HGF過表達(dá)對(duì)慢阻肺小鼠肺功能、肺動(dòng)脈壓力的影響及其作用機(jī)制

吉圣珺 李敏菁 溫業(yè)良 賴其廷 張培芳

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease)簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，病情呈進(jìn)行性發(fā)展會(huì)引發(fā)肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)，形成慢性肺源性心臟病，無法徹底治愈[1-2]，臨床只能采取對(duì)癥藥物治療緩解慢阻肺患者癥狀，而藥物長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的費(fèi)用和副作用給患者、家庭及社會(huì)均帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[3-5]。因此，尋找慢阻肺的有效治療方法極為重要。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)是一種間充質(zhì)來源的多肽生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮損傷修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡等多重功效[6-7]。有研究報(bào)道，HGF在氣道損傷修復(fù)、肺泡再生等方面起著積極作用[8]。同時(shí)HGF還可逆轉(zhuǎn)肺氣腫的生理和形態(tài)學(xué)變化[9]。但HGF在慢阻肺中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察HGF對(duì)慢阻肺小鼠肺功能及肺動(dòng)脈壓力的影響，并探討其作用機(jī)制。

資料與方法

一、材料

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～22 g，我院醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對(duì)濕度45～65%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

2 主要試劑和儀器 主要試劑：不攜帶HGF基因的腺病毒載體和攜帶HGF基因的腺病毒載體均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)；萬寶路牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；PI3K抑制劑LY294002(美國(guó)Sigma公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑盒(美國(guó)Life technologies公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2×)(美國(guó)ThermoFisher公司)；鼠源HGF、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(上海榮盛生物技術(shù)有限公司)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(10×)(上海芳甸生物科技有限公司)，TUNEL試劑盒(美國(guó)Promega公司)，Apelin檢測(cè)試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)。

主要儀器：多參數(shù)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，動(dòng)物多導(dǎo)生理記錄儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，UV-1900型紫外分光光度計(jì)(讓奇(上海)儀器科技有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(美國(guó)ThermoFisher)，All-in-One 熒光顯微成像系統(tǒng) BZ-X(基恩士 (中國(guó)) 有限公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 慢阻肺模型的建立及分組 40只C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，以隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、HGF組、HGF+LY294002組，每組10只。除對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水外，模型組、HGF組、HGF+LY294002組3組小鼠均參照文獻(xiàn)[10]以香煙塵霧顆粒(Cigarette dust particles，DSP)經(jīng)鼻腔滴入法建立慢阻肺小鼠模型。具體過程為：⑴制備DSP溶液：取除去濾嘴的3支萬寶路牌香煙(焦油量：12 mg，煙氣煙堿量：0.9 mg，煙氣一氧化碳量：12 mg，煙長(zhǎng)：84 mm)，用裝有1 mL蒸餾水的水煙斗(連接真空吸塵器)收集煙霧，水煙斗接口處用無菌棉花濾過，獲得DSP溶液，無菌條件下吸取上述方法制備的 DSP 3 μL于2 mL 離心管中，加1 mL無菌生理鹽水，混勻，配制成 3 mL/L DSP溶液。⑵DSP誘導(dǎo)慢阻肺模型：各組小鼠分別采用乙醚短暫麻醉，每天分別滴鼻3 mL/L DSP溶液，每只20 μL，連續(xù)滴鼻30 d。造模后觀察到小鼠活動(dòng)減少，呼吸急促，伴喘息、咳嗽，嚴(yán)重者聽診可聞及濕啰音，反應(yīng)靈敏度變差，進(jìn)食下降，體重逐漸減輕，肺組織HE染色病理切片顯示肺部支氣管壁增厚，管腔嚴(yán)重變形，肺部可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合形成較大的囊腔，即為造模成功。

2 動(dòng)物處理 模型建立成功后第2天，模型組小鼠氣管內(nèi)滴入不攜帶HGF基因的腺病毒2×109pfu/只，HGF 組小鼠氣管內(nèi)滴入攜帶 HGF 基因的腺病毒2×109pfu/只，HGF+LY294002組小鼠氣管內(nèi)滴入攜帶 HGF 基因腺病毒2×109pfu/只，同時(shí)尾靜脈注射LY294002(2.0mg/kg)，對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴入同等劑量的等張力生理鹽水。在相同條件下單籠飼養(yǎng)4周，肺功能指標(biāo)及肺動(dòng)脈壓力指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后處死小鼠留取肺組織，一部分-80℃保存，一部分用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，備用。

