腸道緊密連接及調(diào)控通路研究進(jìn)展

閆 炎，孟凡茹，魏語澤，張 昊，趙 偉，裴志花，王 開，胡桂學(xué)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

緊密連接是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，不僅能阻礙外界病原體入侵，還能選擇性地調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)和離子進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)維持上皮細(xì)胞的正常生理功能發(fā)揮重要作用。緊密連接結(jié)構(gòu)主要是以Claudin家族為核心，通過與Occludin家族、ZO家族、膜脂等之間的機(jī)械力動(dòng)態(tài)地驅(qū)動(dòng)緊密連接的組裝，保證緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。腸道的緊密連接結(jié)構(gòu)一旦被破壞，就會(huì)引起腸腔內(nèi)有害物質(zhì)及外來病原體的滲透，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)及黏膜系統(tǒng)的紊亂，引發(fā)多種腸道疾病。目前已有動(dòng)物試驗(yàn)證明，在由病原體引起的腸細(xì)胞感染中，能夠檢測(cè)到相關(guān)緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)的變化，進(jìn)而破壞腸道黏膜完整性。本文綜述了腸道緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控通路的研究進(jìn)展，歸納了由緊密連接改變引起的各種腸道疾病，為緊密連接的后續(xù)研究和尋找腸道疾病的治療方案提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 緊密連接的結(jié)構(gòu)

緊密連接為多種蛋白相互作用下形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，位于上皮頂端兩細(xì)胞間，其結(jié)構(gòu)可以通過電子顯微鏡觀察到。在超薄切片上觀察，緊密連接表現(xiàn)為相鄰質(zhì)膜緊密貼合的區(qū)域，其中相鄰質(zhì)膜能夠部分融合。而在冷凍復(fù)型電鏡下，它們表現(xiàn)為纖維網(wǎng)絡(luò)狀（即緊密連接鏈）每條緊密連接鏈與相鄰細(xì)胞相對(duì)膜中的另一條緊密連接鏈橫向結(jié)合，形成“成對(duì)的”緊密連接鏈。緊密連接是一種高度動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)，通過對(duì)緊密連接蛋白的定位和表達(dá)，來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件，對(duì)維持細(xì)胞屏障的完整性有重要意義。其中，Occludin家族、Claudin家族以及ZO家族是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白分子。

2 緊密連接的組成

2.1 Occludin家族 Occludin是最早被鑒定出的緊密連接跨膜蛋白，屬于含Marvel結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族，大小為65 ku，包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，1個(gè)細(xì)胞內(nèi)小環(huán)，2個(gè)細(xì)胞外環(huán)，以及細(xì)胞內(nèi)定位的C和N末端。Occludin的N端有助于維持緊密連接的完整性，而C端結(jié)構(gòu)域富含潛在的磷酸化位點(diǎn)，能與激酶和磷酸酶相互作用。此外，Marvel基序、C端和ZO蛋白家族共同決定了Occludin是形成順式二聚體結(jié)構(gòu)還是低聚結(jié)構(gòu)。其中，Occludin與ZO蛋白家族的相互作用還決定了Occludin在緊密連接中的遷移和定位，影響了腸道的屏障功能。

2.2 Claudin家族 1988年，Claudin被Furuse等首次發(fā)現(xiàn)，并證明了過表達(dá)的可以在成纖維細(xì)胞中重建緊密連接。隨后，通過基因敲除去除或用Claudin結(jié)合的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素片段處理可以減少緊密連接的形成，進(jìn)一步證明了Claudin是構(gòu)成緊密連接的一部分。隨著對(duì)Claudin的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)小腸上皮細(xì)胞中存在多個(gè)Claudin亞型。目前，已經(jīng)確認(rèn)了Claudin蛋白家族的27名成員，其大小在20～27 ku，由4個(gè)跨膜區(qū)、2個(gè)胞外環(huán)和1個(gè)細(xì)胞質(zhì)羧基尾巴組成。Claudin蛋白家族在細(xì)胞間的兩親性使其產(chǎn)生屏障或空隙，從而能夠選擇性地滲透離子，是跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕獩Q定因素。

