蜂毒素與死亡素雜合肽在畢赤酵母中的融合表達及其生物活性研究

◆作者：陳柏東 張展 李靜 陳淑慧 楊楊 梵高 柒啟恩 朱翠 馮鑫 劉燊 張輝華

◆單位：佛山科學技術學院生命科學與工程學院

抗生素的大量使用，導致致病菌耐藥性不斷產(chǎn)生，畜禽抵抗力下降和食品安全問題等突出問題，飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗、產(chǎn)品無抗的時代已經(jīng)到來。抗生素促進家畜生長的機制主要包括改變腸道形態(tài)、消化能力與抑制有害菌增殖等方面，因此，理想抗生素替代物也應具有與抗生素近似的功效（徐博成，2020）?？咕模ˋMPs，Antimicrobial Peptides），也被稱為宿主防御肽，原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導產(chǎn)生的一類分子量在4 kD 左右，具有抗菌活性的堿性多肽物質。后來發(fā)現(xiàn)抗菌肽廣泛存在于從微生物到人類等多種生命形式中，更是人體自然防御系統(tǒng)的重要組成部分（Ahmed T，2019；Li Y，2019；Mahlapuu M，2016）。其不僅對細菌、病毒、真菌等具有很好的抑制作用，而且在抗癌活性、免疫反應和炎癥調(diào)節(jié)等方面也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用（Zhang D，2019），尤其對某些耐藥性病原菌有殺滅作用，且不會引發(fā)耐藥性，被譽為“天然超級抗生素”（劉秀，2016），因此抗菌肽在醫(yī)學、農(nóng)牧、食品等方面有良好的應用前景。

蜂毒素（Melittin）是蜂毒主要活性成分，由26 個氨基酸組成，對某些細菌、炎癥、輻射、關節(jié)炎、腫瘤、艾滋病以及心血管疾病等有抵抗和治療作用，能夠抑制20-30 種革蘭氏陰性病原微生物，是迄今為止人類所知的抗炎活性最強的物質之一，其抗炎活性是氫化可的松的100 倍（文良柱，2006）。但是，蜂毒素具有很強的溶血性，目前的研究重點是對蜂毒素的結構進行改造，降低其溶血性，以便在臨床上得到使用。死亡素（Thanatin），又稱死亡肽，是在昆蟲斑腹刺-益蝽（Podisus maculiventris）中發(fā)現(xiàn)的由21 個氨基酸殘基組成的抗菌肽，具有廣譜抗菌活性，其對金黃色葡萄球菌的抗性較低, 但對哺乳動物細胞沒有溶血性（Fehlbaum P，1996）。根據(jù)功能區(qū)域，本研究中設計將蜂毒素的5-12（VLKVLTTG）和死亡素的4-21（KPVPIIYCNRRTGKCQRM）氨基酸進行融合成雜合肽，并通過基因工程進行酵母表達，以期獲得一種具有光譜抗菌性且無溶血性的重組抗菌肽，擬作為飼料添加劑在畜禽產(chǎn)業(yè)上推廣使用。

1 材料與設備

1.1 菌種與質粒

畢赤酵母GS115；pGAPZa A酵母特異載體；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

1.2 試驗試劑

無核酸酶污染的雙蒸水（10977015），美國Invitrogen 公司 ；2 ×SsoRubost Taq PCR ProMix（T111A）、2×PfuMax HiFi PCR ProMix （P217A）、T4 Quick Ligation Mix（K004A），廣州英贊生物科技有限公司；Lysis Buffer（9164），日本Takara 公司；限制性內(nèi)切酶EcoR1 （FD0274）和Xbal （FD0684），美 國Thermo Fisher Scientific；限制性內(nèi)切酶AvrⅡ（R0174S），NEB 公司；質粒提取試劑盒，天根生化科技有限公司；蛋白純化系統(tǒng)GE Healthcare AKTA pure，美國GE 公司；Low Salt LB（不含抗生素）培養(yǎng)液、抗生素Zeocin、DNA marker、蛋 白 質 Marker， 購 自 大 連TaKaRa 公司；YPD 液體培養(yǎng)基（10.0 g/L 酵母提取物、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L 葡萄糖）；LDST溶液（100mM LiAc,10 mM dithiothreitol,，0.6 M sorbitol and 10 mM Tris-HclpH7.5， 現(xiàn) 用 現(xiàn) 配）；Buffer A（50 mM 三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50 mM 氯化鈉、5%甘油）、洗脫緩沖液Buffer B（50 mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50 mM氯化鈉、500 mM 咪唑、5%甘油）等，為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器設備

PCR 儀T100、電轉化儀，美國Bio-Rad 公司；紫外分光光度計K5500，北京凱奧公司；電泳系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；臺式高速離心機、微量移液槍，Eppendorf 公司；臺式全溫搖床，太倉市華美生化儀器廠；蛋白純化系統(tǒng) GE Healthcare AKTA pure，美國GE 公司。

2 實驗方法

2.1 MBP-MTDNA 序列合成

全基因合成MBP-MT DNA序列（金斯瑞生物科技公司），連接在pUC57-Simple 載體上，獲得 pUC57-Simple-MBP-MT 載體，兩端含有EcoRI 和XbaI 酶切位點。

