硫酸乙酰肝素蛋白多糖在唾液腺腺樣囊性癌伴神經侵襲中的表達分析

張艷寧 石 宏 趙增波 郝亞麗 李荷香

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，約占唾液腺惡性腫瘤的22%。此腫瘤無包膜，易于早期侵襲神經，引起感覺異常、麻木和疼痛。發(fā)生在腮腺者可以引起患者面神經麻痹或癱瘓，給患者帶來極大痛苦，也給臨床治療帶來困擾。以往研究表明，蛋白多糖廣泛存在于腺樣囊性癌腫瘤組織及腫瘤間質中。抑制腺樣囊性癌細胞蛋白多糖合成與分泌，能夠明顯抑制其生長、增殖、轉移、神經侵襲等惡性生物學行為過程[1，2]。本研究以人周圍神經系統(tǒng)中的雪旺細胞為對照，檢測硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs），包括GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4，在腺樣囊性癌中的表達，并探討其在腺樣囊性癌侵襲周圍神經過程中的作用。

資料和方法

一、細胞培養(yǎng)

人唾液腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83細胞（來自北京大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科研究室）于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素）中，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

人雪旺細胞（Cat.NO:1700，ScienCell，美國）在含5%血清的培養(yǎng)基（SCM，Cat.No：1701，ScienCell，美國），于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、HSPGs在腺樣囊性癌細胞中的表達

采用Real time PCR檢測HSPGs（GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4）在SACC-83細胞與人雪旺細胞中的相對表達量。

TRIzol法（Invitrogen，美國）提取SACC-83細胞和人雪旺細胞總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，MBI Fermentas，美國），反應條件：60℃，5分鐘；42℃，60分鐘；70℃，5分鐘。

實時熒光定量（7500 Real time PCR System，Applied Biosystems，USA）：50℃，2分鐘；95℃，10分鐘；95℃變性20秒，57℃退火20秒，72℃延伸31秒，共40個循環(huán)。生成融解曲線（The Melt Curve）：95℃，15秒；60℃，1分鐘；95℃，30秒；60℃，15秒。

采用2-△△CT相對定量法計算樣本中基因相對表達量。

引物序列如下見表1。

表1 引物序列表

三、免疫組織化學檢測SDC1、SDC4在腺樣囊性癌伴神經侵襲組織中的表達

臨床收集2007至2021年間，來自河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院、河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔頜面外科就診的唾液腺腺樣囊性癌伴神經侵襲病例23例。腫瘤組織福爾馬林固定，同時由兩名病理醫(yī)師進行病理學診斷為“腺樣囊性癌”，組織學描述鏡下可見神經侵襲。根據(jù)上述Real time PCR檢測結果，采用免疫組織化學法（PV6000，北京中杉金橋生物技術有限公司，中國）檢測SDC1（1:100，Cat.NO:5608-1，Epitomics，美國）、SDC4（1:100，Cat.NO:AF0831-100，Affinity公司，美國）在腺樣囊性癌組織中的表達。根據(jù)細胞著色深度進行半定量分析：腫瘤細胞或腺腔內黏液不著色為陰性（-），淺棕色者為弱陽性（+）、棕色為陽性（++）、深棕色者為強陽性（+++）。由兩名病理醫(yī)師共同對著色程度進行判斷，并分為低表達組（-、+）、高表達組（++、+++）。采用IBM SSPSS 21.0軟件、Fisher確切概率法進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、HSPGs在唾液腺腺樣囊性癌細胞中的表達

Real time PCR檢測HSPGs mRNA（GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、HSPG2、SDC1、SDC2、SDC3、SDC4）在SACC-83細胞、人雪旺細胞中的相對表達量。結果顯示，SDC1在SACC-83細胞中的表達是人雪旺細胞的5.49倍，SDC4在SACC-83細胞中的表達是人雪旺細胞的2.09倍，均高于人雪旺細胞2倍以上（圖1）。

圖1 Real time PCR檢測HSPGs在SACC-83細胞和人雪旺細胞的表達（N＝3）

二、SDC1、SDC4在唾液腺腺樣囊性癌伴神經侵襲組織中的表達

臨床收集唾液腺腺樣囊性癌伴神經侵襲23例（圖2）。患者年齡33~72歲，平均年齡52.6歲，男女比例為15：8。其中大唾液腺者18例，小唾液腺者5例。

圖2 唾液腺腺樣囊性癌伴周圍神經侵襲（HE，×200）

免疫組織化學檢測結果顯示，SDC1在腺樣囊性癌腫瘤組織表達陽性（23/23，100%），主要表達于腫瘤細胞膜、細胞漿及腫瘤細胞外基質內，在神經纖維束表達亦呈陽性。在神經侵襲部位與遠離神經侵襲部位（鏡下遠離受侵襲神經束約2.5mm）表達無差別（圖3）。SDC4在腺樣囊性癌腫瘤組織均有表達（圖4），主要表達于腫瘤細胞膜和細胞漿，在神經纖維表達陽性。同時免疫組化半定量分析結果顯示，SDC4在伴有神經侵襲部位的腫瘤細胞中表達強陽性5例，陽性16例，弱陽性2例；而遠離神經侵襲部位的腫瘤組織中表達陽性1例，弱陽性8例，陰性14例。差別顯著，具有統(tǒng)計學意義（表2，P＜0.05）。

