‘赤霞珠’與‘北紅’正反交群體抗寒旱性能遺傳特點

唐玄德，王榮，劉玉娟，段偉，梁振昌，范培格,3

（1. 寧夏大學農學院，銀川 750021；2. 中國科學院植物研究所，北京 100093；3. 中國葡萄酒產業(yè)技術研究院，銀川 750021）

近年來我國葡萄酒產業(yè)迅速發(fā)展，取得了可喜的成就[1-3]。據(jù)國際葡萄和葡萄酒組織（OIV）統(tǒng)計，2018年我國葡萄種植面積為87.5萬 hm2，居世界第二；葡萄酒產量約為9.3億升，居世界第十，約有6.9億升需進口[4]，因此，葡萄酒需求有很大的發(fā)展空間。我國釀酒葡萄主要分布在北方地區(qū)，以大陸性季風氣候為主，冬季寒冷干旱，葡萄需要埋土防寒才能越冬。冬季埋土、春季出土不僅耗費大量勞動力，增加生產成本，同時也會造成樹體的機械損傷，加劇種植地生態(tài)環(huán)境惡化[5]，因此選育、推廣抗寒旱的免埋土優(yōu)質釀酒品種迫在眉睫。

有性雜交是果樹最常見的育種方法，而果樹雜交親本在遺傳上存在異質結合型，雜交性狀廣泛分離[6]。為了加快育種進程，提高育種效率，性狀的遺傳規(guī)律及親本的選擇至關重要[6]。研究認為，抗寒性遺傳取決于親本的冰點值（low-temperature exotherm，LTE）。一般LTE值越低，后代的抗寒性越強[5]，且許多子代的LTE值高于親中值，表明抗寒性存在超親遺傳現(xiàn)象。子代抗寒性與春季凍害等級不一致，但存在相關性。而在正反交群體中抗寒性狀遺傳特點的報道有限，目前僅有‘北醇’與‘康可’正反交及后代遺傳規(guī)律的報道，指出二者正反交后，抗寒性不存在顯著差異，也不存在細胞質遺傳特點[7]。

本試驗利用抗寒性具有明顯差異的歐洲種‘赤霞珠’與山歐雜種‘北紅’（Vitis vinifera×V. amurensis）構建的正反交群體后代為研究對象，對群體后代的凍害等級、萌芽率和LTE值等進行分析，旨在揭示群體后代的抗寒旱性狀的遺傳特點及正反交群體的差異，為今后葡萄抗寒旱雜交育種工作中合理選配親本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材為中國科學院植物研究所葡萄種質資源圃（北京）中2個群體共225個單株，‘赤霞珠×北紅’雜交群體‘15-25’為正交，‘北紅×赤霞珠’雜交群體‘14-2’為反交。正交為67個單株，反交為158個單株，‘赤霞珠’（埋土）與‘北紅’（未埋土）為對照，2021年1月10日前后取雜交株系和對照品種樹體上生長健壯枝條5條（每條5～8節(jié)），用保鮮膜包裹，放置于4 ℃的恒溫冷庫臨時存放，用于含水量、冰點值及萌芽率調查。

1.2 儀器與設備

電子天平；數(shù)顯糖度計（Digital Refractometer）；風干烘箱；差熱分析（different thremal analysis, DTA）系統(tǒng)包括電壓控制冰箱和數(shù)據(jù)采集2個系統(tǒng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 枝條總含水量的測定

參照鄒琦的烘干法[8]。取一年生5～8節(jié)生長健壯枝條，剪成10 cm的枝段，每3段一個重復，每個重復3個枝段，共9根，精確稱重，記為W1；將其置于烘箱中，在105 ℃烘15 min殺青處理，然后置于80 ℃烘箱，烘至恒重，稱重記為W2。

枝條總含水量（%）＝[(W1－W2）/W1]×100

1.3.2 枝條自由水測定

參照潘熾瑞的方法[9]。取出10 mL型號的離心管，并放置于天平準確稱重，記為W1；配制濃度65%蔗糖，分別加入離心管中，每管加5 mL，記為W2；將枝條避開芽眼用刀切成0.1 cm厚的薄片，準確稱取0.5 g，3個重復，置于含有蔗糖溶液的試管中，再稱重記為W3?？劬o離心管蓋，置于暗處放置16～24 h，期間每隔3 h，均勻晃動，用Digital Refractometer折射儀測定各試管蔗糖溶液濃度。