2.3 ZO家族 除跨膜蛋白外，緊密連接還由胞質(zhì)蛋白ZO家族組成，這是一種重要的接頭蛋白，它將Claudin、Occludin和Tricellulin等跨膜蛋白與細(xì)胞骨架連接起來，從而使蛋白質(zhì)復(fù)合物能夠聚集到緊密連接的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。目前已發(fā)現(xiàn)3種ZO蛋白的異構(gòu)體（ZO-1、2、3），它們大小在220 ku左右，都具有3個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和1個(gè)GUK結(jié)構(gòu)域。除了緊密連接，ZO蛋白還在基于Cadherin家族的黏附連接中被發(fā)現(xiàn)，影響著細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。ZO-1和ZO-2還能與Claudin直接結(jié)合并定位。Phua等研究證明，ZO-1、ZO-2缺失的細(xì)胞不能形成緊密連接。ZO-1是ZO蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)蛋白，除了能夠協(xié)調(diào)緊密連接的形成，它還能與共同參與上皮細(xì)胞頂基極性的建立和維持。有研究顯示，敲除小鼠基因會(huì)導(dǎo)致aPKC和ZO-1的錯(cuò)誤定位，從而破壞緊密連接復(fù)合體的穩(wěn)定性。

3 緊密連接的功能

3.1 維持腸屏障功能完整 緊密連接蛋白定位和表達(dá)的異常是腸屏障通透性改變的重要標(biāo)志，腸屏障通透性改變則會(huì)引發(fā)一系列腸道疾病，如胃腸炎。其中，病毒感染是胃腸炎最常見的原因，超過60%的腹瀉癥狀都與病毒感染有關(guān)。當(dāng)仔豬感染豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）時(shí)，小腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞。Zong等通過觀察PEDV感染仔豬的緊密連接蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)和在維持腸上皮細(xì)胞的完整性和抵御PEDV感染方面發(fā)揮著重要作用。Luo等的研究還證明了Occludin參與了PEDV的入侵。此外，有研究利用淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（Lymphocytic Choriomeningitis Virus，LCMV）感染小鼠，這種病毒可以在腸內(nèi)造血細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中長(zhǎng)期復(fù)制，通過用FITC標(biāo)記4-kD葡聚糖后，發(fā)現(xiàn)腸道通透性明顯增加，并且病毒感染引起了編碼Claudin-23和PALS相關(guān)的緊密連接蛋白的基因顯著下調(diào)。此外，I型IFN信號(hào)增強(qiáng)LCMV感染小鼠腸上皮細(xì)胞通透性和免疫細(xì)胞的募集，下調(diào)緊密連接相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腸道菌群移位，并增強(qiáng)了CD8 T細(xì)胞的應(yīng)答。Ding等發(fā)現(xiàn)，通過其細(xì)胞外環(huán)ECL2和豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒的表面蛋白GP3之間能相互作用來中和病毒，阻礙病毒的吸收和感染，為研究新的抗病毒策略提供了參考。

除病毒感染外，細(xì)菌感染也是引起腸道屏障損傷的重要影響因素之一。如革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的促炎性脂多糖被認(rèn)為是腸漏時(shí)炎癥發(fā)生的關(guān)鍵因素。在正常情況下，腸上皮可以防止促炎性脂多糖移位，但在飲食誘導(dǎo)肥胖（DIO）小鼠模型中，循環(huán)中的脂多糖水平較高，周圍組織中的炎癥程度較低。這表明腸道微生物區(qū)系中促炎性脂多糖水平的升高可能反過來通過增加跨上皮滲透性而加劇低度炎癥的狀態(tài)，從而促進(jìn)更多的促炎性脂多糖轉(zhuǎn)移到循環(huán)中。此外，與正常組小鼠對(duì)比，DIO小鼠腸黏膜中ZO-1的分布發(fā)生改變并伴隨著的表達(dá)量減少，導(dǎo)致跨上皮通透性增加。Karve等還評(píng)價(jià)了stx1和stx2a對(duì)腸道屏障功能的影響，發(fā)現(xiàn)腸道在暴露于這兩種毒素后，無論是在管腔內(nèi)還是在基底側(cè)隔室，均觀察到跨上皮通透性隨感染劑量和時(shí)間的增加而顯著增加。此外，還伴隨和等幾個(gè)關(guān)鍵緊密連接蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的基因表達(dá)量異常上調(diào)。然而，一些細(xì)菌卻對(duì)維護(hù)腸屏障完整具有積極作用，如是主要的丁酸鹽產(chǎn)生菌之一，其產(chǎn)生的丁酸鹽是腸上皮細(xì)胞的關(guān)鍵能量來源，可以通過促進(jìn)黏蛋白合成、緊密連接重組以及和的上調(diào)來減輕局部炎癥和改善腸道屏障通透性，對(duì)II型糖尿病的治療具有積極作用。