2.2 pGAPZαA-MBP-MT酵母特異表達載體構建

使 用 EcoRI 和 XbaI 對pGAPZa A 和 pUC57-Simple-MBP-MT 載體進行雙酶切，回收目標產(chǎn)物片段，使用T4 連接酶進行連接。連接體系為：T4 Quick Ligation Mix 5μL、MBP-MT DNA片段50 ng，酶切后的pGAPZαA DNA 片段50 ng，ddH2O 補充至10μL，22 ℃連接2 h。

轉化至感受態(tài)細胞：取5μL連接產(chǎn)物與50μL DH5α 感受態(tài)細胞混勻，孵育后離心，去除上清液，取適量混勻菌液加到含Zeocin（25μg/mL）抗性LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，涂勻，37 ℃倒置培養(yǎng)至單菌落長出。

表達載體PCR 鑒定：挑取10 個單菌落進行PCR 鑒定，獲得陽性酵母克隆，即構建完成pGAPZαA-MBP-MT 酵母特異表達載體。

2.3 pGAPZαA-MBP-MT表達載體的提取和線性化

使用質粒提取試劑盒提取pGAPZαA-MBP-MT 質粒，使用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ酶切和線性化質粒，線性化的DNA 片段通過瓊脂糖電泳DNA 回收試劑盒進行回收和備用。具體方法詳見鄧贛奇等（2020）。

2.4 畢赤酵母GS115 的電轉化與鑒定

制備GS115 感受態(tài)細胞，將線性化后的pGAPZαA-MBP-MT質粒電轉入GS115 感受態(tài)細胞，并進行陽性酵母克隆的鑒定，具體方法詳見鄧贛奇等（2020）。

2.5 重組蛋白的表達

挑取陽性單克隆于10 mL YPD 過夜培養(yǎng)，后取100μl 接種到5 瓶10 mL（250 mL 搖瓶）的YPD 培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min 條件下?lián)u瓶表達。分別在培養(yǎng)0 h、24 h、36 h、48 h、60 h 后取樣，于8000 r/min 離心5 min，將上清轉至干凈的50 mL 離心管，后將上清和菌沉淀，并放入-80 ℃保存，直至檢測蛋白表達時取出。

2.6 重組蛋白的的測定和純化

培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復溶后，進行重組蛋白的Weston blot 檢測，通過Pierce TM BCA Protein Assay Kit方法測定重組蛋白的濃度，經(jīng)親和層析純化后獲得重組蛋白，具體方法詳見鄧贛奇等（2020）。

2.7 重組蛋白生物活性測定

將保存在-20 ℃冰箱的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液劃板活化，培養(yǎng)至長出單菌落并純化，配制200 mL LB 固體培養(yǎng)基于兩個錐形瓶中，滅菌后，培養(yǎng)皿中倒入10 mL 左右LB 培養(yǎng)基凝固，擺放牛津杯。待LB 固體培養(yǎng)基冷卻至45 ℃時，在培養(yǎng)基中分別加入100μL 菌液輕輕搖勻倒板，等待培養(yǎng)基凝固干燥，將提純得到的重組蛋白稀釋10 倍，吸取200μL 分別加入牛津杯中，空白對照則加無菌水，并做3 個重復，4 ℃冰箱中預擴散2 h，然后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈的大?。ㄗT才鄧，2016）。

3 結果分析

3.1 pGAPZαA-MBP-MT表達載體構建

全基因合成MBP-MT DNA序列，并在兩端設計含有EcoRI和XbaI 酶切位點，可通過該雙酶切位點連入pGAPZαA 表達載體中。 設計的pGAPZα-A-MBP-MT 酵母表達載體含有483 bp 的GAP 啟動子，267 bp 的α-factor 信號肽，1167 bp 的MBP基因，78 bp 的MT 基因，以及myc-組氨酸標簽，如圖1 所示。

圖1 pGAPZαA-MBP-MT 酵母表達載體的構建

3.2 pGAPZαA-MBP-MT表達載體的PCR 檢測

使 用 EcoRI 和 XbaI 對pGAPZa A 和 pUC57-Simple-MBP-MT 載體進行雙酶切，回收目標產(chǎn)物片段，使用T4 連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞，涂布于含25 μg/mL Zeocin 抗性平板上，挑取12 個單菌落進行菌落PCR 檢測，糖凝膠檢測條帶大小為1.5 kb 左右（如圖2 所示），初步確定為陽性克隆。選取1 和2 號單菌落進行質粒提取和測序驗證，與理論DNA 序列完全吻合，獲得了pGAPZαA-MBP-MT 酵母表達載體。

圖2 菌落PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 重組畢赤酵母基因組鑒定

線 性 化 的 pGAPZα-A-MBP-MT，電轉入GS115 酵母感受態(tài)細胞，獲得酵母陽性克隆。取5 個克隆點進行菌落PCR鑒定，瓊脂糖電泳顯示條帶大小為1.5 kb，與理論大小相符合，判定5 個單克隆菌株均為陽性單克隆（見圖3）。

