ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器組織、抗氧化指標(biāo)及免疫功能的影響

劉淑杰，鄧 波，吳 杰，徐子偉*，馬倩倩

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由鐮刀屬真菌產(chǎn)生、具有類雌激素活性的次級代謝產(chǎn)物。ZEN可與機(jī)體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，迅速激活雌激素的反應(yīng)元件，對動物和人產(chǎn)生強(qiáng)烈的生殖毒性，造成繁殖功能障礙。ZEN還具有較強(qiáng)免疫毒性，能降低動物血液抗體水平，擾亂細(xì)胞因子正常分泌。另外，ZEN能改變動物血清抗氧化酶活性和活性氧水平（ROS），導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，造成機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。ZEN高污染率、超標(biāo)率和強(qiáng)烈致毒性給畜牧業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，向ZEN污染飼料中添加吸附劑是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且高效的脫毒方法。目前常采用硅鋁酸鹽類吸附劑，但這些吸附劑對霉菌毒素具有選擇性吸附，對ZEN、煙曲霉毒素及單端孢霉烯族毒素等的吸附性較弱，甚至不吸附。因此，研發(fā)新型且吸附力強(qiáng)的霉菌毒素吸附劑成為研究重點。植物炭黑主要由稻草、麥秸和雜草等不完全燃燒產(chǎn)生，無毒，微孔結(jié)構(gòu)多，比表面積大，對毒素、有害微生物等具有很強(qiáng)吸附力，極有可能成為一種新型、高效的霉菌毒素吸附劑。鑒于此，本研究以SD大鼠為試驗動物，向ZEN污染的飼料中添加不同水平的植物炭黑，研究其對大鼠臟器組織、抗氧化指標(biāo)及免疫功能的影響，為植物炭黑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)及飼料行業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 植物炭黑由福建省順昌碳娃娃生物科技有限公司提供，ZEN（編號17924-92-4）購自加拿大Triplebond Corporation公司。白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（編號分別為H002、H003、H009、H052、A001-1、A003-1、A005和A015）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設(shè)計 64只5～6周齡SPF級SD雌性大鼠購自浙江省實驗動物中心，體重約150 g。大鼠單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度40%～70%，光照周期12 h明、12 h暗，氨氣濃度≤14 mg/mL，自由采食和飲水。大鼠隨機(jī)分為4個處理，每個處理16個重復(fù)，每個重復(fù)1只。試驗組分別為空白對照組（基礎(chǔ)日糧）、負(fù)對照組（基礎(chǔ)日糧+ZEN 25 mg/kg）、低劑量植物炭黑組（基礎(chǔ)日糧+ZEN 25 mg/kg+1 g/kg 植物炭黑）、高劑量植物炭黑組（基礎(chǔ)日糧+ZEN 25 mg/kg+1.5 g/kg 植物炭黑）。適應(yīng)期7 d，第8天開始正式試驗，正試期28 d。基礎(chǔ)日糧購自浙江省實驗動物中心，日糧組成及營養(yǎng)水平如表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 血清細(xì)胞因子水平 在試驗第14天和第28天，所有試驗大鼠眶下靜脈采血，在4℃條件下放置12 h，然后3 000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA方法測定血清細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-10和TNF-濃度，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。

1.3.2 組織病理學(xué)檢測與臟器指數(shù) 在試驗第14天和28天，各組分別取8只大鼠處以安樂死，迅速剖開腹腔，剖取大鼠的肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮組織進(jìn)行稱重，記錄數(shù)據(jù)并計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=（器官鮮重/活重）×100%。然后取大鼠右側(cè)子宮和肝臟，截取子宮中段，長度3～5 cm，截取寬度約1 cm的肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，然后將子宮和肝臟組織放入10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色，顯微鏡下觀察大鼠子宮和肝臟結(jié)構(gòu)形態(tài)，用于病理學(xué)分析。

