葡萄根癌病病原菌中效應(yīng)蛋白Tae4與其免疫蛋白Tai4的鑒定與分析

王鵬飛，袁麗芳，張慶田，王海利，慕茜，王欽超，韓金濤，趙紅軍

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250100；3. 山東師范大學(xué)，山東濟(jì)南 250014；4. 龍口市省級(jí)農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會(huì)，山東龍口 265701；5. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100）

葡萄根癌病是一種細(xì)菌性病害，由葡萄根癌病病原菌引起。葡萄根癌病通常在夏季發(fā)病，對(duì)葡萄極具破壞性。根癌病病原菌可引起葡萄產(chǎn)量的下降，甚至導(dǎo)致葡萄藤的枯死[1]。最早被發(fā)現(xiàn)的葡萄根癌病病原菌是Agrobacterium vitis[1-2]。后來，根癌病病原菌Agrobacterium tumefaciens也從葡萄根部被分離出來，說明A. tumefaciens株系也能侵染葡萄，引發(fā)根癌病[2]。葡萄根癌病病原菌對(duì)葡萄的侵染可以分為3個(gè)步驟：第一步是致病菌侵入到葡萄的非原質(zhì)體部位，匯集在葡萄的根部，再通過根部的傷口入侵[3-4]；第二步，病原菌在葡萄的木質(zhì)部定殖；第三步，通過葡萄木質(zhì)部的液流散布到葡萄的各個(gè)器官和部位[5]。

根癌病病原菌的致病效應(yīng)子VirA和VirG作為毒力蛋白可以促進(jìn)根癌病病原菌對(duì)葡萄的侵染[1]。狹義上，效應(yīng)子（又名效應(yīng)蛋白）可以被定義為一類有利于致病菌侵染植物的蛋白質(zhì)。當(dāng)植物的致病菌分泌效應(yīng)蛋白后，還必須將這些效應(yīng)蛋白運(yùn)輸至植物寄主的精確亞細(xì)胞位置才能發(fā)揮功能，協(xié)助致病菌入侵植物。目前，大量的致病菌效應(yīng)蛋白被報(bào)道，這些相關(guān)研究的增多使得效應(yīng)子的特征被逐步分析和明確。研究顯示，效應(yīng)蛋白有如下特征：（1）具有信號(hào)肽；（2）無跨膜區(qū)域；（3）包含的氨基酸少于300個(gè)；（4）富含半胱氨酸；（5）具有已知的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域；（6）與已知蛋白功能無同源性等[6]。

六型分泌系統(tǒng)（The type VI secretion system；T6SS）是存在于根癌病病原菌等革蘭氏陰性菌中的分泌系統(tǒng)，因?yàn)槟芊置谝恍┡c致病相關(guān)的效應(yīng)子，并與病原菌致病能力密切相關(guān)。然而，人們對(duì)六型分泌系統(tǒng)分泌的非致病效應(yīng)子蛋白研究的較少。目前研究表明，六型分泌系統(tǒng)在細(xì)菌競爭中也發(fā)揮重要作用。有一種六型分泌系統(tǒng)分泌的非致病效應(yīng)蛋白稱為Tae4蛋白，在分泌Tae4蛋白后，會(huì)系統(tǒng)性地轉(zhuǎn)運(yùn)Tae4蛋白并注射到附近細(xì)菌的周質(zhì)空間中。而這種非致病相關(guān)的Tae4效應(yīng)蛋白具有酰胺酶活性，可以水解細(xì)菌的肽聚糖進(jìn)而殺死附近的競爭細(xì)菌[7]。有的細(xì)菌可免受自身分泌Tae4蛋白的傷害，是因?yàn)槠淞头置谙到y(tǒng)可分泌一種Tai4，它是Tae4蛋白的免疫蛋白。目前有兩種根癌病病原菌A. tumefaciens株系（ATU4346和ATU4347）被發(fā)現(xiàn)含有Tai4蛋白和Tae4蛋白[8]。由于這兩個(gè)株系缺少完整的基因組，因此無法進(jìn)行全基因組范圍的Tai4蛋白和Tae4蛋白家族成員鑒定。本研究以具備完整基因組的18個(gè)A. tumefaciens和4個(gè)A. vitis株系為對(duì)象，鑒定這些菌株中含有Tai4蛋白和Tae4蛋白家族成員的確切數(shù)目，并分析該蛋白家族成員的特性。對(duì)其Tai4蛋白和Tae4蛋白的鑒定與分析可為將來研究如何借助Tae4對(duì)一些致病菌進(jìn)行殺滅奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葡萄根癌病病原菌基因組數(shù)據(jù)的獲得