枝條自由水含量（%）＝[(W2－W1)×(C1－C2)/C2]/(W3－W2)×100

式中：W2－W1為糖液原質量（g）；W3-W2為枝條鮮質量（0.5 g）；C1為糖原液濃度（65%）；C2為浸泡后糖液濃度（%）

枝條束縛水含量（%）＝枝條總含水量－枝條自由水含量

束自比＝束縛水含量/自由水含量

1.3.3 葡萄冬芽冰點值的測定

采用柴風梅等的方法[10]。取5～8節(jié)飽滿芽，垂直芽體中軸線切下，帶有0.5～1.0 mm厚的木質部組織，切面整齊。培養(yǎng)皿中加入1 mL蒸餾水，保證芽體濕潤，電熱板孔中放入吸水紙，加入150 μL蒸餾水，放入切好的芽體，每個孔中加入6～9個芽。蓋上黑色海綿，保證芽體與電熱模板緊密接觸。固定好的電熱板置于程序控制冰箱降溫，降至-4 ℃保持1 h；-4～-40 ℃，降溫速度為4 ℃·h-1，共需10 h，每隔15 s采集1次溫度數(shù)據(jù)。植物組織低溫時會集聚放出熱量，因此導致溫度升高，電壓圖會出現(xiàn)高峰，高峰出現(xiàn)時的溫度為休眠芽的致死溫度，即為冰點值（LTE）。

1.3.4 枝條萌芽率

萌芽率采用喬改霞的方法[11]。結合LTE試驗，將取剩枝段，下截口斜剪，上截口平齊，用嫁接白色條帶綁扎，逐一編號，4個重復，放置在黑色穴盤中扦插，穴盤內加滿自來水，一周換兩次水，下截口出現(xiàn)白色粘液后，清洗穴盤，重新加入自來水，直至枝條萌芽，萌芽期間加入自來水，保證盤中的穴孔滿水。45 d后統(tǒng)計萌芽率。

萌芽率（%）＝萌芽數(shù)/芽眼總數(shù)×100

1.3.5 田間凍害等級調查

春季田間植株萌芽后調查凍害等級，凍害級別及描述如下：

1級：無凍害。耐寒性極強，植株全部芽眼正常萌發(fā)，樹體生長發(fā)育正常。傷流期間新剪口有傷流現(xiàn)象，芽眼和結果母枝未受凍，芽眼萌發(fā)整齊一致。

2級：輕微凍害。60%以上的芽眼正常萌發(fā)，傷流期間新剪口有傷流液，但傷流滴水較慢。受凍的一年生枝橫截面有少量變褐，木質部輕微受凍，芽眼萌發(fā)推遲，且不一致。

3級：較嚴重凍害。傷流期間新剪口有傷流，但傷流滴水明顯較少，整個植株部分芽眼和結果母枝受凍致死，受凍枝條形成層部分變褐，僅有部分芽眼萌發(fā)，且比正常萌發(fā)推遲，生長衰弱。

4級：嚴重凍害。傷流期間新剪口只有少量傷流，結果母枝和枝芽全部凍死，枝蔓形成層變黑。地上部芽眼無一萌發(fā)，只從根基部萌蘗。

5級：植株受凍害致死。傷流期中新剪口無傷流，主干基部隱芽無一萌發(fā)，整株枝蔓干枯死亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

用Microsoft excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Excel、Origin 2018 64Bit軟件作圖。參照張文娥[12]的方法，采用隸屬函數(shù)計算隸屬值，取平均隸屬值進行抗寒性分級。共5級：0.70～1.00為高抗；0.60～0.69為抗；0.40～0.59為中抗；0.30～0.39為抵抗；0～0.29為不抗。

隸屬函數(shù)公式：U（Xi）＝(Xi－Xmin)/(Xmax－Xmin)。如果某一項指標與判定結果為負相關，則為反隸屬函數(shù)進行定量轉換。

計算公式為：U（Xi）＝1－(Xi－Xmin)/(Xmax－Xmin)，式中，U（Xi）為隸屬函數(shù)值，Xi為無性系某項指標測定值，Xmin和Xmax為所有參數(shù)無性系中某一指標的最大值和最小值[12]。

