參草通脈方對慢性心力衰竭大鼠心肌ANP、AngⅡ及腎組織cAMP、PKA 及PKC 含量的影響

禮 海 劉曉蕾 王 懿 張 艷

1.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，遼寧沈陽 110101；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院專家門診，遼寧沈陽 110032

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）為多種心血管疾病的終末期綜合征，隨著循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)病人數(shù)逐年增多，本病發(fā)病率逐年上升，有報道稱我國每年城市發(fā)病率為3‰～5‰，多發(fā)于50 歲以上人群，隨著年齡增加，發(fā)病率呈增高態(tài)勢[1-2]。隨著研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)CHF 與腎功能異常有著密切關(guān)系，心排血量不斷減少，患者長期處于漸進性缺血缺氧狀態(tài)，以致腎素血管緊張素系統(tǒng)處于持續(xù)激活狀態(tài)，導(dǎo)致腎單位壞死，血管阻力不斷增大，造成回心血量進一步減少，形成惡性循環(huán)[3-5]。本研究探討參草通脈方對CHF 及其腎功能指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF 級12 周齡，體重300～350 g 的雄性大鼠60 只，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：201703120。本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試藥

HD-1 小動物呼吸機（浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實驗廠）、MS-2000 多媒體化生物信號記錄分析系統(tǒng)（廣州市龍飛達科技有限公司）、SONO S5500 彩色多普勒超聲機（Agilnet 公司）、小型離心機（美國Sigma 公司）。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒均由上海羽朵生物科技有限公司提供。

參草通脈復(fù)方（方藥組成為黃芪、丹參、益母草、人參、紅花、三七粉、葶藶子；配伍比例3∶2∶2∶1∶1∶1∶1，批號：遼藥制Z0901013，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑制備中心生產(chǎn)）；福辛普利鈉片（上海施貴寶制藥有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模 60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，為全部動物編號，隨機抽取正常組、假手術(shù)組各8 只。其余及假手術(shù)組禁食不禁水12 h 后，使用10%水合氯醛0.5 ml/100 g 腹腔麻醉，以氣管插管術(shù)迅速連接小動物呼吸機（頻率80 次/min，潮氣量0.7 ml/kg），在左側(cè)第三、四肋間橫向切開長1～2 cm 開口，逐層鈍性分離，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支起源點3～4 mm處縫線結(jié)扎（假手術(shù)組結(jié)扎5 s 后松開），心電監(jiān)測示胸前導(dǎo)聯(lián)ST 段及T 波顯著異常，重置心臟于胸腔，分層縫合，開口處敷注射用青霉素鈉待大鼠平穩(wěn)后，口腔清痰，停呼吸機。術(shù)后72 h 內(nèi)注射青霉素鈉30 萬U/次，1 次/d。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)7 d，除正常組與假手術(shù)組外，第8 天將飼料減少1/3，游泳至其疲乏，1 次/d；減少飼料當(dāng)天加用3%腺嘌呤食用油10 ml/kg，1 次/d，檢測血清肌酐（serum creatinine，Scr），14 d 后檢測Scr 上升至第8 天檢測值的1.0～1.5 倍后，改為每3 天1 次，共28 d。當(dāng)其左室射血分?jǐn)?shù)≥60%，Scr≥初次檢測的2 倍為達到造模標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。

1.3.2 用藥方案 造模成功大鼠按照體重大小依次編號，采用隨機數(shù)字表求余數(shù)法將其分為中藥組、模型組、西藥組，每組8 只。正常組、假手術(shù)組、模型組常規(guī)灌胃蒸餾水1.5 ml/次，2 次/d；其余兩組按人鼠劑量換算公式[劑量（g/kg）=給出的人的劑量（g）×0.018/所求動物體重（kg）]灌胃給藥[7]。中藥組給予參草通脈復(fù)方生藥7.2 g/kg，2 次/d；西藥組給藥2 次/d，第一次為福辛普利1.2 mg/kg，第二次為蒸餾水1.5 ml。五組均干預(yù)28 d。

1.3.3 實驗操作 用藥28 d 后，禁食不禁水24 h，取大鼠心肌組織使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定心房利尿鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）含量。處死大鼠后取腎臟組織，在液氮下保存?zhèn)溆?。檢測時待標(biāo)本在4～8℃下融化后，取等分后加入0.9%氯化鈉勻漿充分后，3500 g 離心10 min，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組腎臟組織環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）含量，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ANP、AngⅡ水平比較

