ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器組織、抗氧化指標及免疫功能的影響

劉淑杰，鄧 波，吳 杰，徐子偉*，馬倩倩

（1.浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150036）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由鐮刀屬真菌產生、具有類雌激素活性的次級代謝產物。ZEN可與機體內的雌激素受體結合，迅速激活雌激素的反應元件，對動物和人產生強烈的生殖毒性，造成繁殖功能障礙。ZEN還具有較強免疫毒性，能降低動物血液抗體水平，擾亂細胞因子正常分泌。另外，ZEN能改變動物血清抗氧化酶活性和活性氧水平（ROS），導致脂質過氧化，造成機體氧化應激損傷。ZEN高污染率、超標率和強烈致毒性給畜牧業(yè)造成不可估量的經濟損失，向ZEN污染飼料中添加吸附劑是一種經濟、環(huán)保且高效的脫毒方法。目前常采用硅鋁酸鹽類吸附劑，但這些吸附劑對霉菌毒素具有選擇性吸附，對ZEN、煙曲霉毒素及單端孢霉烯族毒素等的吸附性較弱，甚至不吸附。因此，研發(fā)新型且吸附力強的霉菌毒素吸附劑成為研究重點。植物炭黑主要由稻草、麥秸和雜草等不完全燃燒產生，無毒，微孔結構多，比表面積大，對毒素、有害微生物等具有很強吸附力，極有可能成為一種新型、高效的霉菌毒素吸附劑。鑒于此，本研究以SD大鼠為試驗動物，向ZEN污染的飼料中添加不同水平的植物炭黑，研究其對大鼠臟器組織、抗氧化指標及免疫功能的影響，為植物炭黑應用于畜禽生產及飼料行業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 植物炭黑由福建省順昌碳娃娃生物科技有限公司提供，ZEN（編號17924-92-4）購自加拿大Triplebond Corporation公司。白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（編號分別為H002、H003、H009、H052、A001-1、A003-1、A005和A015）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設計 64只5～6周齡SPF級SD雌性大鼠購自浙江省實驗動物中心，體重約150 g。大鼠單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度40%～70%，光照周期12 h明、12 h暗，氨氣濃度≤14 mg/mL，自由采食和飲水。大鼠隨機分為4個處理，每個處理16個重復，每個重復1只。試驗組分別為空白對照組（基礎日糧）、負對照組（基礎日糧+ZEN 25 mg/kg）、低劑量植物炭黑組（基礎日糧+ZEN 25 mg/kg+1 g/kg 植物炭黑）、高劑量植物炭黑組（基礎日糧+ZEN 25 mg/kg+1.5 g/kg 植物炭黑）。適應期7 d，第8天開始正式試驗，正試期28 d?；A日糧購自浙江省實驗動物中心，日糧組成及營養(yǎng)水平如表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 測定指標和方法

1.3.1 血清細胞因子水平 在試驗第14天和第28天，所有試驗大鼠眶下靜脈采血，在4℃條件下放置12 h，然后3 000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA方法測定血清細胞因子IL-1、IL-2、IL-10和TNF-濃度，根據試劑盒操作說明進行檢測。

1.3.2 組織病理學檢測與臟器指數 在試驗第14天和28天，各組分別取8只大鼠處以安樂死，迅速剖開腹腔，剖取大鼠的肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮組織進行稱重，記錄數據并計算臟器指數，臟器指數=（器官鮮重/活重）×100%。然后取大鼠右側子宮和肝臟，截取子宮中段，長度3～5 cm，截取寬度約1 cm的肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，然后將子宮和肝臟組織放入10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色，顯微鏡下觀察大鼠子宮和肝臟結構形態(tài)，用于病理學分析。