腸屏障完整對(duì)維護(hù)腸道健康具有重要意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白定位或表達(dá)的改變已成為診斷一些癌癥和炎癥性疾病的重要標(biāo)志。特別是Claudin家族成員，如在克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和乳糜瀉中均能檢測(cè)到的表達(dá)增加，通過促進(jìn)陽離子和水通過細(xì)胞旁途徑流入腸腔，從而引起腹瀉。Ishida等在高分化直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)表達(dá)的增加，這證明的表達(dá)依賴于內(nèi)分泌腫瘤的起源部位。雖然Claudins的磷酸化是維持其功能所必需的，但異常的磷酸化會(huì)影響其定位和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致上皮屏障功能受損。在一項(xiàng)對(duì)直腸癌患者的研究中，過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的形成。

3.2 維持上皮極性 細(xì)胞極性是指細(xì)胞表現(xiàn)出形態(tài)和分子的不對(duì)稱性，細(xì)胞的極性使其能夠?qū)︵徑?xì)胞和內(nèi)環(huán)境的變化做出反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、分化等生理過程中起關(guān)鍵作用。在腸道中，腸上皮細(xì)胞有與內(nèi)環(huán)境接觸的頂膜，密封細(xì)胞旁間隙的側(cè)膜，以及錨定在細(xì)胞外基質(zhì)上的基底膜，故腸上皮細(xì)胞具有頂基底端極性（Apico-Basal Polarity，ABP）。其 中PAR（Par3/Par6/aPKC）和Crumbs（Crb/Pals1/PATJ）復(fù)合物在緊密連接的組裝過程中起關(guān)鍵作用。Bruurs等用W4細(xì)胞（一種腸道細(xì)胞極化的單細(xì)胞模型）驗(yàn)證出需要通過小GTP酶Cdc42和其鳥嘌呤核苷酸交換因子Tuba的信號(hào)將頂膜限制在單個(gè)區(qū)域內(nèi)，使ABP發(fā)揮正常功能；而Par6A、Cdc42和GFTuba共定位在頂膜形成三聚體復(fù)合物，是腸細(xì)胞極化過程中形成單一頂端結(jié)構(gòu)域所必需的。此外，極性蛋白復(fù)合物還能與控制細(xì)胞間連接的緊密連接和黏附連接共同作用。如在果蠅上皮細(xì)胞ABP的建立中，或任意基因的缺失都能引起細(xì)胞極性的破壞，從而使相關(guān)緊密連接蛋白分布異常，影響緊密連接的正常功能。Otani等也在MDCK II細(xì)胞中證明敲除和會(huì)使細(xì)胞極性喪失，并且其通過與Claudin和JAM-A共同調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。上皮細(xì)胞極性的建立對(duì)于屏障的形成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取及載體運(yùn)輸至關(guān)重要，一些癌癥的發(fā)生（如結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌等）正是以上皮細(xì)胞極性喪失為重要標(biāo)志。

4 緊密連接的調(diào)控通路

到目前為止，研究已經(jīng)證明了許多信號(hào)通路參與了緊密連接功能的調(diào)節(jié)，如蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、Rho/ROCK、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKt通路等。近年來，有關(guān)緊密連接調(diào)控的研究主要集中在Rho/ROCK信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路上。

4.1 Rho/ROCK信號(hào)通路 Rho是Ras超家族的成員，屬于小分子GTP結(jié)合蛋白，通過在GTP結(jié)合的活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象之間的切換發(fā)揮GTP酶的作用，并被證明能夠廣泛調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞功能。與其他GTP酶一樣，其與GDP的結(jié)合狀態(tài)主要受到GEF、GAP和GDI 3種類型分子的調(diào)控。它們?cè)谀c上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并能夠被細(xì)胞外的細(xì)菌、炎癥因子、生長(zhǎng)因子等激活。RhoA是一種特性較好的RhoGTP酶，在靜息和炎癥條件下具有降低屏障滲透功能的作用。RhoA的下游效應(yīng)分子是Rho相關(guān)的螺旋線圈狀激酶ROCK，ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員。它通過直接磷酸化MLC2或MYPT1引起pMLC的積累來誘導(dǎo)肌球蛋白收縮和緊密連接和黏附連接的解體。