18個(gè)A. tumefaciens株系完整基因組以及全部蛋白序列信息下載于NCBI的A. tumefaciens基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/177/），株系名稱分別是：BIMB-1315G、1D1609、CFBP6623、12D1、CFBP6624、186、6N2、1D1460、EML4、CFBP7129、1D1108、6A、15955、FDAARGOS、BIM B-441、CFBP5499、CFBP5877、Q15_94。4個(gè)A.vitis株系完整基因組及其全部蛋白序列信息來源于NCBI的基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1215/），株系名稱分別是：VAR06-30、VAR03-1、S4以及VAT03-9。

1.2 葡萄根癌病病原菌Tae4和Tai4蛋白家族成員鑒定

用HMMER軟件，基于Tae4結(jié)構(gòu)域（Tae4 domian；Pfam編號(hào)為PF14113）的隱馬克夫模型（Hidden Markov Model，HMM），分別搜索18個(gè)A. tumefaciens株系和4個(gè)A. vitis株系基因組中全部Tae4蛋白，從而鑒定2種葡萄根癌病病原菌的Tae4蛋白家族成員。利用在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）確定蛋白是否具有完整的Tae4結(jié)構(gòu)域，剔除無完整Tae4結(jié)構(gòu)域的蛋白。

用HMMER軟件，基于Tai4結(jié)構(gòu)域（Tai4 domian；Pfam編號(hào)為PF16695）的隱馬克夫模型，分別搜索18個(gè)A. tumefaciens株系和4個(gè)A. vitis株系基因組中全部Tai4蛋白，從而鑒定2種葡萄根癌病病原菌的Tai4蛋白家族成員。利用在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）確定蛋白是否具有完整的Tai4結(jié)構(gòu)域，剔除無完整的Tai4結(jié)構(gòu)域蛋白。

1.3 葡萄根癌病病原菌Tae4和Tai4蛋白家族成員亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用在線軟件TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預(yù)測(cè)Tae4和Tai4蛋白家族成員的亞細(xì)胞定位；利用在線軟件NLStradamus（http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/）分析核定位信號(hào)。設(shè)置參數(shù)為：Prediction Cutoff＝0.6；用TMHMM2.0軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析信號(hào)肽。

1.4 多重序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析

利用ClustalX 2.0軟件對(duì)Tae4和Tai4蛋白家族成員進(jìn)行蛋白多重序列比對(duì)分析；用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，方法為鄰接法（Neighbor-Joining tree）。設(shè)置參數(shù)為：自舉值（bootstrap value）被計(jì)算1000次。bootstrap value大于70的分支認(rèn)為是1個(gè)組[9]。利用在線軟件Topo-phylogeny（http://bar.utoronto.ca/Topophylogeny/）進(jìn)行進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

1.5 蛋白基序分析

利用在線軟件MEME suite 5.3.3（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析Tae4和Tai4蛋白家族成員的保守蛋白基序（motif）。設(shè)置參數(shù)為：motif發(fā)現(xiàn)數(shù)量=10，motif長度范圍為10～200個(gè)氨基酸[9]。

1.6 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用在線軟件STRING（https://string-db.org/）分析Tae4和Tai4蛋白家族成員與其他蛋白的互作。數(shù)據(jù)庫中A.tumefaciens蛋白互作數(shù)據(jù)來自株系CCNWGS0286。

1.8 選擇壓力分析

利用軟件PAML包中的Code ml program（version 4.7）[10]分析Tae4蛋白編碼基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力。利用PAML軟件中的3個(gè)選擇壓力位點(diǎn)模型分析。利用位點(diǎn)模型M0（one ratio）分析整體受到的選擇壓力；利用位點(diǎn)模型M8（βandω）貝葉斯分析法（Bayesian Analysis）鑒定Tae4基因進(jìn)化過程中的正向選擇位點(diǎn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄根癌病病原菌中Tae4與Tai4的鑒定與蛋白性質(zhì)分析