1.3.3 肝臟抗氧化指標 在試驗第14天和28天，取安樂死大鼠的肝臟，準確稱取組織重量，按重量體積比加入10倍的生理鹽水，制成組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，采用分光光度法測定T-AOC和MDA濃度、GSH-Px和SOD活性。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0進行單因素方差分析（Oneway ANOVA），Duncan′s法多重比較，結果以平均值±標準差表示，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠子宮和肝臟組織學影響 由圖1可知，在試驗第14天和第28天，空白對照組的子宮結構清晰，分層清楚，子宮內膜呈明顯波浪形，內陷較淺且較少，宮腔相對較小，固有層中有少量腺體。與對照組比較，負對照組子宮結構尚存在，但內膜明顯內陷深而且多，腺體數量明顯增多，腺腔變大；試驗第14天和第28天低劑量植物炭黑組和高劑量組的子宮情況較負對照組明顯好轉。

圖1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠子宮組織學影響

由圖2可知，試驗第14天和第28天，空白對照組肝臟組織結構清楚，肝細胞呈放射狀排列，肝細胞未見明顯的變性、壞死；肝血竇存在內見少量紅細胞，匯管區(qū)未見炎癥細胞浸潤和纖維組織增生；負對照組肝組織結構尚清楚，肝細胞明顯濁腫變性，部分甚至空泡化，少量脂肪變性、偶見點狀壞死，未見灶性和橋接壞死，部分肝細胞核固縮、凋亡；肝血竇變小或消失；匯管區(qū)偶可見少量炎癥細胞浸潤，未見纖維組織增生。低劑量植物炭黑組和高劑量組的肝臟損傷程度較負對照組均有減輕，其中高劑量組更為明顯。

圖2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟組織學影響

2.2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器指數影響由表2可知，在試驗第14天和28天，與空白對照組相比，負對照組大鼠的肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮的臟器指數無顯著變化；與負對照組和空白對照組相比，低劑量植物炭黑組和高劑量組大鼠肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮的臟器指數無顯著變化。

表2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器指數影響 %

2.3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟抗氧化指標影響 由表3可知，在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負對照組肝臟SOD活性分別降低了12.34%（＜0.01）和7.06%（＜0.05）；在試驗第14天，高劑量植物炭黑組SOD活性比負對照組升高了8.01%（＜0.05）。在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負對照組MDA濃度分別升高了30.28%（＜0.05）和29.66%（＜0.01）；在試驗第28天，高劑量植物炭黑組MDA濃度比負對照組降低了16.99%（＜0.01）。在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負對照組GSH-Px活性分別降低了59.72%和26.85%（＜0.01）；高劑量植物炭黑組GSH-Px活性較負對照組分別升高了40.27%和29.78%（＜0.01）。在試驗第14天，負對照組T-AOC濃度較空白對照組降低了53.85%（＜0.01）；與負對照組相比，低劑量植物炭黑組和高劑量組T-AOC濃度均升高了66.67%（＜0.01）；在試驗第28天，各組間T-AOC濃度差異不顯著。

表3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟抗氧化指標影響

2.4 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠血清細胞因子濃度影響 由表4可知，在試驗第14天和第28天，負對照組血清IL-2濃度較空白對照組分別升高了17.38%和13.85%（＜0.01），高劑量植物炭黑組IL-2濃度較負對照組分別降低了28.00%和17.38%（＜0.01）。在試驗第14天和第28天，負對照組的IL-10濃度較空白對照組分別降低了18.96%（＜0.01）和13.73%（＜0.05）；在試驗第14天，低劑量植物炭黑組和高劑量組的IL-10濃度較負對照組分別升高了20.32%和20.99%（＜0.01）。在試驗第14天，負對照組的TNF-濃度較空白對照組升高了20.91%（＜0.01），高劑量組TNF-濃度與其他各組差異不顯著；在試驗第28天，各組間TNF-濃度差異不顯著。

