外周血ctDNA及Survivin預(yù)測NSCLC預(yù)后的臨床研究

齊艷梅 李瑞杰 汪領(lǐng)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是指源于支氣管黏膜上皮或肺泡上皮的惡腫瘤，屬于常見的肺癌類型，約占肺癌的80%，根據(jù)病理類型可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等，臨床典型癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咯血、呼吸困難、胸痛等，晚期患者會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移部位相應(yīng)癥狀，膿胸、病理性骨折等是其常見并發(fā)癥，發(fā)病率及病死率較高，多數(shù)患者確診時已是晚期，預(yù)后較差[1-2]。因此，尋找NSCLC預(yù)后的相關(guān)分子預(yù)測指標(biāo)，為患者制定個體化治療方案具有重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，肺癌分子生物學(xué)預(yù)后預(yù)測指標(biāo)成為近年來肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor，ctDNA)可用于動態(tài)監(jiān)測腫瘤變化、判斷患者預(yù)后等[3]。凋亡抑制蛋白存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族的新成員，在多種腫瘤中高表達(dá)，與肺癌的發(fā)生、診斷和預(yù)后密切相關(guān)[4]。本研究通過綜合分析NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin表達(dá)水平，評估其對患者預(yù)后的預(yù)測作用。

資料與方法

一、臨床資料

本次研究選取2017年2月—2018年2月收治的138例經(jīng)病理學(xué)檢查確診的NSCLC患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)纖維支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢病理確診為原發(fā)性NSCLC者；②首次診斷為鱗癌或腺癌且未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③術(shù)前未接受任何新輔助放化者；④無手術(shù)禁忌證者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其它惡性腫瘤、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；②合并嚴(yán)重心、肝、腎等器官功能障礙者；③術(shù)前發(fā)生血栓栓塞性疾病者；④有手術(shù)禁忌證者；⑤術(shù)前應(yīng)用抗凝藥物治療者。研究組：男104例，女34例；吸煙96例，不吸煙42例；年齡37～72歲，平均(54.56±10.84)歲；鱗癌67例；腺癌71例；高分化61例，低分化77例；p-TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期96例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移97例；腫瘤直徑2～7 cm，平均(4.51±2.16)cm。同期，于醫(yī)院體檢中心招募56例年齡、性別、吸煙史與NSCLC患者完全匹配的健康志愿者作為對照組，男39例，女17例；吸煙31例，不吸煙25例；年齡35～64歲，平均(53.37±10.26)歲。兩組性別、是否吸煙、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。本研究隨訪第一終點(diǎn)為末次隨訪或死亡時間，隨訪方式包括門診復(fù)查、電話和信件隨訪，隨訪終止日期為2021年2月。

二、檢測方法

①標(biāo)本采集與處理：分別收集所有受試者外周血5 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理，1500 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，收集血漿保存于-80℃冰箱待用。②ctDNA含量測定：使用血漿游離DNA分離試劑盒依次進(jìn)行ctDNA大片段分離、小片段回收、DNA末端修復(fù)和A接頭連接；提取NSCLC患者血漿ctDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃退火15 s、60℃延伸30 s，共40個循環(huán)，HepG2細(xì)胞中提取DNA，倍比稀釋后擴(kuò)增，上述測量均重復(fù)3次，并進(jìn)行探針雜交捕獲和序列的測序分析。③Survivin mRNA含量測定：根據(jù)試劑盒操作說明，應(yīng)用Trizol提取RNA，使用紫外分光光度計(jì)定量并檢測其純度，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定其完整性，-80℃保存待用；使用1 μg總RNA、2 μL×10緩沖液、2 μL dNTPs(10 mmol/L)、100 ng隨機(jī)引物、2 μL M-MLV(10 U/μL)加DEPC水組成20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行cDNA合成；采用1×定量緩沖液、200 μmol/L dNTPs、5 U ampliTaq Gold、各600 nmol/L的Survivin上、下游引物、200 nmol/L熒光探針、100 ng cDNA組成的50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，然后57℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀自動進(jìn)行分析。本研究所用試劑盒購于廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司，并嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑均購于上海玉博生物科技有限公司，引物序列由天根生化科技(北京)有限公司合成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 兩組基線資料比較

結(jié) 果

一、NSCLC患者與健康志愿者外周血ctDNA和Survivin mRNA表達(dá)水平比較

研究組外周血ctDNA和Survivin mRNA表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組外周血ctDNA和Survivin mRNA表達(dá)水平比較

二、NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表達(dá)水平的界限值

根據(jù)ROC曲線，患者外周血ctDNA和Survivin mRNA的最佳截點(diǎn)分別為17.23 ng/mL和5.34×105copies/mL(見圖1)。

圖1 確定NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表達(dá)水平界限值的ROC曲線

三、影響NSCLC患者預(yù)后的單因素分析

單因素分析顯示，性別、年齡、組織學(xué)分型、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、是否吸煙、術(shù)后是否放療及是否使用分子靶向藥物患者的平均生存時間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后化療、p-TNM分期Ⅰ～Ⅱ、ctDNA表達(dá)水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平<5.34×105copies/mL患者平均生存時間均高于術(shù)后未化療、p-TNM分期Ⅲ～Ⅳ、ctDNA表達(dá)水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平≥5.34×105copies/mL患者(P<0.05)(見表3)。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的單因素分析

四、 Kaplan-Meier生存曲線分析NSCLC患者外周血ctDNA、Survivin mRNA表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性

外周血ctDNA表達(dá)水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平≥5.34×105copies/mL患者與外周血ctDNA表達(dá)水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平<5.34×105copies/mL患者生存曲線比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 外周血ctDNA及Survivin mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系