目前，NCBI公布的根癌農(nóng)桿菌基因組數(shù)據(jù)包含18個(gè)A. tumefaciens和4個(gè)A. vitis的完整基因組。在18個(gè)A. tumefaciens株系的基因組中鑒定了14個(gè)Tae4基因，在4個(gè)A.vitis株系的基因組中鑒定了1個(gè)Tae4基因和1個(gè)Tai4基因。其中，A. tumefaciens物種中只有BIMB-1315G、1D1609、CFBP6623、12D1、CFBP6624、186、6N2、1D1460、EML4、CFBP7129、1D1108、6A、15955、FDAARGOS株系中發(fā)現(xiàn)各有1個(gè)Tae4基因，其他株系中未發(fā)現(xiàn)，且這18個(gè)株系基因組中均未發(fā)現(xiàn)存在Tai4基因。A. vitis物種中只有VAR06-30株系基因組中被發(fā)現(xiàn)1個(gè)Tae4基因和1個(gè)Tai4基因。并且發(fā)現(xiàn)，14個(gè)A. tumefaciensTae4基因都存在線形染色體（linear chromosome），而1個(gè)A. vitisTae4基因和1個(gè)A. vitisTai4基因存在A. vitisVAR06-30株系的環(huán)狀染色體（circular chromosome）。

本文發(fā)現(xiàn)的Tai4基因編碼蛋白都含有Tae4結(jié)構(gòu)域（Pfam編號(hào)為PF14113），其中的A. tumefaciensTae4蛋白都含有EAGR_box結(jié)構(gòu)域（Pfam編號(hào)為PF16713）。本文發(fā)現(xiàn)的唯一A. vitisTai4蛋白含有1個(gè)Tai4結(jié)構(gòu)域（Pfam編號(hào)為PF16695）和1個(gè)Paramyxo_PCT結(jié)構(gòu)域。此外，用于預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域的SMART軟件還檢測(cè)到A.vitisTai4蛋白含有一段長度為22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，序列為“MMYRLLLLGLVGLCVNSQIAAA”。

通過檢測(cè)15個(gè)Tae4蛋白和1個(gè)Tai蛋白的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，15個(gè)Tae4蛋白都各自包含166個(gè)氨基酸，其半胱氨酸均分別占各自氨基酸含量的1.8%；Tai4蛋白包含151個(gè)氨基酸，其半胱氨酸占自身氨基酸含量的2%。A. vitisTae4蛋白的等電點(diǎn)是8.96，分子量是18 446.84；A. vitisTai4蛋白的等電點(diǎn)是6.71，分子量是16 749.02。A. tumefaciens株系CFBP6623和CFBP6624的Tae4蛋白的等電點(diǎn)是8.81，其他12個(gè)都是9.05；A. tumefaciens的14個(gè)株系Tae4蛋白的分子量在18 214.44到18 353.57之間。15個(gè)Tae4蛋白與其他效應(yīng)子一樣不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，A. vitisTai4蛋白也不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)預(yù)測(cè)，15個(gè)Tae4蛋白與A. vitisTai4蛋白都是GPI錨定蛋白，定位于線粒體。先前的研究顯示，促進(jìn)致病菌侵染植物的效應(yīng)子都含有信號(hào)肽[6]。本研究結(jié)果顯示，A. vitisTae4蛋白被預(yù)測(cè)含有信號(hào)肽的可能性略高于14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白。在線軟件SignalP分析結(jié)果也顯示，A. vitisTai4蛋白含有信號(hào)肽。

疏水性分析結(jié)果顯示，A. vitisTae4蛋白疏水氨基酸和親水氨基酸的分布與A. tumefaciensTae4蛋白略有差異。而本次鑒定出的1個(gè)Tai4蛋白和15個(gè)Tae4蛋白既不屬于親水蛋白質(zhì)也不屬于疏水蛋白質(zhì)（圖1）。

圖1 蛋白的疏水性分析結(jié)果Figure 1 Hydrophobicity analysis of protein

2.2 蛋白序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析

將14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白利用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，A. tumefaciensTae4蛋白比較保守，14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白之間的相似度較高。相對(duì)而言，A. tumefaciens株系CFBP6623和CFBP6624的Tae4蛋白相對(duì)于其他12個(gè)蛋白在4個(gè)氨基酸位點(diǎn)上有差異，與其他Tae4蛋白差別最大（圖2 A）。A. tumefaciens株系FDAARGOS_1048的Tae4基因的起始密碼子是TCA，終止密碼子是CAT，而其他A. tumefaciensTae4蛋白的起始密碼子都是ATG，終止密碼子都是TGA。A. tumefaciens株系FDAARGOS_1048的Tae4蛋白序列并未因起始密碼子和終止密碼子的區(qū)別而有顯著差異，其蛋白序列與大部分A. tumefaciensTae4蛋白相似度高，極為保守（圖2 A）。而將14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白和A. vitisTae4蛋白利用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，A. tumefaciensTae4蛋白和A. vitisTae4蛋白相似度不高，而A. vitisTae4蛋白和A. vitisTai4蛋白的相似度也不高（圖2 B）。