表4 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠血清細胞因子濃度影響

3 討 論

3.1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器組織影響ZEN具有較強的生殖毒性，能夠引起動物生殖器官結構形態(tài)改變，導致生殖系統(tǒng)功能障礙。研究顯示，ZEN可誘導不同時期小鼠子宮細胞凋亡，上調Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2表達。飼料中含有0.5 mg/kg ZEN能夠使斷奶小母豬子宮肌層和內膜明顯增厚，子宮腺數量明顯增多，子宮形態(tài)改變。本研究結果顯示，與對照組相比，負對照組的子宮結構尚存在，但內膜明顯內陷深而且多，腺體數量明顯增多，腺腔變大，與前人報道結果相似。ZEN對子宮損傷程度與其劑量、動物種類及所處生理狀態(tài)相關，在本試驗中第14天和28天，ZEN污染飼料中添加低劑量和高劑量植物炭黑組大鼠的子宮形態(tài)結構明顯好轉，說明植物炭黑緩解了由ZEN造成的子宮不利影響，對子宮結構和功能具有改善作用。

肝臟是ZEN代謝的主要器官，當動物長期采食過量ZEN可造成肝臟損傷病變。研究顯示，1 mg/kg ZEN可導致斷奶小母豬肝臟中央靜脈周圍的肝細胞出現泡狀變性，淋巴浸潤。50 mg/kg ZEN可導致發(fā)情期小鼠肝細胞索發(fā)生紊亂，肝細胞脂肪變性，部分肝細胞核體積增大，雙核肝細胞增多，可見局灶性壞死。本研究結果顯示，負對照組肝細胞明顯濁腫變性，部分甚至空泡化，少量脂肪變性，部分肝細胞核固縮、凋亡，肝血竇變小或消失，匯管區(qū)偶可見少量炎癥細胞浸潤；而低劑量植物炭黑組和高劑量組的肝臟損傷情況較負對照組均有所減輕，其中以高劑量組最為明顯，說明植物炭黑對肝臟具有保護作用。

本研究顯示，大鼠采食ZEN污染飼料對肝臟、子宮、胸腺和脾臟等臟器指數無顯著影響。姚寶強研究顯示，飼料中添加1 mg/kg ZEN對肝臟、腎臟、脾臟等器官指數無影響。灌服40 mg/kg BW ZEN的小鼠子宮和腎臟指數顯著升高，脾臟和肝臟指數顯著降低。飼喂含有500 μg/kg ZEN飼料28 d可顯著降低雌性大鼠脾臟指數，飼喂含有300、400、500 μg/kg ZEN飼料42 d后肝臟指數顯著低于對照組，腎臟指數無顯著變化。這些說明ZEN可導致動物組織器官萎縮或發(fā)育不全，而影響程度與ZEN濃度和動物攝入持續(xù)時間有關。本研究中，病理切片結果顯示ZEN對子宮和肝臟有不同程度損傷，但大鼠采食含有25 mg/kg ZEN飼料及不同劑量的植物炭黑飼料對子宮、肝臟以及各臟器指數無顯著影響。

3.2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對肝臟抗氧化指標影響 正常生理狀態(tài)下機體存在抗氧化系統(tǒng)，能夠及時清理產生過多的自由基，使得氧化與抗氧化系統(tǒng)保持動態(tài)平衡。當動物攝入過量ZEN可造成機體自由基濃度過高，從而引起氧化應激反應，造成組織器官氧化損傷。高鑫研究發(fā)現，飼料中含有10 mg/kg和20 mg/kg ZEN可著降低妊娠期母鼠血清SOD和GSH-Px活性，提高MDA濃度；飼料中含有 1.0 mg/kg ZEN可顯著增加斷奶仔豬肝臟MDA濃度，顯著降低T-AOC濃度、SOD和GSH-Px活性，這與本試驗結果一致。以上說明，ZEN引起大鼠氧化應激反應，造成自由基的產生超過機體的清除能力，對大鼠肝臟造成氧化損傷，這與肝臟的組織切片病理結果相一致。

