分化能力的差異，研究相應(yīng)內(nèi)容時應(yīng)分開進行，這為干細胞應(yīng)用和骨組織缺損修復(fù)提供了重要參考。