支氣管哮喘患兒血清miR-34、Notch1水平與氣道炎癥的相關(guān)性分析

朱萍 別國梁 司海超

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)是學(xué)齡期兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病，以氣急、喘息、咳嗽、胸悶等反復(fù)發(fā)作為臨床表現(xiàn)，可嚴(yán)重影響患兒生活及學(xué)習(xí)質(zhì)量[1]。目前，BA發(fā)病相關(guān)因素尚未解釋完全，但研究認(rèn)為其與炎性介質(zhì)、微小RNA(microRNA, miRNA)、炎癥細(xì)胞、免疫應(yīng)答等有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-34(microRNA-34, miR-34)miR-34在BA患者中呈低表達(dá)，其可能是治療BA的潛在靶標(biāo)[3]；另外，miR-34與Notch1存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，且Notch1在過敏性哮喘中表達(dá)上調(diào)，其可能參與過敏性哮喘病理發(fā)展過程[4-5]。miR-34在BA中雖已有研究，但其在BA患兒中與Notch1的相關(guān)性及兩者與氣道炎癥的關(guān)系鮮有報(bào)道?；诖?，本研究通過檢測BA患兒血清miR-34、Notch1表達(dá)水平，分析兩者與白介素-17(interleukin-17, IL-17)、嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils, EOS)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)等氣道炎癥指標(biāo)的關(guān)系，以期為臨床診斷BA提供依據(jù)。

資料與方法

一、 臨床資料

選取2018年10月～2020年5月本院診治的BA患兒94例進(jìn)行研究(BA組)，其中男52例，女42例；年齡2～12歲，平均年齡(7.28±3.85)歲。并選取同期體檢健康兒童90例進(jìn)行對(duì)照研究(健康組)，其中男54例，女36例；年齡1～13歲，平均年齡(7.63±3.97)歲。健康組與BA組性別比例、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.413,t=0.607，P均>0.05)。另外，收集兩組家族哮喘史、個(gè)人過敏史、家族過敏等資料。BA診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》有關(guān)BA判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合BA診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者均具備完整的生理病理檢查資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并糖尿病、系統(tǒng)紅斑狼瘡或其它自身免疫性疾病者；(2)合并過敏性疾病史、嚴(yán)重肝腎疾病者；(3)合并腫瘤者；(4)合并鼻炎、慢阻肺、其他病原體導(dǎo)致的肺部炎癥病變；(5)合并高血壓或其他心血管疾病者。

受試兒童直系親屬簽署知情同意書，所用方法符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、方法

1 樣本收集 收集所有患兒入院后，治療前、健康兒童體檢當(dāng)日清晨空腹外周血約5 mL，分成兩份。一份于室溫下，靜置約30 min，4℃以5200 r/min離心6 min，分離上層血清，置于無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存；另一份置于EDTA-K2抗凝管中，混勻，3h內(nèi)上機(jī)檢測EOS水平。

2 qRT-PCR法檢測血清miR-34、Notch1 mRNA表達(dá)水平 解凍適量凍存血清樣本，采用Trizol法按Trizol試劑盒(貨號(hào)：RP2401，無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)說明書抽提樣本總RNA。使用紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：DU-730，上海普迪生物技術(shù)有限公司)檢測RNA質(zhì)量。嚴(yán)格參照PrimeScript TM RT Master Mix(貨號(hào)：RR036A，北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)說明書將2.0 μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號(hào)：MA-4800，蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司)和SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(貨號(hào)：HY-K0521，MedChemExpress LLC)完成PCR擴(kuò)增檢測，其中擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，上/下游引物各1 μL，cDNA 2.0 μL，加ddH2O至總體積為25.0 μL，各引物序列詳(見表1)；另外，程序設(shè)定為：97℃預(yù)變性6 min；95℃變性15 s，62℃退火20 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后收集各樣本數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCT法計(jì)算miR-34、Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(見表1)。