模型組ANP、AngⅡ水平高于正常組、假手術(shù)組，中藥組ANP、AngⅡ水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組ANP、AngⅡ水平比較（ng/L，）

表1 各組ANP、AngⅡ水平比較（ng/L，）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP ＜0.05；與模型組比較，cP ＜0.05。ANP：心房利尿鈉肽；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ

2.2 各組cAMP、PKA、PKC 水平比較

模型組cAMP、PKC 水平高于正常組、假手術(shù)組，PKA低于正常組、假手術(shù)組，中藥組cAMP、PKC 水平低于模型組，PKA 高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組cAMP、PKA、PKC 水平比較（）

表2 各組cAMP、PKA、PKC 水平比較（）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP ＜0.05；與模型組比較，cP ＜0.05。cAMP：環(huán)磷酸腺苷；PKA：蛋白激酶A；PKC：蛋白激酶C

3 討論

3.1 觀察指標(biāo)在臨床研究中的意義

參草通脈方采用心腎同治理論對CHF 模型大鼠進行干預(yù)，其中ANP 是一種多肽類激素，在心肌結(jié)構(gòu)改變前期，因腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）被激活，心肌細(xì)胞會加速合成ANP，抑制RAAS，增加排尿，擴張心血管，CHF 患者ANP 含量是正常人群5 倍以上[8]。而AngⅡ被認(rèn)為是RAAS 中最重要的激素，其釋放量與CHF嚴(yán)重程度一致。早期AngⅡ能促進回心血量及心排血量的增加，失代償后血管平滑肌增厚，導(dǎo)致心肌纖維化及重構(gòu)[9-10]，并持續(xù)興奮交感神經(jīng)，導(dǎo)致去甲腎上腺素加速釋放，增加醛固酮分泌，引起水鈉潴留，而水鈉潴留是腎小球濾過率減少、腎小管對Na+重吸收增加的過程，因此導(dǎo)致腎臟損害[11]。

cAMP 具有良好的抗缺血與缺氧作用，在心肌細(xì)胞中通過加強磷酸化過程，促進興奮收縮偶聯(lián)，增加心輸出量，擴張外周血管，降低心臟前后負(fù)荷，達到改善心功能的作用[12]。cAMP 在細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)依賴于PKA。在腎臟組織細(xì)胞內(nèi)，cAMP 的抗氧化等作用通過PKA 的大量激活而實現(xiàn)，PKA 能夠減少腎小球活性氧的生成，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻止腎臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，起到保護腎臟的作用[13]。而PKC 與PKA 共同參與磷酸化的過程，在其過程中抑制細(xì)胞生成素與DNA結(jié)合，達到阻止細(xì)胞分化，促進肌纖維化，影響腎臟功能[14-16]。

3.2 參草通脈方干預(yù)CHF 的藥理研究

參草通脈方中黃芪多糖具有強心作用，黃芪皂苷甲可雙向調(diào)節(jié)血壓，可以有效增加腎臟血流[17-18]。小劑量益母草有顯著的強心作用，在增加冠狀動脈血流，保護受損心肌的同時，可改善腎血流動力學(xué)，增加腎血流量，有效治療急、慢性腎衰竭引起的水腫[19-20]。人參具有強心及增強非特異性免疫的作用，而且能夠顯著抑制近曲小管上皮細(xì)胞增殖，抑制腎間質(zhì)纖維化，延緩腎小球硬化，改善腎臟功能[21-23]。葶藶子中的葶藶苷有減慢心率的作用，能夠增加腎小球濾過率，促進腎臟代謝，維護腎功能，全方合用強心而不增負(fù)，同時促進代謝，保護心、腎臟結(jié)構(gòu)等功效[24-25]。

3.3 研究臨床意義

本研究中，中藥組心肌ANP、AngⅡ水平低于模型組，中藥組腎臟組織PKA 水平高于模型組，PKC 水平低于模型組。推測參草通脈方能夠有效抑制ANP、AngⅡ表達，延緩心肌重構(gòu)，同時能夠有效增加PKA，抑制PKC。PKA 表達的增加可促進細(xì)胞磷酸化，影響細(xì)胞代謝，抑制氧化作用。參草通脈方可促進PKA 的催化亞基釋放，在cAMP 水平變化較小的情況下，加速酶活化，發(fā)揮保護心腎臟器的效能[26-30]。

綜上，參草通脈方對心腎組織均有良好的保護作用，能夠有效治療CHF，綜合調(diào)節(jié)機體，減少腎臟失代償后給CHF 治療帶來的不利影響，提高患者生存質(zhì)量。