1.3.3 肝臟抗氧化指標(biāo) 在試驗第14天和28天，取安樂死大鼠的肝臟，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入10倍的生理鹽水，制成組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，采用分光光度法測定T-AOC和MDA濃度、GSH-Px和SOD活性。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），Duncan′s法多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠子宮和肝臟組織學(xué)影響 由圖1可知，在試驗第14天和第28天，空白對照組的子宮結(jié)構(gòu)清晰，分層清楚，子宮內(nèi)膜呈明顯波浪形，內(nèi)陷較淺且較少，宮腔相對較小，固有層中有少量腺體。與對照組比較，負(fù)對照組子宮結(jié)構(gòu)尚存在，但內(nèi)膜明顯內(nèi)陷深而且多，腺體數(shù)量明顯增多，腺腔變大；試驗第14天和第28天低劑量植物炭黑組和高劑量組的子宮情況較負(fù)對照組明顯好轉(zhuǎn)。

圖1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠子宮組織學(xué)影響

由圖2可知，試驗第14天和第28天，空白對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見明顯的變性、壞死；肝血竇存在內(nèi)見少量紅細(xì)胞，匯管區(qū)未見炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生；負(fù)對照組肝組織結(jié)構(gòu)尚清楚，肝細(xì)胞明顯濁腫變性，部分甚至空泡化，少量脂肪變性、偶見點狀壞死，未見灶性和橋接壞死，部分肝細(xì)胞核固縮、凋亡；肝血竇變小或消失；匯管區(qū)偶可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，未見纖維組織增生。低劑量植物炭黑組和高劑量組的肝臟損傷程度較負(fù)對照組均有減輕，其中高劑量組更為明顯。

圖2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟組織學(xué)影響

2.2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器指數(shù)影響由表2可知，在試驗第14天和28天，與空白對照組相比，負(fù)對照組大鼠的肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮的臟器指數(shù)無顯著變化；與負(fù)對照組和空白對照組相比，低劑量植物炭黑組和高劑量組大鼠肝臟、胸腺、脾臟、腎臟、卵巢和子宮的臟器指數(shù)無顯著變化。

表2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器指數(shù)影響 %

2.3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟抗氧化指標(biāo)影響 由表3可知，在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負(fù)對照組肝臟SOD活性分別降低了12.34%（＜0.01）和7.06%（＜0.05）；在試驗第14天，高劑量植物炭黑組SOD活性比負(fù)對照組升高了8.01%（＜0.05）。在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負(fù)對照組MDA濃度分別升高了30.28%（＜0.05）和29.66%（＜0.01）；在試驗第28天，高劑量植物炭黑組MDA濃度比負(fù)對照組降低了16.99%（＜0.01）。在試驗第14天和第28天，與空白對照組相比，負(fù)對照組GSH-Px活性分別降低了59.72%和26.85%（＜0.01）；高劑量植物炭黑組GSH-Px活性較負(fù)對照組分別升高了40.27%和29.78%（＜0.01）。在試驗第14天，負(fù)對照組T-AOC濃度較空白對照組降低了53.85%（＜0.01）；與負(fù)對照組相比，低劑量植物炭黑組和高劑量組T-AOC濃度均升高了66.67%（＜0.01）；在試驗第28天，各組間T-AOC濃度差異不顯著。

表3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠肝臟抗氧化指標(biāo)影響

2.4 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠血清細(xì)胞因子濃度影響 由表4可知，在試驗第14天和第28天，負(fù)對照組血清IL-2濃度較空白對照組分別升高了17.38%和13.85%（＜0.01），高劑量植物炭黑組IL-2濃度較負(fù)對照組分別降低了28.00%和17.38%（＜0.01）。在試驗第14天和第28天，負(fù)對照組的IL-10濃度較空白對照組分別降低了18.96%（＜0.01）和13.73%（＜0.05）；在試驗第14天，低劑量植物炭黑組和高劑量組的IL-10濃度較負(fù)對照組分別升高了20.32%和20.99%（＜0.01）。在試驗第14天，負(fù)對照組的TNF-濃度較空白對照組升高了20.91%（＜0.01），高劑量組TNF-濃度與其他各組差異不顯著；在試驗第28天，各組間TNF-濃度差異不顯著。