圖2 蛋白比對(duì)結(jié)果Figure 2 Alignment of proteins

利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白可以被分為2組。一組包含A. tumefaciens株系CFBP6623和CFBP6624的Tae4蛋白，另一組包含其他12個(gè)蛋白。A. vitisTae4蛋白不屬于這兩個(gè)組，獨(dú)立成為一個(gè)孤兒蛋白（圖3）。利用在線軟件Topo-phylogeny分析MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析顯示，該15個(gè)Tae4蛋白可以被分為3組：一組包含A. tumefaciens株系CFBP6623和CFBP6624的Tae4蛋白，另一組包含其他12個(gè)蛋白，第三組包含A. vitisTae4蛋白。進(jìn)化樹的分析結(jié)果與ClustalX 2.0軟件比對(duì)結(jié)果高度一致。

圖3 15個(gè)Tae4蛋白的進(jìn)化樹分析結(jié)果Figure 3 The evolutionary tree of 15 Tae4 proteins

2.3 葡萄根癌病病原菌中Tae4與Tai4蛋白結(jié)構(gòu)及互作分析

利用在線軟件MEME suite 5.3.3分析了15個(gè)Tae4蛋白和1個(gè)Tai4蛋白的保守基序（motif）。結(jié)果顯示，14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白中可以鑒定出2個(gè)保守基序，其中motif1長達(dá)71個(gè)氨基酸，motif2包含19個(gè)氨基酸。15個(gè)根癌病病原菌Tae4蛋白間可以鑒定出10個(gè)保守基序，每個(gè)保守基序都含有10個(gè)氨基酸。這10個(gè)保守基序在A. tumefaciensTae4蛋白和A. vitisTae4蛋白中排序不同。

利用在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)了15個(gè)Tae4蛋白和1個(gè)Tai4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。由圖4可見，A. tumefaciensTae4蛋白和A. vitisTae4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有所區(qū)別。A. tumefaciensTae4蛋白結(jié)構(gòu)與SWISS-MODEL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的模板6ijf.1.C具有93.87%的相似度。該模板的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)來源于A. tumefaciensATU4346和 ATU4347株系中的Tae4蛋白的晶體結(jié)構(gòu)[8]。A. vitisTae4蛋白結(jié)構(gòu)與SWISS-MODEL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的模板蛋白4jur.1.A具有41.14%的相似度，且最接近這個(gè)模板蛋白。該模板蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)來源于陰溝腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的Tae4蛋白晶體結(jié)構(gòu)[12]。此外，利用在線軟件STRING分析兩種葡萄根癌病病原菌Tae4和Tai4蛋白家族成員在各自物種中與其他蛋白的互作，結(jié)果顯示，A. tumefaciensTae4可與10個(gè)蛋白互作，包括溶血素協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白（Hemolysin-coregulated protein，HCP）、六型分泌系統(tǒng)蛋白VasG等（圖5）。而除了A. vitisTae4蛋白和A. vitisTai4蛋白二者能互作外，沒有預(yù)測(cè)到這兩個(gè)蛋白在A. vitis物種中能與其他蛋白互作。分析基于STRING數(shù)據(jù)庫中A. tumefaciens株系CCNWGS0286版本的數(shù)據(jù)。

圖4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 4 The 3D structure of the protein

圖5 STRING分析A. tumefaciens Tae4蛋白與物種中其他蛋白互作的結(jié)果Figure 5 STRING analysis of A. tumefaciens Tae4 proteins with other proteins in species

2.4 兩種葡萄根癌病病原菌中Tae4蛋白編碼基因的選擇壓力

將14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白的編碼基因作為一個(gè)整體進(jìn)行選擇壓力分析，PAML軟件的M0模型分析結(jié)果顯示，A. tumefaciensTae4蛋白編碼基因整體遭受純化選擇（dN/dS＝0.3719）。用PAML軟件只在14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白的編碼基因中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)顯著的正向選擇位點(diǎn)（149F）。將14個(gè)A. tumefaciensTae4蛋白和1個(gè)A. vitisTae4蛋白的編碼基因作為一個(gè)整體進(jìn)行選擇壓力分析，PAML軟件的M0模型分析結(jié)果顯示，這15個(gè)Tae4蛋白的編碼基因整體遭受正向選擇（dN/dS＝2.39292）。PAML軟件M8模型用貝葉斯分析法在這15個(gè)Tae4蛋白的編碼基因中發(fā)現(xiàn)了27個(gè)顯著的正向選擇位點(diǎn)。