3 肺功能及肺動(dòng)脈壓力檢測(cè) 各組小鼠給予戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒頸部皮膚，剪開頸部皮膚，分離血管和肌肉，暴露主支氣管，用鑷子將縫合線置于氣管底部，局部按壓進(jìn)行止血，以剪刀切開主氣管小口，避免血液進(jìn)入氣管，置入氣管插管，以縫合線固定后，連接多參數(shù)肺功能檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠的潮氣量(Tidal volume，TV)、呼氣峰流速(Peak expiratory flow，PEF)、吸氣峰流速(Peak inspiratory flow，PIF)、0.3秒用力呼氣量(0.3 sec forced expiratory volume，F(xiàn)EV0.3)，0.3秒用力呼氣量與用力肺活量比(0.3 sec forced expiratory volume to forced vital capacity ratio，F(xiàn)EV0.3/FVC)。同時(shí)將充入2%肝素鈉的聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)小鼠右側(cè)頸部靜脈插管右心至肺動(dòng)脈干，連接壓力換能器，穩(wěn)定10 min后，采用動(dòng)物多導(dǎo)生理記錄儀記錄各組小鼠平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)。

4 ELISA測(cè)定肺組織Apelin水平 取各組小鼠肺組織勻漿標(biāo)本，4 ℃低溫下10000 r/min離心5 min，收集上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作檢測(cè)Apelin水平，在紫外分光光度計(jì)上于450 nm處檢測(cè)吸光(OD)值，根據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)Apelin含量，乘以稀釋倍數(shù)即可。

5 RT-PCR檢測(cè)肺組織HGF mRNA表達(dá) 取各組小鼠肺組織樣品0.02 g，加入Trizol試劑1 mL，液氮條件下將肺組織充分研磨，室溫靜置5 min提取RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，A260/280在1.8～2.1范圍內(nèi)即可。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)HGF mRNA水平，RT-PCR反應(yīng)體系為：Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，加雙蒸水(Water distillated two times，ddH2O)補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。HGF上游引物：5′-AGCTCAGAACCGACCGGCTTGCAACAGGAT-3′；下游引物：5′-TTACCAATGATGCAAT-TTCTAATATAGTCT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-TCTTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′；下游引物：5′-CG-TTTCTGCGCCGTTAGGT-3′；采用2-△△Ct計(jì)算分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

6 Western blot檢測(cè)肺組織HGF、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表達(dá) 取各組小鼠肺組織樣品0.02 g，充分研磨后，用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)洗3次，加入5 %脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h，PBST洗滌后加入HGF抗體(1 ∶500)、Caspase-3抗體(1 ∶500)、Bcl-2抗體(1 ∶500)、PI3K抗體(1 ∶500)、p-PI3K抗體(1 ∶500)、Akt抗體(1 ∶500)、p-Akt抗體(1 ∶500)和β-actin抗體(1 ∶5000)孵育，4 ℃過夜，用PBS洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶1000)，室溫孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，圖像分析系統(tǒng)分析統(tǒng)計(jì)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取各組小鼠肺組織標(biāo)本石蠟切片脫蠟水化，PBS徹底沖洗，滴加稀釋后的蛋白酶 K 工作液，37 ℃反應(yīng)30 min，平衡緩沖液孵育20 min，PBS洗滌3次，擦干切片周圍緩沖液，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光反應(yīng) 60 min，置于DAPI染色液中孵育30 min，前后PBS 沖洗 3 次，加50 μL DAB底物(×20)，室溫下反應(yīng)10 min，蘇木精復(fù)染3 min，然后脫水、透明、中性樹膠封片，采用熒光顯微鏡觀察采集圖像，倍數(shù)為40*10倍。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈綠色的細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取 5 個(gè)視野拍照，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI =凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組小鼠肺功能及肺動(dòng)脈壓力比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺功能指標(biāo)TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著降低(P<0.05)，mPAP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，HGF組小鼠肺功能指標(biāo)TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著升高(P<0.05)，mPAP水平顯著降低(P<0.05)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺功能指標(biāo)TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著降低(P<0.05)，mPAP水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠肺功能及肺動(dòng)脈壓力比較

二、各組小鼠肺組織Apelin水平比較

各組小鼠肺組織Apelin水平均有顯著性差異(F=18.461，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織Apelin水平顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織Apelin水平顯著升高(P<0.05)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織Apelin水平顯著降低(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織Apelin水平比較

三、各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著性差異(F=16.735，P<0.001；F=15.081，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.001；P<0.001)，HGF組和HGF+LY294002組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，HGF組和HGF+LY294002組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(見圖2A、B)。

圖2 各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

四、各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均有顯著性差異(F=21.468，P<0.001；F=20.726，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)(見圖3A、3B)。

圖3 各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

五、各組小鼠肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較

各組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均有顯著性差異(F=19.400，P<0.001；F=17.800，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.001；P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著升高(P<0.001；P<0.001)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.001；P<0.001)(見圖4A、4B、4C)。

圖4 各組小鼠肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較

六、各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況比較

各組小鼠肺組織AI均有顯著性差異(F=31.667，P<0.001)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織AI顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織AI顯著降低(P<0.001)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織AI顯著升高(P<0.001)(見圖5A，5B)。

圖5 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況比較(×400)