表1 miR-34、Notch1及內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

3 ELISA法檢測血清IL-17、IL-10水平 從冰箱中取出IL-17、IL-10 ELISA試劑盒內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品，嚴(yán)格按其說明書將標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，應(yīng)用酶標(biāo)儀(型號(hào)：PT-3502G，北京普天新橋技術(shù)有限公司)檢測不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，制作IL-17、IL-10的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線；室溫下解凍適量血清樣本，平衡10 min，于酶標(biāo)板中加血清樣本，37℃培養(yǎng)箱中孵育約30 min，添加生物素工作液(含IL-17/IL-10抗體)，37℃培養(yǎng)箱中孵育約50 min，棄掉反應(yīng)液，磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)沖洗2次；加顯色液，37℃培養(yǎng)箱中孵育約30 min，加終止反應(yīng)液，于450nm處測定各樣本的吸光度，計(jì)算血清IL-17、IL-10水平。

4 EOS水平檢測 取適量外周血，利用血細(xì)胞分析儀(型號(hào)：普康 PE-6100，濰坊嘉松醫(yī)療器械有限公司)按說明書進(jìn)行常規(guī)操作，檢測EOS水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組一般資料比較

與健康組相比，BA組患兒家族哮喘史、個(gè)人過敏史、家族過敏史均明顯升高(P<0.05)，年齡、男/女構(gòu)成比例無明顯差異(見表2)。

表2 兩組一般資料比較

二、兩組血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比較

與健康組相比，BA組患兒血清miR-34及IL-10水平均降低(P<0.05)，Notch1 mRNA、IL-17、EOS水平均明顯升高(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比較

三、BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達(dá)水平與IL-17、IL-10、EOS的相關(guān)性

Pearson法分析顯示，BA患兒血清miR-34表達(dá)水平與IL-17、EOS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與IL-10呈正相關(guān)(P<0.05)；血清Notch1 mRNA表達(dá)水平與IL-17、EOS呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(見表4)。

表4 BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達(dá)水平與IL-17、IL-10、EOS的相關(guān)性

四、BA患兒血清miR-34表達(dá)水平與Notch1 mRNA相關(guān)性

Pearson法分析顯示，BA患兒血清miR-34表達(dá)水平與Notch1 mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467，P<0.05)(見圖1)。

圖1 BA患兒血清miR-34表達(dá)水平與Notch1 mRNA相關(guān)性

五、 影響B(tài)A發(fā)生的Logistic回歸分析

以miR-34(>0.73=0，0.53～0.73=1,0.23～0.52=2，<0.23=3)、Notch1(<1.28=0，1.28～1.89=1,1.90～2.50=2，>2.5=3)、IL-17(<12.44 ng/L=0，12.44 ng/L～18.54 ng/L=1,18.54 ng/L～24.64 ng/L=2，>24.64 ng/L=3)、IL-10(>12.11 ng/L=0，9.03 ng/L～12.11 ng/L=1,5.95 ng/L～9.02 ng/L=2，<5.95 ng/L=3)、EOS(<0.76 ×109/L=0，0.76 ×109/L～1.17 ×109/L=1,1.18 ×109/L～1.58 ×109/L=2，>1.58 ×109/L=3)、家族哮喘史(無=0，有=1)、個(gè)人過敏史(無=0，有=1)、家族過敏史(無=0，有=1)為自變量，以是否發(fā)BA為因變量(發(fā)生=1，未發(fā)生=0)，Logistic回歸分析顯示，miR-34是影響B(tài)A發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)，Notch1、IL-17、家族哮喘史、個(gè)人過敏史、家族過敏史是影響B(tài)A發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表5)。

表5 Logistic回歸分析發(fā)生BA的影響因素

討 論

BA在兒童中多有發(fā)生，其以氣道重塑、氣道反應(yīng)性增高及慢性氣道炎癥為主要特征，可引發(fā)肺臟乃至全身反應(yīng)，對(duì)患兒健康成長構(gòu)成極大威脅[7-8]。因此，尋找與氣道炎癥有關(guān)、且可早期診斷、評(píng)估BA患兒疾病進(jìn)展的指標(biāo)，及時(shí)防控BA，對(duì)改善患兒生存狀態(tài)有積極意義。