3 討論和結(jié)論

本研究分析了基因組被測(cè)序的18個(gè)A. tumefaciens和4個(gè)A. vitis株系的Tae4蛋白和Tai4蛋白及其編碼基因。結(jié)果顯示，18個(gè)A. tumefaciens株系基因組不是全部都含有Tae4基因，并且都不含有Tai4基因。然而，之前的研究顯示，有的A. tumefaciens株系基因組含有Tai4基因，例如ATU4346和ATU4347株系[8]。本研究的4個(gè)A. vitis株系中只有VAR06-30株系的基因組含有Tae4基因和Tai4基因。這說明，對(duì)于A. tumefaciens和A. vitis，Tae4蛋白和Tai4蛋白雖然可以做為一種攻擊其他病原菌的“武器”及自身免疫這種“武器”的防具[7]，但這兩種蛋白的編碼基因并不是該兩種葡萄根癌病病原菌生長發(fā)育所必須的基因。也說明A. tumefaciens和A. vitis不同株系基因組之間Tae4和Tai4兩個(gè)基因位點(diǎn)的變異程度較高。有的株系基因組Tae4或Tai4基因缺失可能是由于基因組發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異（Structural Variation，SV）或插入缺失（Indel）。有的A. tumefaciens株系基因組缺失了Tai4基因，說明可能存在其他機(jī)制協(xié)助這些A. tumefaciens株系抵御自身Tae4蛋白的傷害。另一種可能是這些A. tumefaciens株系的Tae4蛋白具有較小的傷害作用。而這些A. tumefaciens株系是否能抵御其他屬種的Tae4也需要進(jìn)一步研究。在A. tumefaciens株系中，Tae4基因也存在堿基突變。例如A. tumefaciens株系CFBP6623和CFBP6624相對(duì)于其他株系在Tae4基因上存在較多的非同義突變，A. tumefaciens株系FDAARGOS_1048的Tae4基因的起始密碼子和終止密碼子相對(duì)于其他株系的Tae4基因存在堿基突變，但都屬于同義突變，并沒有引起氨基酸的改變。

對(duì)于A. tumefaciens和A. vitis的Tae4蛋白性質(zhì)的分析顯示，這些葡萄根癌病病原菌的Tae4蛋白都包含少于200個(gè)氨基酸，也不含跨膜結(jié)構(gòu)域，這與之前報(bào)道的致病效應(yīng)子類似[6]。A. tumefaciens和A. vitis的Tae4蛋白共有10個(gè)保守基序，然而這些保守基序在這兩個(gè)物種中的排列順序不同。這種保守基序排列順序的差別可能導(dǎo)致了這兩個(gè)物種中Tae4蛋白較顯著的序列差異。盡管A. tumefaciens和A. vitis的Tae4蛋白都含有Tae4結(jié)構(gòu)域，并且含有較多的保守基序，但是這些保守基序排列順序的差異可能導(dǎo)致功能上的差異，本試驗(yàn)得到的蛋白互作分析結(jié)果也證明了這種差異可能存在。結(jié)果顯示，A. tumefaciensTae4可與溶血素協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白、六型分泌系統(tǒng)蛋白VasG等互作，而A. vitis的Tae4蛋白則不能。而選擇壓力分析顯示，A. tumefaciens株系的Tae4基因間遭受純化選擇，蛋白之間沒有新功能的產(chǎn)生。而A. tumefaciens和A. vitis的Tae4基因間遭受正向選擇，且鑒定出許多正向選擇位點(diǎn)，正向選擇可能會(huì)導(dǎo)致功能分歧或新功能的產(chǎn)生[13]。因此，推測(cè)不同葡萄根癌病病原菌間的Tae4基因功能可能存在差異。A. tumefaciens和A. vitis的Tae4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異也較明顯。A. vitisTae4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與陰溝腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的Tae4蛋白晶體結(jié)構(gòu)更為相似。進(jìn)化樹的結(jié)果也證明了A. tumefaciens和A. vitis中Tae4蛋白的差異較大。

綜上所述，該研究認(rèn)為，不是全部A. tumefaciens株系基因組含有Tae4基因，部分A. tumefaciens株系不含Tai4基因。說明對(duì)于A. tumefaciens和A. vitis，Tae4蛋白和Tai4蛋白雖然可以做為一種攻擊其他病原菌的“武器”及自身免疫這種“武器”的防具，但這兩種蛋白的編碼基因并非生長發(fā)育所必須的基因。A. tumefaciens和A. vitis的Tae4蛋白的氨基酸序列差異較大，不同葡萄根癌病病原菌間的Tae4基因功能可能存在差異。