討 論

慢阻肺是一種呼吸系統(tǒng)常見病和多發(fā)病，慢阻肺發(fā)生會(huì)引起患者肺功能下降、肺動(dòng)脈壓力升高，進(jìn)而引發(fā)一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者生命健康，當(dāng)前臨床上該疾病以藥物對(duì)癥治療為主，療效有限，尚無明確治愈慢阻肺的有效措施[11]。HGF作為一種多效性生長(zhǎng)因子，在肺部上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著調(diào)節(jié)功能，同時(shí)，還可促進(jìn)肺支氣管上皮細(xì)胞增生和肺上皮組織形成[12]。已有研究報(bào)道，腺病毒介導(dǎo)的外源性HGF基因在慢阻肺修復(fù)中起一定作用[13]。但HGF作用于慢阻肺的分子機(jī)制尚不清楚。

TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC是臨床常用反映肺功能的重要指標(biāo)，mPAP則是影響慢阻肺預(yù)后的重要因素，肺動(dòng)脈壓力越高，疾病病程越短，病死率越高，早期檢測(cè)肺動(dòng)脈壓力并阻斷PH形成，對(duì)慢阻肺的防治以及降低病死率具有指導(dǎo)意義。王偉等研究報(bào)道，攜帶外源性HGF基因的腺病毒經(jīng)支氣管滴入PH家兔模型，可有效降低肺動(dòng)脈壓力[14]。本研究通過DSP經(jīng)鼻腔滴入法建立慢阻肺小鼠模型，探究HGF過表達(dá)對(duì)慢阻肺小鼠肺功能和肺動(dòng)脈壓力的影響，結(jié)果顯示，HGF過表達(dá)，顯著改善了慢阻肺小鼠TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC，肺功能指標(biāo)水平和mPAP水平。說明 HGF過表達(dá)對(duì)于改善慢阻肺疾病具有良好的效果。

慢阻肺繼發(fā)PH疾病是慢阻肺患者急性加重甚至死亡的主要原因之一[15]，目前臨床認(rèn)為慢阻肺繼發(fā)PH疾病主要與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損相關(guān)，肺內(nèi)皮細(xì)胞受損后，血管調(diào)節(jié)因子分泌異常，使得血管平滑肌促有絲分裂和抗有絲分裂失衡，導(dǎo)致血管收縮、重塑，肺動(dòng)脈壓升高[16]。Apelin是一種小分子活性多肽，亦是內(nèi)源性血管舒張因子，對(duì)機(jī)體多種細(xì)胞和器官具有保護(hù)作用[17]。Kleinz等[18]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Apelin主要存在于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，其在調(diào)節(jié)肺血管循環(huán)穩(wěn)態(tài)方面，具有特殊的生理病理意義。本研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺小鼠肺組織中Apelin水平明顯降低，HGF過表達(dá)可以有效增加小鼠肺組織Apelin分泌，進(jìn)而調(diào)控肺血管循環(huán)狀態(tài)，改善肺動(dòng)脈壓力。

大量臨床研究表明細(xì)胞凋亡在慢阻肺發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，一方面，慢阻肺患者肺內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞過度凋亡會(huì)引起肺部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致肺氣腫形成；另一方面，肺內(nèi)炎癥細(xì)胞凋亡不足，促使過度激活、聚集致使肺部炎癥持續(xù)加劇，最終損害氣道及肺血管內(nèi)皮功能，導(dǎo)致氣道阻塞及PH發(fā)生[19]。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞存活、增殖、凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PI3K是一種能夠影響細(xì)胞多種生物學(xué)功能的磷脂酰肌醇激酶，HGF可通過激活PI3K發(fā)揮生物學(xué)活性，PI3K調(diào)節(jié)亞基與HGF受體上磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，使PI3K磷酸化得以激活，進(jìn)而促使PI3K配體Akt轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，從而磷酸化多種蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、影響細(xì)胞生存等效應(yīng)[20-22]。Bcl-2是一種典型的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用；有研究表明[23]，細(xì)胞凋亡開始時(shí)Bcl-2向線粒體中釋放信號(hào)，促進(jìn)凋亡激活Caspase-3，導(dǎo)致DNA斷裂，引起細(xì)胞骨架及內(nèi)膜缺損，直至細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族成員發(fā)生級(jí)聯(lián)式反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡的激活途徑終點(diǎn)，屬于各種凋亡刺激因子被激活的關(guān)鍵酶，其水平可反映細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度[24]。本研究觀察到慢阻肺小鼠肺組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。HGF過表達(dá)能夠顯著改善凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)慢阻肺小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況；同時(shí)，慢阻肺小鼠中HGF過表達(dá)能夠促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)分子磷酸化，而PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后HGF過表達(dá)的作用效果消失，提示HGF通過激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，HGF可通過增加肺組織Apelin分泌、抑制肺組織細(xì)胞凋亡達(dá)到改善慢阻肺小鼠肺功能和肺動(dòng)脈壓力的目的，其作用機(jī)制可能由PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)。本研究為臨床探索HGF治療慢阻肺提供了新的靶點(diǎn)通路。本研究?jī)H從PI3K/Akt信號(hào)通路方向研究了HGF對(duì)慢阻肺的作用效果，HGF可能通過其他信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)慢阻肺的作用，還需進(jìn)一步深入研究。