變異系數(shù)（%）＝標準差/F×100；

超低親率（%）＝平均隸屬度低于較低親本的株數(shù)/正反交群體總株數(shù)×100；

超高親率（%）＝平均隸屬度高于較高親本的株數(shù)/正反交群體總株數(shù)×100；

遺傳傳遞力（%）＝F/MP×100；

式中F為雜交后代平均值；MP為親中值；H2為廣義遺傳力；VG為遺傳方差；MS為雜交后代組間方差，Mse為雜交后代組內方差。

2 結果與分析

2.1 正反交群體后代枝條含水量及萌芽率

由圖1可以看出，親本及正反交群體后代枝條總含水量保持穩(wěn)定，大致呈一條水平線，分布在39%～51%。而正反交群體后代束縛水、自由水含量在群體中有差異，隨著單株自由水含量的上升，其束縛水含量呈下降趨勢。正反交后代束縛水含量均值差異明顯，分別為20.5%、19.3%，且束縛水含量介于親本之間，偏向抗寒性強的親本‘北紅’。

圖1 親本及后代水含量分布情況Figure 1 Water content distribution of parent and offspring

親本‘赤霞珠’和‘北紅’的總含水量、自由水含量沒有顯著差異，總含水量分別為44%、42%，自由水含量分別為25%、23%。但‘赤霞珠’的束縛水含量為14.6%，‘北紅’的束縛水含量為20.5%，差異明顯?！嘞贾椤汀奔t’束自比也存在顯著差異。

正交群體‘15-25’后代的束縛水含量高于‘北紅’的單株有27株，占比約40%。反交群體‘14-2’后代的束縛水含量高于‘北紅’的單株有34株，占比約22%。正交群體‘15-25’后代的束自比高于‘北紅’的單株有21株，占比約31%。反交群體‘14-2’后代的束自比高于‘北紅’的單株有34株，占比約22%。

后代株系的萌芽率不管是正交群體還是反交群體的均為100%。

2.2 正反交后代抗寒性遺傳分析

親本‘赤霞珠’LTE值為-16.20 ℃，屬于低抗；‘北紅’LTE值為-21.70 ℃，屬高抗，兩者的LTE值存在顯著差異，分屬不同的抗寒性等級。由表1可以看出，兩個品種構建的正反交群體后代LTE值均呈不同程度的連續(xù)分布，分別為-24.40～-10.89、-24.68～-12.64 ℃。兩個群體LTE值分布范圍均大于強親本，具有超親遺傳特點。正反交群體后代LTE均值分別為-21.01、-21.52 ℃，存在顯著差異，整體趨向抗寒性較強的親本‘北紅’。變異系數(shù)分別為12.95%和9.52%，正交群體‘15-25’的變異系數(shù)大于反交群體‘14-2’，在同一環(huán)境條件下，正交群體的變異性高于反交群體。廣義遺傳力與遺傳傳遞力沒有顯著差異，廣義遺傳力為0時，表明表型變異由環(huán)境影響造成；廣義遺傳力為1時，表型變異由基因控制，而正交群體后代在相同的環(huán)境條件下廣義遺傳力更多受基因影響。

表1 正反交群體LTE值統(tǒng)計Table 1 Statistics of orthogonal group LTE value

由表2可以看出，最大比例的群體后代均是介于親本之間的類型，正交和反交群體LTE值高于強親本值的比例分別為43.47%和41.25%，弱于弱親本值的比例分別為8.69%和3.12%，抗寒性弱的親本做母本后代中會出現(xiàn)更高比例抗性更弱的株系。

表2 正反交后代抗寒性偏向統(tǒng)計Table 2 Statistics of the anti-cold bias in offspring with positive and negative cross%

由圖2可以看出，正交群體呈偏右峰單向正態(tài)分布，反交群體呈經典型正態(tài)分布。正反交群體后代LTE均呈離散分布。正交群體LTE集中分布區(qū)間為-23.8～-17.7 ℃，反交群體LTE集中分布在-23～-20 ℃，正交群體相對反交群體LTE更分散。

圖2 正反交群體后代LTE值頻率直方圖Figure 2 Frequency histogram of orthogonal group offspring

2.3 群體田間凍害等級分析

由表3正反交群體后代凍害等級顯著性分布看，兩個群體后代最高比例等級均為1級，即無凍害植株，分別占比為50.70%和68.44%，反交群體高出近18個百分點。兩個群體間后代3級和5級所占比例差異不大，而4級所占比例差異較大，正交群體比例高13.64個百分點。1、2級植株表現(xiàn)輕微凍害，60%以上的芽眼正常萌發(fā)，生產中對產量影響不大；反交群體1級（無凍害）和2級株系的比例高于正交20個百分點，說明反交群體‘14-2’后代具有更大比例的實際抗寒性能明顯優(yōu)于正交群體的株系。

表3 正反交群體凍害等級的分布Table 3 Distribution of sprouting grade in positive and negative groups%