圖3 SDC1蛋白在腺樣囊性癌組織中表達陽性（IHC，×200）

表2 SDC4蛋白在腺樣囊性癌伴神經侵襲腫瘤組織中的表達統(tǒng)計（N＝23）

圖4 SDC4蛋白在腺樣囊性癌組織中表達陽性（IHC）

討 論

唾液腺腺樣囊性癌發(fā)生淋巴道轉移比較少見，卻極易侵襲周圍神經組織，表現(xiàn)為包裹周圍神經，破壞神經束膜，侵襲神經纖維束，或沿神經纖維束生長，甚至還可以出現(xiàn)沿神經束膜的跳越式轉移。因此周圍神經侵襲生長也被認為是腺樣囊性癌遠處轉移的途徑之一。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，抑制腺樣囊性癌細胞蛋白多糖的合成分泌，能夠明顯降低其神經侵襲能力[2]。

HSPGs廣泛分布于多種腫瘤組織，如結直腸癌、唾液腺腺樣囊性癌和多形性腺瘤等腫瘤細胞及細胞外基質中[3，4]。在應用免疫電鏡和原位雜交技術對五種不同的腺樣囊性癌細胞株的檢測中均發(fā)現(xiàn)：腺樣囊性癌細胞產生470kDa核心蛋白的HSPG，它與Ⅳ型膠原等細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）共同作用于腺樣囊性癌細胞的轉移過程[5]。而且，轉移能力不同的腺樣囊性癌細胞株有不同的蛋白多糖表達。衛(wèi)晉雄等[6]曾比較腺樣囊性癌肺轉移細胞株ACC-M與其母系細胞ACC-2中HSPGs表達分析，發(fā)現(xiàn)具有較高轉移活性的ACC-M細胞的HSPGs表達明顯高于ACC-2細胞，而且ACC-M細胞中的HSPGs合成速度與沉積于細胞外基質的能力均明顯高于ACC-2細胞。同時在對ACC-2細胞研究中，ACC-2細胞在富含蛋白多糖的基質中培養(yǎng)，其粘附、擴散、增殖能力均明顯增強[7]。以上研究，均提示高表達的蛋白多糖對腺樣囊性癌的惡性生物學行為有促進作用。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同亞類的HSPGs在腺樣囊性癌中的作用也不同，如GPC5在腺樣囊性癌肺轉移患者的腫瘤組織中表達明顯高于未發(fā)生肺轉移的患者，同時抑制GPC5表達，能夠明顯降低其肺轉移能力[8]。本研究以人雪旺細胞為對照，檢測HSPGs在腺樣囊性癌SACC-83細胞的表達，結果顯示不同亞類的蛋白多糖在腺樣囊性癌和周圍神經雪旺細胞中表達水平也不盡相同，尤其SDC1與SDC4表達明顯高于人雪旺細胞。

多配體蛋白聚糖（Syndecans）作為一類跨膜HSPGs，包括SDC1、SDC2、SDC3和SDC4共4名成員，參與細胞信號通路、增殖、粘附等過程[9，10]。其中SDC1是目前研究比較多的一種，參與細胞增殖、凋亡、血管生成、遷移等過程，并通過細胞外間質蛋白分子受體參與細胞與胞外間質互通[11，12]，而使其廣泛表達于多種正常及腫瘤組織中[13]，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝癌、纖維肉瘤、宮頸癌等[14~16]。在本研究中，SDC1在SACC-83細胞中表達明顯高于人雪旺細胞，且在唾液腺腺樣囊性癌腫瘤組織中表達陽性，提示其可能參與了該腫瘤的發(fā)生。而SDC4作為一種糖蛋白受體，擔任了在細胞粘附、遷移、增殖、血管生成、內吞和轉導等過程中的重要介質分子[17，18]，通過調節(jié)αVβ3整合素機械受體功能來控制神經突細胞骨架收縮性[19]，作為機械傳感器，觸發(fā)整個細胞的整合素激活和粘附強化等[20]。并發(fā)現(xiàn)SDC4高表達與大腸癌[21]、乳腺癌[22，23]、肝癌[24]、骨肉瘤[25]等腫瘤的侵襲性、生存期等明顯相關，可能作為其臨床預后的判斷指標[26]。本研究結果顯示，SDC4在腺樣囊性癌腫瘤組織中表達陽性，尤其是在伴神經侵襲部位腫瘤細胞中表達明顯高于遠離神經侵襲部位腫瘤細胞，提示其可能參與了腫瘤細胞的周圍神經侵襲過程。

綜上所述，SDC1、SDC4表達于腺樣囊性癌細胞及伴神經侵襲腫瘤組織中，尤其是SDC4蛋白可能參與了腺樣囊性癌的周圍神經侵襲過程。這為今后的基礎研究和臨床治療提供思路，但其具體機制還有待進一步研究。