表4 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠血清細(xì)胞因子濃度影響

3 討 論

3.1 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對大鼠臟器組織影響ZEN具有較強(qiáng)的生殖毒性，能夠引起動物生殖器官結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)功能障礙。研究顯示，ZEN可誘導(dǎo)不同時期小鼠子宮細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Bcl-2表達(dá)。飼料中含有0.5 mg/kg ZEN能夠使斷奶小母豬子宮肌層和內(nèi)膜明顯增厚，子宮腺數(shù)量明顯增多，子宮形態(tài)改變。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，負(fù)對照組的子宮結(jié)構(gòu)尚存在，但內(nèi)膜明顯內(nèi)陷深而且多，腺體數(shù)量明顯增多，腺腔變大，與前人報道結(jié)果相似。ZEN對子宮損傷程度與其劑量、動物種類及所處生理狀態(tài)相關(guān)，在本試驗中第14天和28天，ZEN污染飼料中添加低劑量和高劑量植物炭黑組大鼠的子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，說明植物炭黑緩解了由ZEN造成的子宮不利影響，對子宮結(jié)構(gòu)和功能具有改善作用。

肝臟是ZEN代謝的主要器官，當(dāng)動物長期采食過量ZEN可造成肝臟損傷病變。研究顯示，1 mg/kg ZEN可導(dǎo)致斷奶小母豬肝臟中央靜脈周圍的肝細(xì)胞出現(xiàn)泡狀變性，淋巴浸潤。50 mg/kg ZEN可導(dǎo)致發(fā)情期小鼠肝細(xì)胞索發(fā)生紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性，部分肝細(xì)胞核體積增大，雙核肝細(xì)胞增多，可見局灶性壞死。本研究結(jié)果顯示，負(fù)對照組肝細(xì)胞明顯濁腫變性，部分甚至空泡化，少量脂肪變性，部分肝細(xì)胞核固縮、凋亡，肝血竇變小或消失，匯管區(qū)偶可見少量炎癥細(xì)胞浸潤；而低劑量植物炭黑組和高劑量組的肝臟損傷情況較負(fù)對照組均有所減輕，其中以高劑量組最為明顯，說明植物炭黑對肝臟具有保護(hù)作用。

本研究顯示，大鼠采食ZEN污染飼料對肝臟、子宮、胸腺和脾臟等臟器指數(shù)無顯著影響。姚寶強(qiáng)研究顯示，飼料中添加1 mg/kg ZEN對肝臟、腎臟、脾臟等器官指數(shù)無影響。灌服40 mg/kg BW ZEN的小鼠子宮和腎臟指數(shù)顯著升高，脾臟和肝臟指數(shù)顯著降低。飼喂含有500 μg/kg ZEN飼料28 d可顯著降低雌性大鼠脾臟指數(shù)，飼喂含有300、400、500 μg/kg ZEN飼料42 d后肝臟指數(shù)顯著低于對照組，腎臟指數(shù)無顯著變化。這些說明ZEN可導(dǎo)致動物組織器官萎縮或發(fā)育不全，而影響程度與ZEN濃度和動物攝入持續(xù)時間有關(guān)。本研究中，病理切片結(jié)果顯示ZEN對子宮和肝臟有不同程度損傷，但大鼠采食含有25 mg/kg ZEN飼料及不同劑量的植物炭黑飼料對子宮、肝臟以及各臟器指數(shù)無顯著影響。

3.2 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對肝臟抗氧化指標(biāo)影響 正常生理狀態(tài)下機(jī)體存在抗氧化系統(tǒng)，能夠及時清理產(chǎn)生過多的自由基，使得氧化與抗氧化系統(tǒng)保持動態(tài)平衡。當(dāng)動物攝入過量ZEN可造成機(jī)體自由基濃度過高，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成組織器官氧化損傷。高鑫研究發(fā)現(xiàn)，飼料中含有10 mg/kg和20 mg/kg ZEN可著降低妊娠期母鼠血清SOD和GSH-Px活性，提高M(jìn)DA濃度；飼料中含有 1.0 mg/kg ZEN可顯著增加斷奶仔豬肝臟MDA濃度，顯著降低T-AOC濃度、SOD和GSH-Px活性，這與本試驗結(jié)果一致。以上說明，ZEN引起大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成自由基的產(chǎn)生超過機(jī)體的清除能力，對大鼠肝臟造成氧化損傷，這與肝臟的組織切片病理結(jié)果相一致。

