三個釀酒葡萄品種及其營養(yǎng)系果實香氣物質譜的差異性分析

夏弄玉，陳倬，程昊天，潘秋紅

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院葡萄與葡萄酒研究中心/農業(yè)農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

香氣物質的組成及含量是衡量葡萄果實及葡萄酒品質的重要指標，直接影響著消費者的認可程度。葡萄果實中的香氣物質主要來自類異戊二烯代謝、脂肪酸代謝及氨基酸代謝[1]，分別產生萜烯類和降異戊二烯類物質，直鏈醛、醇、酯、酸類物質，芳香族類、支鏈脂肪族類和吡嗪類化合物[2]。香氣物質的組成與含量不僅取決于品種、營養(yǎng)系、樹齡、砧木和成熟度等內在因素，也受土壤、光照、溫度和栽培技術等外在因素的影響[3]，其中，品種在很大程度上決定了葡萄及其加工產品香氣的典型性[4]。根據果實中游離態(tài)萜烯含量情況，葡萄品種可分為麝香型（游離態(tài)萜烯可高達6 mg·L-1）、非麝香芳香型（游離態(tài)萜烯通常為1～4 mg·L-1）、非芳香型（游離態(tài)萜烯低于1 mg·L-1）。常見的麝香型釀酒葡萄品種包括‘小白玫瑰’‘瓊瑤漿’‘亞歷山大麝香’等；非麝香芳香型包括‘雷司令’‘肯納’‘米勒·圖高’等；非芳香型包括‘霞多麗’‘赤霞珠’等[5-7]。

關于不同品種之間葡萄果實香氣物質組成和含量分析已有很多研究，其中大多是針對當地新引進的或新培育的品種[8]、原產當地的品種[9]、或當地種植較為廣泛并具特色的品種[10]。例如Lan等[11]對比了原產于我國的6個刺葡萄品種（白葡萄、高山1號、高山2號、澀葡萄、米葡萄和甜葡萄），發(fā)現‘甜葡萄’有相對較高含量的萜烯、降異戊二烯、高級醇和芳香族氨基酸。Ju等[12]對比了刺葡萄不同品種及營養(yǎng)系成熟果實中的脂肪酸及其衍生的C6/C9香氣物質發(fā)現，‘高山4號’和‘白葡萄1號’中C6、C9的含量相對較高。相似地，關于不同營養(yǎng)系之間果實香氣物質也有許多報道，譚偉等[4]對比了5個‘赤霞珠’、3個‘美樂’及3個‘品麗珠’營養(yǎng)系的成熟果實及其所釀葡萄酒的香氣物質，結果表明，‘赤霞珠685’‘赤霞珠169’‘品麗珠327’和‘美樂348’在果實香氣中表現較好，‘赤霞珠338’‘赤霞珠170’‘美樂181’和‘品麗珠409’在葡萄酒香氣中表現較好。上述這些研究多采用成熟果實進行，目的是為品種適應性評價和推廣應用提供依據。也有學者比較了當地常見的葡萄品種果實發(fā)育過程中香氣物質積累的差異[13-14]，以期為栽培調控或葡萄酒生產提供參考。有些研究則著重于不同品種某一類香氣物質的積累，例如，Qian等[15]發(fā)現，‘香妃’‘摩爾多瓦’‘塔明娜’‘圣誕玫瑰’‘亞歷山大麝香’等鮮食品種在果實發(fā)育過程中具有“綠葉”氣味的己醛、己醇等組分的積累存在差異，且與關鍵酶基因VvLOXA的表達呈正相關，研究旨在揭示不同品種間果實特定香氣物質合成代謝的差異，為代謝調控的深入研究奠定基礎。有些學者也探究了不同品種或營養(yǎng)系釀造的葡萄酒香氣輪廊的差異[16-19]，但研究結果多基于實驗室的小型發(fā)酵酒。由上可見，了解品種或營養(yǎng)系間香氣物質的異同對于葡萄選育種和適應性評價以及相應葡萄酒產品開發(fā)均有重要意義。目前已有的報道涉及的品種很多，結果也不盡相同，原因主要與參照系有關，也受葡萄種植地氣候生態(tài)條件的影響。由于果實香氣物質含量易受環(huán)境因素的影響，因此簡單地對比各組分含量的差異，難以反映品種或營養(yǎng)系間的內在差別，有必要采用多元統(tǒng)計方法，從眾多變量中篩選有價值的信息。

