假酸漿毛狀根黃酮提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

張 帥，呂宏佳，李婧菲，趙 雪

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

0 引言

假酸漿又名草本酸木瓜，為茄科一年生草本植物，廣泛栽培在我國云南、廣西等地[1-2]。其全草入藥，主要功效有解毒、清熱退火、吐痰止咳等，可治療發(fā)熱、熱淋、癲癇、瘡癤等疾病[3-4]。毛狀根是由完整的植物或由植物中某一部分受到發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染后所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象[5]，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出來的毛狀根中所含的次生代謝產(chǎn)物和自然生長的植物中有相同之處，更有些被誘導(dǎo)出的毛狀根所含有的次生代謝物成分超過原植物[6]。

黃酮類化合物是植物的一種次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在自然界中，常用作抗菌劑、抗氧化劑和感光劑等，具有抗老化、調(diào)血脂、降血壓等保健功能，已成為醫(yī)藥和食品中天然抗氧化劑的開發(fā)目標(biāo)[7-8]。但目前對毛狀根中黃酮的提取率普遍不高，提高毛狀根中黃酮的提取率是進(jìn)行黃酮產(chǎn)品開發(fā)需要解決的問題。近些年，細(xì)菌的耐藥性現(xiàn)象日益嚴(yán)重，黃酮作為天然產(chǎn)物之一，其抗菌性能也備受關(guān)注[9]。分析了假酸漿植物誘導(dǎo)出的毛狀根中黃酮類化合提取工藝的優(yōu)化，并對其抑菌作用進(jìn)行評價，為提取毛狀根中黃酮類化合物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

假酸漿無菌苗，假酸漿毛狀根，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，Cef (頭孢噻肟鈉)溶液，氫氧化鈉，硝酸鋁，無水乙醇，98%濃硫酸，苯酚試劑，蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱BPX-272，光照培養(yǎng)箱SPX-300B-G，超聲儀器KQ-400KDE，立式雙層智能精密型搖床BSD-YX(F)3200，單人單面垂直凈化工作臺VS-840-1，電子天平BSA124S-cw，UV-5100型紫外可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 假酸漿毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

取假酸漿無菌苗在無菌環(huán)境中剪下其莖段(1 cm左右)放置于MS固體培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)2 d。在無菌環(huán)境滅菌的錐形瓶中倒入活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，將預(yù)培養(yǎng)好的假酸漿莖段放置于菌液內(nèi)，侵染6 min。取出被侵染的莖段，放置于無菌濾紙上，吸干表面上的菌液，將被侵染的莖段放置于MS固體培養(yǎng)基上，實行共培養(yǎng)4 d。將共培養(yǎng)好的莖段取出，放置于(含有50 mg/L青霉素)MS 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此后每 6 d 轉(zhuǎn)接一次，直至長出毛狀根后逐漸降低培養(yǎng)基中抗生素濃度進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)到25 d 時統(tǒng)計毛狀根數(shù)量，在無菌環(huán)境中建立毛狀根離體培養(yǎng)體系。

1.3.2 液體培養(yǎng)基的篩選

在無菌環(huán)境中，剪取0.2 g(鮮重)毛狀根，分別放入含有20 mLMS、White 和 N6(不含激素)的三種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為 25℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為 170 r/min。避光培養(yǎng)，待生長6 d、12 d、18 d、24 d時測增殖數(shù)，篩選出最佳液體培養(yǎng)基。

增長倍數(shù)=(收獲后鮮重-接種鮮重)/接種鮮重。

1.3.3 提取毛狀根總黃酮含量

假酸漿毛狀根樣品的制備。將培養(yǎng)后的假酸漿毛狀根從液體培養(yǎng)基取出，用無菌水反復(fù)沖洗3次，后置于烘干箱低溫(40℃)烘干，用研缽將干燥的毛狀根研磨成粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

毛狀根中黃酮的提取。準(zhǔn)確稱取2 g研磨后的假酸漿毛狀根粉末，以乙醇為溶劑，采取超聲提取法(功率為220 W)提取毛狀根中的黃酮。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。稱取3 mg蘆丁對照品置容量瓶中，加入濃度為70%乙醇30 mL進(jìn)行溶解。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。用移液管分別吸取對照品溶液0.0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別放入10 mL容量瓶中，每個容量瓶內(nèi)加入0.4 mL硝酸鈉、0.4 mL硝酸鋁和4 mL氫氧化鈉，用70%乙醇定容至刻度，混合搖勻，在510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)測出的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果計算得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=2.822 9X-0.001 9，R2=0.999 1，在0.01～0.05 mg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.4 單因素試驗

乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取干燥的毛狀根粉末2.0 g，按1∶20料液比，用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇與毛狀根粉末混合作為提取液，提取溫度設(shè)置為50℃，超聲時間設(shè)置為30 min，超聲波功率設(shè)置為220 W，檢測黃酮提取率。

提取溫度對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0 g，與70%乙醇溶液混勻，超聲功率220 W，料液比為1∶20，提取時間30 min，設(shè)置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的溫度進(jìn)行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

料液比對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取研磨后毛狀根粉末2.0 g，加入到裝有70%乙醇溶液的容量瓶中，超聲功率220 W，溫度60℃，時間40 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，進(jìn)行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

