分析和比較3種弧菌培養(yǎng)基的篩選性能

梁蘇育 袁峰

致病性弧菌[1-2]是危害水產(chǎn)品的重要因素，是炎天秋日臨海地區(qū)引發(fā)食物中毒的首要病原菌。應(yīng)對(duì)這類公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]的關(guān)鍵是檢出食物中毒樣品中的致病性弧菌。目前，對(duì)病原微生物檢驗(yàn)最傳統(tǒng)最常用的方法是病原體分離培養(yǎng)法，它也是檢驗(yàn)方法中的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]，而選擇科學(xué)有效的培養(yǎng)基至關(guān)重要。本研究通過(guò)將13株標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及其中4株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的混合菌接種在硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，以下簡(jiǎn)稱TCBS平板）、改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E瓊脂（modified cellobiose-polymyxin b-colistin agar，以下簡(jiǎn)稱mCPC平板）和弧菌篩選顯色平板等3種弧菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察它們的生長(zhǎng)效果，來(lái)分析和比較3種弧菌培養(yǎng)基的篩選性能，為快速準(zhǔn)確確定致病性弧菌、提高檢驗(yàn)質(zhì)量[5]提供可靠保證。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBS）、改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）瓊脂、弧菌篩選顯色平板和3%氯化鈉堿性蛋白胨水均由上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司提供；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

副溶血性弧菌（CICC 21617）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、致病性大腸埃希氏菌（CICC 10372）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ATCC 35401）、乙型副傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）、宋內(nèi)痢疾志賀氏菌（ATCC 9290）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、蠟樣芽胞桿菌（ATCC 11778）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19115）均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）、溶藻弧菌（ATCC 33787）和河流弧菌（ATCC 33809）均由無(wú)錫賽微生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（SLI-700）、生物安全柜（SG403CE）、比濁儀（生物梅里埃）。

1.4 方法

1.4.1 純菌的培養(yǎng) 副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌均用3%氯化鈉堿性蛋白胨水復(fù)蘇，大腸埃希氏菌、致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)痢疾志賀氏菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌均用營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)蘇，復(fù)蘇24 h后，用10 μL接種環(huán)各挑取1環(huán)，分別劃線接種在TCBS平板、mCPC平板和弧菌篩選顯色平板上，置（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24 h，觀察各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.4.2 混合菌的培養(yǎng) 用3%氯化鈉堿性蛋白胨水分別將副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的復(fù)蘇液稀釋成相同濁度的菌懸液，再分別從中各取0.5 mL，放入同一個(gè)無(wú)菌試管中，均勻混合，然后用10 μL接種環(huán)各挑取1環(huán)，分別劃線接種在TCBS平板、mCPC平板和弧菌篩選顯色平板上，置（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24 h，觀察每種弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.4.3 個(gè)別弧菌的再一次培養(yǎng) 1.4.1中創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌的復(fù)蘇液在TCBS平板上培養(yǎng)18～24 h后，分別用10 μL接種環(huán)各挑取單個(gè)菌落和刮取多個(gè)菌落，劃線接種在弧菌篩選顯色平板上，置（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24 h，觀察2種弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在弧菌篩選顯色平板上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 13株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

13株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。結(jié)果表明TCBS平板對(duì)致病性弧菌的選擇范圍很廣，選擇效率較高，是非特異性的，4株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均生長(zhǎng)良好，大部分雜菌受抑制，只有個(gè)別細(xì)菌生長(zhǎng)良好，比如：肺炎克雷伯菌；mCPC平板對(duì)創(chuàng)傷弧菌的選擇性最強(qiáng)，只有創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)良好，其余均被抑制；弧菌篩選顯色平板對(duì)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的選擇性強(qiáng)，其余均被抑制。

表1 13株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2 混合菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

混合菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。結(jié)果顯示TCBS平板上，在相同濃度下，發(fā)酵蔗糖的溶藻弧菌生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)，易造成假陰性；mCPC平板能很好地促進(jìn)創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，并且菌落典型單一，純度高；弧菌篩選顯色平板對(duì)副溶血性弧菌具有較好的特異性，副溶血性弧菌菌落顯紫紅色，根據(jù)顏色不同容易辨別。

表2 4株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的混合菌在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.3 2株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在弧菌篩選顯色平板上的生長(zhǎng)情況

2株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在弧菌篩選顯色平板上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。結(jié)果說(shuō)明活力強(qiáng)的創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌才能在弧菌篩選顯色平板上生長(zhǎng)，而且河流弧菌長(zhǎng)勢(shì)不好。