本研究以3個歐亞種白色釀酒葡萄品種麝香型‘小白玫瑰’、非麝香芳香型‘雷司令’和非芳香型 ‘霞多麗’以及它們各兩個營養(yǎng)系的果實為試材，采用氣相色譜質譜法（GC-MS）結合標準品絕對定量或半定量，分析了4個發(fā)育期果實香氣物質的含量，采用主成分分析（PCA）探究品種間的差異；采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）營養(yǎng)系間的差異，以期為葡萄品質評價提供新的思路，也為葡萄果實香氣代謝調控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

葡萄果實分別來源于3個品種的兩個營養(yǎng)系：‘小白玫瑰’包括嫁接于‘5BB’砧木上的826和455營養(yǎng)系（簡稱M826和M455），‘雷司令’為C49自根苗和嫁接于‘1103P’砧木上的C49嫁接苗（簡稱R-C49和R-1103P），‘霞多麗’包括了嫁接于‘1103P’砧木上的76營養(yǎng)系和嫁接于‘5BB’砧木上的277營養(yǎng)系（簡稱C76和C277）。于2018年采自北京市海淀區(qū)中國農業(yè)大學上莊實驗站葡萄品種園（40°08′12.15″N，116°10′44.83″E），南北行向，行距2.5 m，株距1.2 m，廠形架式，所有品種和營養(yǎng)系均采用相同栽培管理模式。

1.1.2 試劑

氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純，購自北京藍弋化工產品有限公司；D-葡萄糖酸內酯購自中國上海Sangon Biotech公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、4-甲基2-戊醇（內標）及香氣標準品均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

PAL-1手持糖度計購自日本ATAGO公司；pH計購自上海Mettler-Toledo公司；A11果實研磨機購自德國艾卡公司；TGL-16M高速冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；6890GC-5975B MS氣相色譜-質譜聯用儀購自美國Agilent Technologies公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄果實采集

采樣時，在不同果穗的上、下、左、右、前、后位置隨機采集果實，每一行的陰面及陽面均勻隨機采樣。以可溶性固形物含量為基礎，結合田間觀察到的果實硬度和轉色情況，按照改進的E-L系統(tǒng)對果實發(fā)育物候期進行判斷[20]，分別采集轉色前E-L34（開始變軟、糖度開始增加）、轉色時E-L35（白葡萄果實開始變軟褪綠并膨大）和轉色后E-L36（中等糖度）、E-L37（接近成熟）的樣品各200粒，其中50粒用于可溶性固形物和可滴定酸的測定，剩下的用液氮速凍，并保存于-80℃的冰箱中，用于后續(xù)香氣物質的檢測。

果實在E-L34時可溶性固形物為6.0%～7.7%，可滴定酸為29.03～37.25 g·L-1；E-L35時可溶性固形物為10.1%～12.2%，可滴定酸為16.04～17.5 g·L-1；E-L36時可溶性固形物為13.7%～14.3%，可滴定酸為10.19～10.61 g·L-1；E-L37時可溶性固形物為14.5%～16.2%，可滴定酸為7.25～9.92 g·L-1。

1.3.2 葡萄果實香氣物質提取

采用實驗室前期建立的方法并適當修改[20]。取冷凍葡萄約50 g，去梗后置于研缽中砸碎去籽，記錄粒數、去梗質量及籽質量。加入1 g PVPP（防止氧化褐變）和0.5 g D-葡萄糖酸內酯（避免氧化），并用研磨機磨至粉末狀，在整個過程中需加入足量的液氮，使葡萄果實處于冷凍狀態(tài)。將粉末置于50 mL離心管中，于4 ℃下靜置化凍8 h后，在4 ℃、8000 r·m-1條件下離心10 min，取上清葡萄汁。