向霉菌毒素污染飼料中添加吸附劑可不同程度緩解毒素對動物機(jī)體造成的氧化損傷。高鑫研究顯示，向飼料中添加水飛薊素可緩解由ZEN導(dǎo)致的大鼠肝臟MDA濃度升高，SOD和GSH-Px活性下降。向ZEN污染飼料中添加0.2%霉菌毒素脫毒劑BZ可顯著提高肉雞血清GSH-Px活性，降低MDA濃度。向含有0.4 mg/kg ZEN飼料中添加0.15 %改性蒙脫石吸附劑CA能夠提高血清GSH-Px和SOD活性，降低MDA濃度。本研究結(jié)果顯示，向ZEN污染飼料中添加低劑量植物炭黑顯著提高了試驗第14天T-AOC濃度，對MDA濃度、SOD和GSH-Px活性具有改善的趨勢；添加高劑量植物炭黑顯著提高第14天SOD活性，極顯著提高T-AOC濃度，極顯著提高第14天和第28天的GSH-Px活性，極顯著降低第28天MDA活性，說明添加高劑量植物炭黑能夠有效吸附飼料中的ZEN，增強(qiáng)了機(jī)體對自由基的清除能力，改善由ZEN所導(dǎo)致對肝臟的氧化損傷。

3.3 ZEN污染飼料中添加植物炭黑對血液免疫指標(biāo)影響 ZEN具有較強(qiáng)的免疫毒性，能夠引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，損傷免疫系統(tǒng)。研究顯示，ZEN可增加斷奶仔豬脾臟TNF-、IL-8、IL-6和IL-1mRNA表達(dá)量。飼料中含有150 mg/kg ZEN可增加懷孕大鼠脾臟IL-6、IL-18和IL-1mRNA表達(dá)量，降低TNF-、IFN-和IL-10 mRNA表達(dá)量。飼料中含有1 mg/kg ZEN顯著降低斷奶仔豬外周血和脾臟淋巴細(xì)胞增殖率以及IL-2濃度。由于不同種類動物對ZEN的敏感性、攝入劑量和持續(xù)時間不同，ZEN免疫毒性也呈現(xiàn)很大差異。本研究顯示，ZEN極顯著增加了試驗第14天和第28天血清IL-2濃度，極顯著降低第14天IL-10濃度，顯著降低第28天IL-10濃度，極顯著增加第14天TNF-濃度。說明飼料中含有25 mg/kg ZEN可誘導(dǎo)大鼠炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞因子濃度改變，對免疫系統(tǒng)造成一定的損傷。

向霉菌毒素污染飼料中添加吸附劑可不同程度提高動物機(jī)體免疫力。本研究顯示，向ZEN污染飼料中添加低劑量植物炭黑顯著降低了試驗第14天大鼠血清TNF-濃度，極顯著提高IL-10濃度；高劑量植物炭黑能夠極顯著降低第14天和第28天IL-2濃度，極顯著提高第14天的IL-10濃度，顯著降低第14天的TNF-濃度，且與空白對照組相比差異不顯著。關(guān)于吸附劑調(diào)節(jié)ZEN誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的文獻(xiàn)報道較少，李丹等研究顯示，飼料中添加0.2 mg/kg和0.4 mg/kg殼聚糖硒可降低ZEN導(dǎo)致的小鼠血漿TNF-a和IL-18濃度升高。向含有1 mg/kg ZEN飼料中添加4 g/kg改性蒙脫石可顯著改善ZEN誘導(dǎo)的脾臟和外周血淋巴細(xì)胞增殖率以及IL-2濃度改變。本試驗中，植物炭黑降低了ZEN對大鼠的毒性作用，通過調(diào)節(jié)TNF-、IL-10和IL-2濃度來緩解ZEN所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能，并且高劑量植物炭黑效果優(yōu)于低劑量。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，植物炭黑能夠改善采食ZEN污染飼料大鼠的子宮、肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高了機(jī)體抗氧化功能和免疫功能，緩解ZEN對機(jī)體的損傷，推薦植物炭黑適宜添加劑量為1.5 g/kg。