圖3 酵母單菌落PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3.4 MBP-MT 重組蛋白在畢赤酵母中的表達檢測

將表達時間為0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 的培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復溶后進行Weston blot 檢測，結果如圖4 所示，從以上結果可以確定，帶組氨酸標簽的目的蛋白獲得可溶表達，并且在24 h 培養(yǎng)后的目的蛋白的表達量趨于飽和，因此，確定表達培養(yǎng)時間為24 h 較好。

圖4 Weston blot 法檢測

3.5 MBP-MT 重組蛋白純化

將所得溶液選用1 mL 組氨酸標簽- 親和層析柱和GE Healthcare AKTA pure 純化系統(tǒng)進行親和層析后，將收集到的目的蛋白進行SDS-PAGE 電泳檢測，如圖5 所示。經(jīng)測定，純化后的MBP-MT 純度在90%以上。利用BCA 法檢測，純合后的蛋白濃度為120 mg/L。

圖5 MBP-MT 重組蛋白純化后的SDS-PAGE 電泳圖

3.6 MBP-MT 抗菌活性

將純化的重組蛋白稀釋10倍，濃度為12 mg/L，能在金黃色葡萄球菌平板、大腸桿菌平板上產(chǎn)生明顯的抑菌圈。這表明，重組MBP-MT 蛋白對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌如大腸桿菌均有顯著的抑制效果（圖6）。生產(chǎn)。前兩種方法提取效率低，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此用基因工程的手段來生產(chǎn)抗菌肽成為首選方法（王蓮哲，2020）。目前獲取抗菌肽的方式主要是通過大腸桿菌、酵母菌、桿狀病毒、枯草芽孢桿菌等基因工程菌來表達多肽（鄧贛奇，2020）。

圖6 MBP-MT 重組蛋白抑菌試驗結果圖

畢赤酵母具有較為完善的基因表達調(diào)控機制、蛋白質加工修飾能力且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，是第一個被FDA 批準用于生產(chǎn)重組蛋白藥物的表達系統(tǒng)（Mattanovich,2012），其表達量大約是

4 討論

抗菌肽作為“天然抗生素”，既可作為有效的抗生素替代品，又可作為佐劑與抗生素治療結合使用（何湘鵑，2019），為解決抗生素濫用問題提供了新思路、新方法。其來源主要從天然生物體中提取、化學合成、基因工程55～748000μg/L （李 廣 京，2014）。目前國內(nèi)外已利用該系統(tǒng)表達了一系列重要具有生物學活性的蛋白質，如白細胞介素2（Liu Y，2006）、CTLA-4（Peraino J，2012）、內(nèi)毒素中和蛋白（Paus EJ，2002）、甘油激酶（Janke R，2010）、融合蛋白rhlL-2-HAS（Lei J，2012）等。

將兩端有活性的多肽連在一起，并進行雜合肽的表達，是一種較好的方式。儲衛(wèi)華等（2007） 將天蠶素AN 端第1-8個氨基酸殘基和蜂毒素N 端第1-18 個氨基酸殘基，用化學合成法合成了以酵母偏愛密碼子編碼的雜合肽CA（1-8）ME（1-18）基因，表達的產(chǎn)物對大腸桿菌具有較好的抗菌活性。文良柱（2006）將人工合成的蜂毒素與死亡蘇的雜合肽DNA 序列，經(jīng)PCR 擴增后得到帶有BamHI 和XhoI 限制性酶切位點的序列，再將此基因克隆至載體pET-32a，成 功 構 建 了 重 組 質 粒pET32a-MT，其產(chǎn)物也具有抗菌活性。黃音等（2001）將天然蛙皮素親水性N 端取14 個氨基酸（截去頭2 個氨基酸）作為雜合肽N 端，從天然蜂毒素疏水性N端取13 個氨基酸作為雜合肽C端，得到的重組基因的產(chǎn)物轉化大腸桿菌后得到了活性更好的雜合肽。張莉等（2010）的試驗采用pET-28a 系統(tǒng)包涵體可以使死亡素- 蜂毒素獲得更高的表達量，純化后的蛋白純度更高。

根據(jù)功能區(qū)域，本研究設計將蜂毒素的5-12（VLKVLTTG）氨基酸和死亡素的 4-21（KPVPIIYCNRRTGKCQRM） 氨基酸融合拼接成雜合肽。通過EcoRI 和XbaI 對重組基因序列和畢赤酵母pGAPZa A 進行雙酶切和連接， 成功構建了pGAPZαA-MBP-MT 酵母表達載體。線性化后的表達載體電轉入GS115 酵母細胞中，成功從中篩選出了陽性克隆，并在YPD培養(yǎng)基中搖瓶誘導分泌和表達，并通過組氨酸標簽- 親和層析柱和純化系統(tǒng)對其進行純化。得到重組蛋白為48 kD 左右，濃度為120 mg/L,純度達90%以上。純化后的重組MBP-MT 蛋白對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌如大腸桿菌均有明顯的抑制效果。綜上，本研究獲得了具有生物活性的蜂毒素-死亡素雜合肽，下一步擬開展該雜合肽的飼料添加劑相關功能研究。