提取時間對毛狀根黃酮提取率的影響。稱取毛狀根粉末2.0 g，與70%乙醇溶液混勻，220 W超聲功率、60℃提取溫度，1∶20料液比，時間分別采用10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min進(jìn)行超聲波輔助提取試驗，對比黃酮提取率。

1.3.5 假酸漿毛狀根中黃酮抑菌作用研究

超聲提取出的黃酮提取液稀釋成濃度分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/m L、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液備用。采用紙片擴散法，準(zhǔn)確吸取0.1 mL在LB培養(yǎng)基中活化好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，將其分別接種在PDA培養(yǎng)皿中，用滅菌后的接菌針均勻涂布，密封后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h。以1%頭孢曲松鈉為陽性對照，分別放入直徑5.0 mm的無菌濾紙片浸泡，無菌水為陰性對照。將濾紙剪成直徑為1 cm左右的小圓片，放置到5種不同濃度的黃酮溶液中浸泡，小濾紙片全部吸上液體后取出，把小濾紙片放置到供試菌株培養(yǎng)基表面，取3個濾紙片置于每個培養(yǎng)皿中，分別為頭孢曲松鈉(陽性對照)、陰性對照液和供試液，記好標(biāo)識，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)17 h，取出培養(yǎng)皿，測抑菌圈直徑，作好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛狀根增殖液體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

由圖2可見，當(dāng)毛狀根在MS液體培養(yǎng)基中生長，能促使其增殖量最多，其次培養(yǎng)基為N6，White培養(yǎng)基增殖量最少。當(dāng)培養(yǎng)時間到24 d時，毛狀根的增殖量最多，最高增殖量為接種量23.7倍。

圖2 培養(yǎng)基對毛狀根生長的影響Fig.2 Effect of medium on the growth of hairy root

2.2 單因素對毛狀根中黃酮提取率的影響

2.2.1 乙醇濃度對毛狀根黃酮提取率的影響

如圖3所示，當(dāng)乙醇濃度范圍在50%～90%時，毛狀根中黃酮提取率先是逐漸增加，當(dāng)達(dá)到最高量后開始出現(xiàn)下降趨勢，提取率最佳狀態(tài)是乙醇濃度為70%時，測得毛狀根中黃酮得率為8.2%。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of flavones

2.2.2 提取溫度對毛狀根總黃酮提取率的影響

如圖4所示，超聲浸提毛狀根中黃酮量，伴隨著溫度升高，黃酮含量呈先增后減趨勢，提取溫度升高到60℃時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為7.8%。

圖4 提取溫度對黃酮提取得率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of flavones

2.2.3 料液比對毛狀根中黃酮提取率的影響

由于乙醇是揮發(fā)性溶劑，溶劑量的增加使黃酮被稀釋，黃酮在溶劑揮發(fā)過程中遭受損失，反而提高了雜質(zhì)成分的溶出。由圖5可知，隨著料液比例逐漸的增大，毛狀根中黃酮提取率呈現(xiàn)逐漸上升而后下降狀態(tài)，在料液比1∶20時，毛狀根中黃酮的提取率最高，毛狀根中黃酮得率為8.3%。

圖5 液料比對異黃酮提取得率的影響Fig.5 Effects of ratio of liquid to solid on extraction of flavones

2.2.4 提取時間對黃酮提取率的影響

黃酮提取率還與提取時間有很大關(guān)系，時間太短沒能將黃酮類化合物提取出來，時間過長則易溶出其他雜質(zhì)。如圖6所示，毛狀根中黃酮得率隨著提取時間的增加而逐漸增高，當(dāng)?shù)竭_(dá)40 min后，呈現(xiàn)明顯下降趨勢，所以最佳提取時間為40 min。

圖6 制取時間對黃酮提取得率的影響Fig.6 Effects of preparation time on extraction yield of flavonoids

2.3 假酸漿毛狀根中黃酮的抑菌效果

如表1所示，毛狀根中提取出的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，黃酮濃度在0.05%時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有起到作用；黃酮濃度在0.1%時，只對金黃色葡萄球菌起到抑菌作用；當(dāng)黃酮濃度分別在1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL時，對以上兩種菌均有抑菌作用，且隨著黃酮的濃度增加，抑菌效果更明顯。

表1 不同濃度黃酮的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effects of different concentrations of flavones

3 結(jié)論

長期以來，人們不斷從植物中獲取大量的次生代謝產(chǎn)物應(yīng)于醫(yī)藥衛(wèi)生方面。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對使用由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出的假酸漿毛狀根中總黃酮的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，利用超聲提取假酸漿毛狀根總黃酮的最佳工藝條件為70%乙醇濃度，60℃提取溫度，1∶20料液比，15 s輻射時間，30 min提取時間。在此篩選出的條件下，假酸漿毛狀根中總黃酮的得率可達(dá)8.3%。

黃酮類化合物抑菌作用越來越引起人們的重視[10]。本工藝提取的黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用，在試驗范圍內(nèi)，黃酮濃度越大，抑菌作用效果越明顯，說明假酸漿毛狀根中黃酮是一種具有抑菌活性的物質(zhì)，可作為一種天然的有機防腐劑。