miRNA可參與并調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)、自噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、血管新生等生物過程，與呼吸窘迫綜合征、肺動(dòng)脈高壓、肺癌、BA等相關(guān)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34作為miRNA家族成員，其在非小細(xì)胞肺癌患者血漿中表達(dá)異常，miR-34a/c有望成為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物[11]；另外，Yin等[3]發(fā)現(xiàn)BA患者miR-34表達(dá)下調(diào)，其可能通過影響自噬、氣道重塑過程，從而在BA病變進(jìn)展中起重要作用。以上研究表明，miR-34異常表達(dá)可能與BA類肺部疾病有關(guān)。本研究中BA組患兒血清miR-34表達(dá)下調(diào)，提示miR-34可能在BA發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用，究其原因，低水平miR-34可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬、炎癥反應(yīng)等過程，造成其抑制氣道重塑能力減弱，從而影響B(tài)A發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制有待深入探討。

Notch信號(hào)通路在多種組織/器官發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展中有重要作用，而Notch1是其家族重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在哮喘中呈異常表達(dá)，經(jīng)大豆肽作用后，其表達(dá)水平降低，Notch1信號(hào)通路可能受大豆肽調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制哮喘氣道炎癥反應(yīng)[12]；此外，盛安群等[5]研究顯示過敏性哮喘中Notch1，與IL-17顯著相關(guān)，Notch1可能與炎癥因子相互影響進(jìn)而在過敏性哮喘中發(fā)揮重要作用。以上研究證實(shí)，Notch1可能在氣道炎癥類疾病中起重要作用。本研究中BA組患兒血清Notch1 mRNA表達(dá)上調(diào)，推測，高水平Notch1可能影響相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)，加重氣道炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)BA發(fā)生發(fā)展，具體機(jī)制需進(jìn)一步探究證實(shí)。

Th17細(xì)胞可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，而其分泌的IL-17是影響氣道炎癥反應(yīng)的重要因子，IL-17可通過活化IL-8、IL-6等細(xì)胞因子，募集、活化中性粒細(xì)胞，促進(jìn)多種炎癥因子分泌，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[13]；IL-17在BA患者血清中水平明顯增加，其可輔助判定BA患者氣道炎癥程度[14]。IL-10主要是由Treg細(xì)胞分泌的抑炎因子，其可活化其它抑炎因子，清除/抑制炎癥部位的EOS，從而減輕炎癥反應(yīng)[14]；IL-10在BA患兒中表達(dá)下調(diào)，與BA病情進(jìn)展有關(guān)[15]。此外，氣道局部募集EOS及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是BA發(fā)病的重要機(jī)制，EOS在BA患者中水平升高，與肺功能、疾病進(jìn)展程度密切相關(guān)[16]。本研究中BA組患兒IL-17、EOS水平升高，IL-10水平降低，與前人研究一致[14-16]，提示IL-17、IL-10、EOS可能通過影響氣道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響B(tài)A病變過程，但仍需深入探究具體機(jī)制。

本研究中BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達(dá)水平與IL-17、IL-10、EOS，及miR-34表達(dá)水平與Notch1 mRNA均顯著相關(guān)，提示miR-34、Notch1可能與IL-17、IL-10、EOS，及miR-34與Notch1影響，進(jìn)而協(xié)同影響B(tài)A病理發(fā)展，其機(jī)制有待深入研究。進(jìn)一步研究顯示，miR-34是影響B(tài)A發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，Notch1、IL-17、家族哮喘史、個(gè)人過敏史、家族過敏史是影響B(tài)A發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清miR-34水平降低、Notch1、IL-17水平升高，伴有家族哮喘史、個(gè)人過敏史、家族過敏史均可能增加兒童發(fā)生BA風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)確定上述指標(biāo)有利于臨床早期診斷BA。

綜上所述，BA患兒血清miR-34表達(dá)下調(diào)，Notch1表達(dá)上調(diào)，兩者呈負(fù)相關(guān)，且均與氣道炎癥密切相關(guān)，及時(shí)診斷血清miR-34、Notch1水平，有助于臨床篩查BA患兒。但本研究未深入miR-34、Notch1 mRNA在BA中的具體機(jī)制，且樣本量較少，后期將進(jìn)行探究。