1.3.3 頂空固相微萃取

依次向15 mL樣品瓶中加入1.00±0.01 g NaCl（鹽析，促進香氣組分揮發(fā)），5 mL澄清葡萄汁及10 μL內標（1.0018 g·L-1的4-甲基-2-戊醇水溶液），迅速用帶聚四氟乙烯隔墊的蓋子密封。樣品瓶通過磁力加熱40 ℃攪拌30 min，將活化后的頂空固相微萃取頭（50/30 μm聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯萃取頭，CAR/PDMS/DVB）插入樣品瓶頂空部分，在40 ℃下再攪拌30 min進行萃取。萃取完成后，萃取頭立即轉移至氣相進樣口進樣[20]。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Agilent 19091N-136 HP-INN0Wax Polythylene Glycol（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃，解析時間8 min；升溫程序：柱箱初始溫度為50 ℃，保持1 min，然后以3 ℃·min-1的速度升溫至220 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速為1.0 mL·min-1；模式為不分流[20]。

1.3.5 質譜條件

接口溫度為280 ℃；以電子轟擊離子源（Electron Impact，EI）；電離能為70 ev；離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃；質量掃描范圍為30～350 u[20]。

1.3.6 定性定量分析

根據各物質的保留時間、保留指數及質譜信息，與標準品及NIST標準譜庫對比進行定性。計算香氣物質的峰面積與內標物質峰面積之比，對于已有標準品的香氣物質而言，直接將峰面積比代入標準曲線進行絕對定量；對于沒有標準品的香氣物質，利用具有相同官能團或相似碳原子數的標準品進行相對定量（半定量）[20]。采用模擬汁（200 g·L-1葡萄糖，7 g·L-1酒石酸，用5 mol·L-1NaOH溶液調節(jié)pH至3.3）配制混合標準品溶液，并稀釋至12個梯度[21]；設置與樣品同樣參數條件進行上機，得到香氣標準品每個濃度對應的峰面積比后，經擬合得到標準曲線。每個數據點來自于兩個生物學重復和兩個技術重復的平均值。

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

香氣物質定性采用A M D I S軟件，定量采用ChemStation，用IBM SPSS Statistics 21進行獨立樣本t檢驗（P＜0.05），用R4.1.0進行單因素AVONA分析（Duncan 檢驗，P＜0.05），繪制主成分分析（PCA）的得分圖，計算各物質載荷得分，繪制柱形圖，用SIMCA 14.1進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），用Microsoft Excel 2019對數據進行折線圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 不同品種果實中香氣組成的差異

對所測定的香氣物質按類型歸類，分析其差異，結果如表1所示。在所檢測的4個發(fā)育期，萜烯含量始終表現為小白玫瑰＞雷司令＞霞多麗。與預想的一樣，萜烯是區(qū)分這些品種最主要的香氣物質。此外，除E-L34時期，‘小白玫瑰’中直鏈醇的含量在3個品種中也最高；除E-L37時期直鏈醛的含量在品種間差異不大之外，在E-L34至E-L36時期，‘小白玫瑰’中直鏈醛的含量均在3個品種中最低，暗示著‘小白玫瑰’有較強的醛-醇轉化活性。而對于降異戊二烯衍生物，其含量并沒有明顯的品種特異性，但有意思的是，‘雷司令’自根苗R-C49果實中的降異戊二烯不足嫁接苗R-1103P的50%，這表明嫁接有利于該類香氣物質的顯著積累。而觀察各組分含量發(fā)現，在所研究的4個發(fā)育時期，自根苗R-C49果實中均未檢測到香葉基丙酮。在E-L34至E-L35時期，‘霞多麗’中芳香族化合物含量為3個品種最高。

表1 不同品種（營養(yǎng)系）葡萄果實發(fā)育過程中不同類型香氣物質含量的差異Table 1 Differences in contents of different type aroma compounds in grape berries of cultivars (clones) during development μg·kg-1