表3 2株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在弧菌篩選顯色平板上的生長(zhǎng)情況

3 討論

TCBS平板成分中的膽酸鈉、牛膽汁粉、硫代硫酸鈉與檸檬酸鈉及較高的PH可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和大腸菌群，而堿性環(huán)境又能促進(jìn)致病性弧菌的生長(zhǎng)，成分中的蔗糖是可發(fā)酵的糖類，是重要的鑒別劑，本研究中4株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均生長(zhǎng)良好，5株革蘭氏陰性菌和3株革蘭氏陽(yáng)性菌都受到抑制[6]，對(duì)致病性弧菌而言，它是非特異性的平板，且選擇效率較高。為使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具參考價(jià)值，本研究在傳統(tǒng)觀念選取對(duì)照雜菌的基礎(chǔ)上補(bǔ)充肺炎克雷伯菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌不受抑制，需引起重視，因?yàn)榉窝卓死撞纱嬖谟诮】等说暮粑篮湍c道中、自然界水和谷物中，所以檢測(cè)致病性弧菌的樣品中有可能混有。它能發(fā)酵蔗糖，菌落呈黃色，與某些發(fā)酵蔗糖的弧菌菌落相似，可造成假陽(yáng)性。另外，從混合菌的培養(yǎng)結(jié)果可知，TCBS平板還存在其它弊端，當(dāng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)著一定量的蔗糖發(fā)酵陽(yáng)性[7-9]的細(xì)菌時(shí)，尤其是生長(zhǎng)速度快的溶藻弧菌時(shí)，會(huì)受到干擾。它們產(chǎn)生的酸會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而擴(kuò)散，導(dǎo)致這些菌落周圍的瓊脂甚至整個(gè)培養(yǎng)基顏色由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色，當(dāng)這些菌落附近的非發(fā)酵蔗糖菌菌落被黃色色素覆蓋時(shí)，如：副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌的菌落顏色會(huì)由藍(lán)綠色變?yōu)辄S綠色或者黃色，易造成假陰性，從而降低了TCBS平板對(duì)非發(fā)酵蔗糖菌的檢出率。而且，它也不能有效地區(qū)分副溶血性弧菌和與其生化特點(diǎn)相似的創(chuàng)傷弧菌等。因此，TCBS平板適合樣品中致病性弧菌的初步分離或者致病性弧菌含量較低的樣品的分離。

mCPC平板中的多黏菌素B和多黏菌素E能抑制副溶血性弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌等非目標(biāo)菌及其它雜菌的生長(zhǎng)，纖維二糖為可發(fā)酵的糖類，創(chuàng)傷弧菌是致病性弧菌中個(gè)別能利用纖維二糖作為自己碳源的弧菌，它發(fā)酵纖維二糖，促進(jìn)生長(zhǎng)，產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基PH下降，酸堿指示劑變色，菌落呈黃色，就創(chuàng)傷弧菌來(lái)說(shuō)，mCPC平板選擇性很強(qiáng)，或者說(shuō)特異性較高，從混合菌的培養(yǎng)結(jié)果：菌落典型單一純度高，也可以證明這一特點(diǎn)。由此可見(jiàn)，mCPC平板適合樣品中創(chuàng)傷弧菌的分離，也適合樣品中創(chuàng)傷弧菌菌株的純化[10]。不過(guò)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，E型創(chuàng)傷弧菌在此培養(yǎng)基上呈假陰性。

弧菌篩選顯色平板主要通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特異性酶的顯色底物，依據(jù)菌落顯現(xiàn)出的顏色為菌種進(jìn)行初步的鑒別，簡(jiǎn)化了對(duì)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)和生化鑒定的步驟[11-12]，較明顯地提升了檢測(cè)效率，它里面的抑菌劑可抑制大部分非弧菌，顯然，它可作多種弧菌培養(yǎng)鑒別，特異性強(qiáng)，特別針對(duì)副溶血性弧菌（紫紅色菌落）效果尤佳，易生長(zhǎng)的溶藻弧菌只顯平板顏色，即使量多也不能干擾，混合菌的培養(yǎng)結(jié)果可證實(shí)這一點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)弧菌篩選顯色平板對(duì)創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌也存在抑制，活力強(qiáng)的菌株才能生長(zhǎng)，菌落形態(tài)和顏色不同，好分辨，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道只是表述這兩種弧菌可以在弧菌顯色平板上生長(zhǎng)，并未進(jìn)一步提及活力強(qiáng)的菌株，因而，本研究的結(jié)果更具有應(yīng)用方面的參考價(jià)值。綜上所述，弧菌篩選顯色平板適合樣品中副溶血性弧菌的分離，亦適合獲取樣品中活力強(qiáng)的創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌。

由于本實(shí)驗(yàn)室保藏的弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株品種有限，在3種培養(yǎng)基上的數(shù)據(jù)不夠全面，需要今后進(jìn)一步完善，這是本研究存在的局限性。

隨著科技突飛猛進(jìn)地發(fā)展，免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，逐步應(yīng)用到病原微生物檢驗(yàn)中，致使檢測(cè)的靈敏性和特異性上升，檢驗(yàn)效率提高，尤其是高通量檢驗(yàn)技術(shù)當(dāng)屬近年發(fā)展起來(lái)的前沿技術(shù)，應(yīng)用前景非常廣闊。