向霉菌毒素污染飼料中添加吸附劑可不同程度緩解毒素對動物機體造成的氧化損傷。高鑫研究顯示，向飼料中添加水飛薊素可緩解由ZEN導致的大鼠肝臟MDA濃度升高，SOD和GSH-Px活性下降。向ZEN污染飼料中添加0.2%霉菌毒素脫毒劑BZ可顯著提高肉雞血清GSH-Px活性，降低MDA濃度。向含有0.4 mg/kg ZEN飼料中添加0.15 %改性蒙脫石吸附劑CA能夠提高血清GSH-Px和SOD活性，降低MDA濃度。本研究結果顯示，向ZEN污染飼料中添加低劑量植物炭黑顯著提高了試驗第14天T-AOC濃度，對MDA濃度、SOD和GSH-Px活性具有改善的趨勢；添加高劑量植物炭黑顯著提高第14天SOD活性，極顯著提高T-AOC濃度，極顯著提高第14天和第28天的GSH-Px活性，極顯著降低第28天MDA活性，說明添加高劑量植物炭黑能夠有效吸附飼料中的ZEN，增強了機體對自由基的清除能力，改善由ZEN所導致對肝臟的氧化損傷。

3.3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對血液免疫指標影響 ZEN具有較強的免疫毒性，能夠引起機體炎癥反應，損傷免疫系統(tǒng)。研究顯示，ZEN可增加斷奶仔豬脾臟TNF-、IL-8、IL-6和IL-1mRNA表達量。飼料中含有150 mg/kg ZEN可增加懷孕大鼠脾臟IL-6、IL-18和IL-1mRNA表達量，降低TNF-、IFN-和IL-10 mRNA表達量。飼料中含有1 mg/kg ZEN顯著降低斷奶仔豬外周血和脾臟淋巴細胞增殖率以及IL-2濃度。由于不同種類動物對ZEN的敏感性、攝入劑量和持續(xù)時間不同，ZEN免疫毒性也呈現很大差異。本研究顯示，ZEN極顯著增加了試驗第14天和第28天血清IL-2濃度，極顯著降低第14天IL-10濃度，顯著降低第28天IL-10濃度，極顯著增加第14天TNF-濃度。說明飼料中含有25 mg/kg ZEN可誘導大鼠炎癥反應，造成細胞因子濃度改變，對免疫系統(tǒng)造成一定的損傷。

向霉菌毒素污染飼料中添加吸附劑可不同程度提高動物機體免疫力。本研究顯示，向ZEN污染飼料中添加低劑量植物炭黑顯著降低了試驗第14天大鼠血清TNF-濃度，極顯著提高IL-10濃度；高劑量植物炭黑能夠極顯著降低第14天和第28天IL-2濃度，極顯著提高第14天的IL-10濃度，顯著降低第14天的TNF-濃度，且與空白對照組相比差異不顯著。關于吸附劑調節(jié)ZEN誘導炎癥反應的文獻報道較少，李丹等研究顯示，飼料中添加0.2 mg/kg和0.4 mg/kg殼聚糖硒可降低ZEN導致的小鼠血漿TNF-a和IL-18濃度升高。向含有1 mg/kg ZEN飼料中添加4 g/kg改性蒙脫石可顯著改善ZEN誘導的脾臟和外周血淋巴細胞增殖率以及IL-2濃度改變。本試驗中，植物炭黑降低了ZEN對大鼠的毒性作用，通過調節(jié)TNF-、IL-10和IL-2濃度來緩解ZEN所誘導的炎癥反應，提高機體免疫功能，并且高劑量植物炭黑效果優(yōu)于低劑量。

4 結 論

本試驗結果顯示，植物炭黑能夠改善采食ZEN污染飼料大鼠的子宮、肝臟形態(tài)結構，提高了機體抗氧化功能和免疫功能，緩解ZEN對機體的損傷，推薦植物炭黑適宜添加劑量為1.5 g/kg。