2.2 不同品種果實香氣物質的PCA分析

為直觀地了解不同品種香氣物質在不同發(fā)育階段的整體差異，分別以4個發(fā)育期所檢測到的所有香氣物質為變量，對不同葡萄果實中的香氣物質進行PCA分析，結果如圖1所示。PC1和PC2分別解釋了總方差的33.23%～35.38%和14.86%～17.95%。在E-L34至E-L37時期，‘小白玫瑰’可以清楚地通過PC1與‘雷司令’和‘霞多麗’分開。毫無疑問，‘小白玫瑰’的香氣物質譜與另兩個品種有非常明顯的不同，這是該品種的基因型決定的；從E-L35時期開始，M455和M826產生了分離，暗示著隨著果實發(fā)育，‘小白玫瑰’營養(yǎng)系中香氣物質積累差異增大?！姿玖睢汀级帑悺瘍善贩N處于PC1正軸。值得注意的是，隨著果實發(fā)育進程，在PC2上逐漸靠近，表明它們之間香氣物質譜的整體差異在縮小。

圖1 不同發(fā)育期3個品種果實中香氣物質的PCA分析Figure 1 The PCA analysis of the aroma compounds in grape berries of three cultivars in different growth stages

續(xù)表2

續(xù)表2

為進一步了解在PCA中品種間差異的主要組分，將在PC1上得分絕對值大于0.19的物質進一步分析。如表2所示，在4個發(fā)育期，‘小白玫瑰’與另外兩個品種之間有21個差異明顯的香氣物質，其中，降異戊二烯類的6-甲基-5-庚烯-2-酮和18個萜烯類化合物（D-檸檬烯、別羅勒烯、α-萜品油烯、α-萜品烯、γ-萜品烯、cis-β-羅勒烯、trans-β-羅勒烯、二氫對傘花烴、對傘花烴、cis-氧化里那醇、香茅醇、香葉醇、4-萜品醇、trans-呋喃型氧化里那醇、橙花醚、β-水芹烯、α-萜品醇、β-里那醇）均顯著高于‘雷司令’和‘霞多麗’；而除cis-氧化里那醇、香茅醇、香葉醇、4-萜品醇、trans-呋喃型氧化里那醇、橙花醚在‘雷司令’和 ‘霞多麗’中的含量差異不明顯外，其他萜烯在‘雷司令’中的含量均顯著高于‘霞多麗’。相反，‘小白玫瑰’中鄰乙基甲苯和1-壬醇的含量顯著低于‘雷司令’和‘霞多麗’。除鄰乙基甲苯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-里那醇外，其他物質均對M455和M826之間的差異有所貢獻。

表2 葡萄果實主要差異香氣物質含量的比較Table 2 Comparison of the content of the main differential aroma compounds in three cultivars

2.3 營養(yǎng)系間果實香氣物質的OPLS-DA分析

為了解營養(yǎng)系間的主要差異香氣物質，對同一品種兩個營養(yǎng)系的香氣物質做了進一步的OPLS-DA分析。由圖2（A、B、C）可知，同一品種兩個營養(yǎng)系之間均能夠清楚分開；從圖2（D、E、F）中篩選出VIP值大于1的物質，認定其為主要差異香氣物質。其中，‘小白玫瑰’和‘霞多麗’不同營養(yǎng)系中的差異香氣物質均為C6化合物己醛和(E)-2-己烯醛，而R-C49和R-1103P之間的差異香氣物質為苯乙醛、橙花醚、葡萄螺烷、苯甲醛、β-大馬士酮。

圖2 不同營養(yǎng)系葡萄果實發(fā)育過程中香氣物質的正交最小偏二乘分析Figure 2 The OPLS-DA analysis of aroma compounds in developing grape berries of different clones of different cultivars

進一步分析不同營養(yǎng)系葡萄果實中的差異代謝香氣物質在發(fā)育過程中的變化（圖3）。總體上，M455果實中的己醛和(E)-2-己烯醛的含量要高于M826，其變化趨勢有所不同。在M455中，兩個化合物均呈現上升趨勢，而在M826中的變化趨勢呈現先上升后下降的趨勢，其含量在E-L36時期達到最高，這與文獻報道一致[22]。而在‘霞多麗’中，雖然有些數據點的己醛含量在兩個營養(yǎng)系間沒有統(tǒng)計學上的顯著差異，但總體而言，C277果實中己醛和(E)-2-己烯醛的含量高于C76。

圖3 ‘小白玫瑰’和‘霞多麗’不同營養(yǎng)系的果實中己醛和(E)-2-己烯醛的變化Figure 3 The change of hexanal and (E)-2-hexenal content in grape berries of different clones of 'Muscat Blanc' and 'Chardonnay'