2.4 含水量、LTE值、凍害等級相關性

根據(jù)群體后代株系含量差異的束自比與LTE值的相關性分析可看出（圖3），兩個群體的LTE值與束自比均具有相關性，一般束自比值高，LTE值低，抗寒性強。正交群體‘15-25’單株LTE值與束自比相關性為0.62，反交群體的相關性為0.74，但均未達到顯著相關。

圖3 束自比、LTE值相關性曲線Figure 3 Bound-free ratio and LTE value correlation curve

由圖4可以看出，正交群體‘15-25’凍害等級對應的LTE中位數(shù)依次為-21.43、-21.82、-17.62、-21.62、-21.59 ℃，反交群體‘14-2’凍害等級對應的LTE值中位數(shù)依次為-21.35、-21.95、-21.85、-21.29、-20.58 ℃。由這兩組數(shù)據(jù)可以看出，凍害等級與LTE值沒有直接相關性，凍害等級與冬季枝條含水量也無直接相關性。

圖4 不同凍害等級植株的冬芽LTE值分布Figure 4 Distribution of LTE of plants with different freezing grades

3 討論與結論

利用高抗性的野生資源與優(yōu)質的栽培品種雜交是選育具有優(yōu)質高抗品種的重要方法[1,14,21-23]。本試驗親本‘北紅’是山葡萄F1代，可抵御-21.83 ℃低溫[13]，在北方露地栽培可安全越冬。‘赤霞珠’是優(yōu)良的歐亞種品種，但不抗寒，利用兩個品種雜交期望選育出既有‘北紅’的高抗寒性能，又具有‘赤霞珠’優(yōu)良品質性狀的新優(yōu)品種。從群體后代的LTE值看，具有超親遺傳特點，而且兩個群體株系在春季萌芽后田間表現(xiàn)出較高比例的無凍害植株比例，利用抗寒的山葡萄血統(tǒng)后代（F1）做親本完全可以選育出抗寒性能強的株系，這與Wang等的結果一致[7]。

另外，有性雜交育種中父母本的配置至關重要。本試驗利用抗寒性具有明顯差異的‘赤霞珠’與‘北紅’構建正反交群體，兩個群體后代LTE均值不存在顯著差異，但群體后代LTE值整體趨向抗寒性較強的親本‘北紅’，這與郭海林等[24]在結縷草屬植物抗寒性試驗中得出的遺傳現(xiàn)象一致，也與王榮、柴風梅等[5,7,13]的研究結果一致。但試驗發(fā)現(xiàn)，后代LTE值弱于弱親本值的占比正交群體大于反交群體，因此抗寒性弱的親本做母本（正交群體15-25）后代中會出現(xiàn)更高比例抗性更弱的株系。從群體后代凍害等級分布結果也得出，正交群體株系4級（地上部無一萌芽）所占比例相較反交群體高13.64個百分點，反交群體后代中1級（無凍害）和2級株系的比例高于正交群體20個百分點，說明選用抗寒性能強的親本做母本，獲得抗寒旱后代的株系概率更大。

試驗結果發(fā)現(xiàn)，經過低溫馴化后的1月份取樣測得的枝條束自比與冬芽LTE值具有一定相關性，但未達到顯著相關，而冬芽LTE值與春季田間凍害等級沒有直接相關性。Wang等[7]利用7個雜交群體進行的試驗也得出同樣的結果。北京冬末春初，氣溫升高，但氣候干旱，且常伴有大風天氣，推測可能是氣溫回升后枝條中水分的變化影響最終的萌芽，具體不同類型基因型在越冬期間水分變化的差異及調控機制有待深入研究。

4 展望

有性雜交育種是抗寒旱優(yōu)質育種的重要途徑之一，明確不同正反交育種抗寒旱遺傳特點，一方面可以解決我國北方葡萄埋土防寒根本問題，減少生產成本，提高市場競爭力。選用抗寒旱性能強的品種與品質優(yōu)良的品種雜交選育適宜我國立地條件的新優(yōu)品種，不僅從生產源頭上解決北方葡萄冬季防寒埋土所帶來的成本增高、生態(tài)惡化等問題，也可以豐富釀酒葡萄種質資源，實現(xiàn)品種與產品品質的多樣化。另一方面，深入進行雜交群體后代及不同抗性種質資源抗寒旱調控機制研究，挖掘抗寒性狀相關基因并加以驗證，可為新品種的分子輔助篩選及定向育種提供新的技術手段和理論依據(jù)。