在一些由促炎因子引起的腸道炎癥（如TNF-、IFN-、IL-1等）中能通過促進(jìn)上皮緊密連接蛋白內(nèi)吞從而損害屏障功能，這一過程是由Rho-/ROCK-/MYPT-/MLC介導(dǎo)的肌動(dòng)球蛋白環(huán)周收縮控制的。此外，在克羅恩病患者和TBNS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的大鼠的發(fā)炎結(jié)腸黏膜中均能檢測(cè)到RhoA/ROCK活化增加。而一些細(xì)菌（如腸沙門氏菌和幽門螺桿菌）通過向上皮細(xì)胞注入自身蛋白來激活RhoA/ROCK信號(hào)，進(jìn)而損害緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。此外，內(nèi)毒素（一種由革蘭氏陰性細(xì)菌外膜形成的毒素）通過增加p115RhoGEF蛋白水平來激活RhoA，這也具有破壞上皮屏障的效果。

4.2 MAPK信號(hào)通路 MAPKs是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，能夠響應(yīng)多種細(xì)胞微刺激，特別是在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到激活轉(zhuǎn)錄因子和多種核蛋白、調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化和凋亡的作用。MAPK信號(hào)通路通過一系列的磷酸化步驟被激活，首先是MAPK激酶的激活，其次是MAPK激酶磷酸化并激活MAPKs，主要包括絲裂原活化蛋白（p38）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，它們共同參與細(xì)胞緊密連接屏障功能的調(diào)控。在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，普通肝素通過抑制ERK1/2來降低內(nèi)皮屏障的高通透性并下調(diào)和的表達(dá)，從而保護(hù)緊密連接免受脂多糖誘導(dǎo)的損傷。在人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，內(nèi)源性Src家族激酶的激活通過激活p38使內(nèi)皮屏障對(duì)低劑量的TNF-更敏感，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的損傷。此外，髓過氧化物酶衍生的氧化劑能通過ERK1/2和JNK級(jí)聯(lián)途徑誘導(dǎo)血腦屏障功能障礙。

近年來，一些研究也證實(shí)了病原體刺激可以通過MAPK信號(hào)通路影響腸道緊密連接的變化。Wang等發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒II型感染豬氣管上皮細(xì)胞降低了和的表達(dá)水平，且激活了JNK/MAPK信號(hào)通路，影響了腸道的屏障功能。Zhao等比較了PEDV和傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）對(duì)緊密連接的損害作用，發(fā)現(xiàn)PEDV和TGEV感染都可以通過影響MAPK通路來下調(diào)部分緊密連接和黏附連接蛋白的表達(dá)，在感染早期即可損害IPEC-J2細(xì)胞的屏障完整性。Wang等發(fā)現(xiàn)，IL-17A和IL-17F通過上調(diào)緊密連接相關(guān)基因（包括）的表達(dá)，修復(fù)了HIV-1gp40導(dǎo)致的腸上皮屏障功能障礙，還發(fā)現(xiàn)NF-κB和MAPK通路參與了IL-17A和IL-17F介導(dǎo)的腸上皮屏障完整性修復(fù)。

5 展 望

緊密連接作為腸上皮細(xì)胞屏障的重要組成部分，對(duì)維持腸道的正常生理功能至關(guān)重要。緊密連接蛋白是許多致病細(xì)菌和病毒的靶標(biāo)，它們通過劫持緊密連接蛋白的循環(huán)過程（內(nèi)化、水解、合成和釋放）進(jìn)入細(xì)胞并感染細(xì)胞，或者通過信號(hào)通路機(jī)制使細(xì)胞間產(chǎn)生間隙。對(duì)腸道緊密連接進(jìn)行更加深入地研究有助于更好地了解腸道疾病的作用機(jī)制，從而有效地防控腸道疾病。另外，緊密連接不僅存在于腸道中，還能在內(nèi)皮細(xì)胞中起到維護(hù)血管穩(wěn)態(tài)、血腦屏障完整的作用。自首個(gè)緊密連接蛋白Occludin被發(fā)現(xiàn)以來的幾十年間，有關(guān)于緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的研究迅速發(fā)展，但對(duì)于緊密連接的研究仍處于初步階段，對(duì)于緊密連接與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、機(jī)械力、極性信號(hào)和膜脂協(xié)同調(diào)控上皮屏障功能和細(xì)胞極性的研究仍不成系統(tǒng)。隨著對(duì)緊密連接的研究不斷深入，將能夠構(gòu)建出完整的緊密連接結(jié)構(gòu)模型，更細(xì)致地了解緊密連接的作用機(jī)制，并為緊密連接引起的腸道疾病提供更好地防治方案。