五、影響NSCLC患者預(yù)后的COX多因素分析

將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的p-TNM分期、術(shù)后是否化療、ctDNA表達(dá)水平、Survivin mRNA表達(dá)水平因素納入COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示p-TNM分期、ctDNA表達(dá)水平、Survivin mRNA表達(dá)水平均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險因子(P<0.05)(見表4)。

表4 影響NSCLC患者預(yù)后的COX多因素分析

討 論

NSCLC是病死率較高的惡性腫瘤之一，以65歲以上人群居多，但近年來發(fā)病有年輕化趨向，其確切病因尚未完全明確，可能與環(huán)境因素、自身因素和遺傳因素有關(guān)[5]。臨床上常通過手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療、免疫治療等一系列手段進(jìn)行綜合治療，但5年生存率無明顯提高，多數(shù)患者仍死于肺癌的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。因此，精準(zhǔn)評估肺癌患者的預(yù)后，從而積極采取個體化的肺癌治療這一問題亟待解決。隨著分子病理學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)檢測相應(yīng)分子標(biāo)志物的突變基因進(jìn)而選擇最佳靶向藥物對肺癌的治療具有非常重要的指導(dǎo)作用[7]。

外周血是最常使用的液體活檢標(biāo)本之一。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者外周血ctDNA與Survivin mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組，提示NSCLC患者外周血ctDNA與Survivin mRNA表達(dá)異常。ctDNA是腫瘤細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或細(xì)胞凋亡時釋放入外周血的小片段DNA，大小通常為160～180 bp，包含了腫瘤組織的全部遺傳信息，與原發(fā)腫瘤DNA具有相同的特征，可反應(yīng)腫瘤組織中基因的突變狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測，從而指導(dǎo)患者的靶向治療，改善患者預(yù)后[8]。越來越多的研究表明，ctDNA在腫瘤的早期診斷、療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后判斷等方面具有重要意義。Rolfo等[9]認(rèn)為血漿中循環(huán)細(xì)胞腫瘤DNA的分離和分析技術(shù)是一種強(qiáng)大的工具，具有巨大潛力，可以改善包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥類型的臨床結(jié)果。陳學(xué)瑜[10]等使用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法檢測77例NSCLC患者外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變率、突變位點(diǎn)比較均無明顯差異，認(rèn)為NSCLC患者ctDNA中EGFR基因突變與腫瘤組織中EGFR基因突變具有較好的一致性，預(yù)后效果良好，可作為判斷患者預(yù)后的重要預(yù)測指標(biāo)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一組多基因突變、多階段的綜合病理過程，是多種基因表達(dá)及積累的結(jié)果，而凋亡基因的改變是其中一個非常重要的環(huán)節(jié)[11]。人類Survivin基囚定位于第17對染色體的q25帶，長度為75～130 kb，包含多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂雙重功能，在多數(shù)癌組織中均有表達(dá)，通過直接促進(jìn)細(xì)胞逃離生長監(jiān)控，造成細(xì)胞增殖增加，凋亡減少，二者之間的平衡被打破，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12]。Duan等[13]進(jìn)行了Survivin蛋白表達(dá)參與亞洲人非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的薈萃分析，該薈萃分析共納入28篇文獻(xiàn)，結(jié)果表明，NSCLC患者和正常對照之間survivin陽性表達(dá)存在顯著差異，且survivin表達(dá)與組織學(xué)分化、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認(rèn)為Survivin表達(dá)與NSCLC的臨床病理特征有關(guān)，可能是NSCLC進(jìn)展的重要生物標(biāo)志物。

本研究根據(jù)ROC曲線分析確定了NSCLC患者外周血ctDNA和Survivin mRNA表達(dá)水平界限值分別為17.23 ng/mL、5.34×105copies/mL，單因素分析顯示，術(shù)后是否化療、p-TNM分期、ctDNA與Survivin mRNA表達(dá)水平均是影響NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)因素，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，外周血ctDNA表達(dá)水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平≥5.34×105copies/mL患者3年累積生存率均高于ctDNA表達(dá)水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達(dá)水平<5.34×105copies/mL患者，再次表明外周血ctDNA及Survivin表達(dá)情況與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系密切。原因在于，ctDNA是腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的單鏈或雙鏈DNA，攜帶有原始腫瘤的突變基因，可用于監(jiān)測患者術(shù)后微小病灶的殘留，并評估腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)風(fēng)險，故可作為預(yù)測NSCLC患者預(yù)后的分子指標(biāo)[14]。Survivin蛋白表達(dá)越高，其對癌細(xì)胞凋亡抑制的能力越強(qiáng)，癌細(xì)胞的生存能力也相應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，因此可作為預(yù)測NSCLC患者預(yù)后的分子指標(biāo)[15]。此外，本研究COX多因素分析顯示，p-TNM分期、ctDNA表達(dá)水平、Survivin mRNA表達(dá)水平均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險因子，再次表明外周血ctDNA與Survivin mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后具有密切關(guān)系。

綜上所述，外周血ctDNA與Survivin均在NSCLC患者中高表達(dá)，與患者預(yù)后關(guān)系密切，可作為預(yù)測患者預(yù)后的分子指標(biāo)。但本研究僅對ctDNA與Survivin單獨(dú)預(yù)測作用進(jìn)行分析，后續(xù)需行大樣本、多中心的臨床試驗(yàn)，以進(jìn)一步評估多種指標(biāo)聯(lián)合檢測在預(yù)測NSCLC患者預(yù)后方面的效能及價值。