‘雷司令’兩個營養(yǎng)系之間的主要差異物質有5個。由圖4可見，總體上，嫁接的R-1103P中它們的含量要低于自根的R-C49，尤其在后兩個時期，R-C49果實中有花香和果香氣味貢獻的橙花醚、葡萄螺烷、β-大馬士酮和苯乙醛的含量明顯較高，從這些化合物在果實發(fā)育過程中的變化可以認為，嫁接使‘雷司令’果實轉色前后橙花醚、葡萄螺烷、β-大馬士酮含量下降的幅度增大，而減緩了苯乙醛上升的幅度。

3 討論

PCA結果表明，‘小白玫瑰’的香氣物質譜與‘雷司令’和‘霞多麗’有很明顯的不同，主要差別在于萜烯類化合物，這與‘小白玫瑰’作為麝香型葡萄品種的典型代表是相符的。同時，該結果也證實了萜烯受基因型的顯著影響[23]，是葡萄香氣育種的靶標化合物[24]。萜烯具有玫瑰花、茉莉花、荔枝、柑橘等花果香氣味[25]，通過麝香型品種與其他品種的雜交有望改善葡萄的香氣品質，獲得具有目標香氣的新品種。研究也發(fā)現，盡管非麝香芳香型‘雷司令’果實中萜烯的含量在4個發(fā)育期均顯著高于非芳香型的‘霞多麗’，但PCA分析顯示，隨著果實發(fā)育兩個品種整體香氣物質譜差異縮小，這種現象類似于Kalua等人的研究[14]，他們發(fā)現，‘雷司令’和‘赤霞珠’香氣物質在轉色前差異最大?！姿玖睢蠧6醛在轉色后比‘赤霞珠’中更為豐富，而‘赤霞珠’中苯類衍生物的含量要比‘雷司令’中更高[14]。本文結果表明，芳香族化合物除與上述報道一致外，直鏈醛在‘霞多麗’中的含量較高。

圖4‘雷司令’不同營養(yǎng)系的果實中差異香氣物質變化Figure 4 The change of main differential compounds in berries of different clones of 'Riesling'

降異戊二烯和萜烯均產生于類異戊二烯途徑。本研究發(fā)現，盡管嫁接降低了‘雷司令’中β-大馬士酮的含量，但自根苗R-C49中降異戊二烯類物質的總量只有嫁接苗R-1103P中的50%甚至更低，這主要歸因于自根苗果實中香葉基丙酮未檢出，原因有待于進一步研究。從本研究結果看，雖然嫁接降低了某些組分的含量，但提高了降異戊二烯類物質的總量，推測可能改變了葡萄果實中香氣物質的代謝流向，豐富了葡萄果實中的香氣組成。此外，砧木嫁接還可以提高葡萄的抗性[26]。該結果提示我們，降異戊二烯衍生物含量沒有明顯的品種依賴性，通過品種間雜交改善降異戊二烯衍生物含量將面臨極大挑戰(zhàn)，而選擇合適的砧木嫁接可能是一個有效的手段，而嫁接如何影響降異戊二烯合成代謝，是一個值得進一步研究的課題。

‘小白玫瑰’和‘霞多麗’不同營養(yǎng)系之間的主要差異香氣物質均為C6組分己醛和(E)-2-己烯醛，他們均具有青草、綠葉等氣味[27-28]。C6醛類物質產生于脂氧合途徑，在葡萄果實中含量最為豐富，這是葡萄果實香氣物質代謝譜的共同特點[14]，但這類化合物的感官閾值較高，對果實香氣品質的直接貢獻極其有限，尤其在葡萄酒發(fā)酵過程中，C6醛含量迅速下降，轉化為相應的醇，或進一步生成感官閾值較低的有果香氣味的酯類物質[29-30]。因此認為，無論是對于‘小白玫瑰’還是‘霞多麗’品種，它們的兩個營養(yǎng)系對于最終葡萄酒香氣感官影響沒有明顯差異，均可進行后續(xù)的推廣應用。綜上所述，要利用多元統(tǒng)計分析方法對品種、營養(yǎng)系的品質進行評價，而非僅關注單個或單類組分的變化。