輔酶Q10對(duì)杜洛克豬精子冷凍保存效果的影響

羅 蘭，崔 超，董瑞蘭，韓先杰，于光輝*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300）

2018年8月非洲豬瘟傳入我國(guó)，導(dǎo)致種豬活體引種受限，繁育場(chǎng)通過(guò)自繁自養(yǎng)和不引種的策略來(lái)應(yīng)對(duì)疫情沖擊。另一方面，我國(guó)地方豬種的種質(zhì)資源也面臨威脅，由于地方豬種每個(gè)品種都僅有一個(gè)或幾個(gè)保種場(chǎng)在維持保種，一旦感染像非洲豬瘟這樣的重大疾病，就會(huì)造成滅種。面對(duì)這一形勢(shì)，豬精液冷凍技術(shù)成為解決豬繁育和保種問(wèn)題的技術(shù)之一，該技術(shù)以冷凍精液的形式取代現(xiàn)有活體種豬銷售，大幅降低了企業(yè)的生產(chǎn)和引種成本，并且對(duì)企業(yè)自身引進(jìn)和自主培育的優(yōu)秀種公豬的遺傳資源實(shí)現(xiàn)有效保存，為將來(lái)豬育種工作提供豐富的遺傳資源。但在超低溫冷凍過(guò)程中豬精子極易受到氧化損傷，冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）會(huì)損害精子膜的通透性，由于公豬的精子膜膽固醇和磷脂比率低，并且膽固醇分子分布不對(duì)稱，這種特定組成造成了公豬精子對(duì)冷休克的高度敏感性。輔酶Q具有很好的抗氧化性，在之前的研究中有提到，添加25 mmol/L輔酶Q對(duì)馬冷凍精子有較好的抗氧化作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，每天給種馬飼喂1 g輔酶Q連續(xù)飼喂4周，可以改善種馬精液冷凍后的精液質(zhì)量。輔酶Q的抗氧化功能已被諸多研究證實(shí)，但其在豬冷凍精液保存中研究較少。本研究擬在豬冷凍稀釋液中添加輔酶Q，通過(guò)檢測(cè)精子的品質(zhì)來(lái)證明添加輔酶Q對(duì)豬精冷凍技術(shù)的影響，為豬精冷凍技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、碳酸氫鈉、EDTA-2Na、Tris、青霉素鈉、硫酸鏈霉素等均為國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品，細(xì)胞凋亡（Annexin V-FITC/PI）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、ATP含量等檢測(cè)試劑盒均為南京建成公司產(chǎn)品。活性氧（ROS）、ATP、JC-1等檢測(cè)試劑盒均為碧云天公司產(chǎn)品。輔酶Q、SYBR Green I、PI染液、AO染色試劑盒等均為索萊寶公司產(chǎn)品。RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II、SYBR Green pro Taq HS qPCR試劑盒等均為青島艾科瑞公司產(chǎn)品。OEP購(gòu)自德國(guó)米尼圖、封口粉和0.5 mL凍精細(xì)管均購(gòu)自法國(guó)卡蘇。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 冷凍離心機(jī)（D-37520,Thermo）、移液槍、液氮罐、恒溫箱、光學(xué)顯微鏡（CX21，Olympus，Japan）、水浴鍋、pH計(jì)（FE20-K,梅特勒）、高壓滅菌鍋、冰箱、熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，USA ）、酶標(biāo)儀（RZ-9618,天津瑞澤）、luminometer (GloMax 20/20，Promega，USA)、臨界點(diǎn)干燥儀（EMS850，上海碩賽）、掃描電鏡（JSM-7500F，JEOL，Japan）、分選型流式細(xì)胞儀（BD，USA）、計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA-QH-III，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 稀釋液配制 將Modena稀釋液做為基礎(chǔ)稀釋液：稱取葡萄糖2.75 g、檸檬酸三鈉0.69 g、檸檬酸0.29 g、碳酸氫鈉0.125 g、EDTA-2Na 0.235 g、Tris 0.565 g、青霉素鈉1 000 IU/mL、硫酸鏈霉素0.1 g，用滅菌超純水定容至100 mL，調(diào)整pH為7.2，然后用0.22 μm濾頭過(guò)濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。降溫稀釋液（I液）：11%的乳糖溶液80%、卵黃20%、不同濃度輔酶Q，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；冷凍稀釋液（II液）：95.5%的II液、3%甘油、1.5% OEP，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精液采集 精液來(lái)自山東省平度市環(huán)山托佩克種豬場(chǎng)8頭體況良好、性欲旺盛且繁殖性能好的杜洛克種公豬。采用人工手握法采集中段精液并用雙層紗布過(guò)濾，并將8頭種豬過(guò)濾后的精液混合均勻，以消除個(gè)體差異。樣品每周采集1次，經(jīng)常規(guī)檢測(cè)后活力達(dá)0.8以上，密度為“密”方可使用，鮮精運(yùn)輸前用基礎(chǔ)稀釋液1:1稀釋，于2 h內(nèi)17℃恒溫箱保存送回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3 精液冷凍 鮮精17℃保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，精液用蒸餾水按1:100的比例稀釋后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算精子密度。將精液與17℃保存過(guò)夜的基礎(chǔ)稀釋液按1:1等比例混合后置于17℃恒溫箱平衡2 h，之后在預(yù)冷好的17℃離心機(jī)中800 ×g離心10 min，棄去上清。沉淀與I液按1:1-2稀釋，并用移液槍吹打混勻，離心管用6～8層紗布包裹并放入4℃冰箱平衡約1.5 h，使之緩慢降溫至4℃。平衡結(jié)束后按1:1加入II液稀釋，使終濃度為每毫升5×10個(gè)精子，再放入4℃冰箱平衡30 min。平衡好后的樣品需在4℃環(huán)境中快速用口吸法罐裝進(jìn)0.5 mL細(xì)管中，再用封口粉封口。將細(xì)管平鋪到自制的細(xì)管托架上，保證每根細(xì)管相隔0.5 cm，使其更能充分熏蒸，把托架放入泡沫箱內(nèi)，使其距液氮面3 cm，蓋上蓋子熏蒸10 min后迅速將細(xì)管投入液氮內(nèi)，浸泡30 min后，按組別分別裝進(jìn)拇指管內(nèi)并裝入紗布袋中置于液氮罐中保存。解凍時(shí)將細(xì)管從液氮罐中取出，置于50℃水浴鍋中解凍10 s后撈出用紙巾擦干細(xì)管表面水漬，剪開(kāi)細(xì)管后與解凍液1:4混勻，于37℃水浴孵育10 min后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 精子活力與活率 采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASAS）進(jìn)行精子活力檢測(cè)，將精子樣品解凍后600 ×g 4℃離心3 min，棄上清，PBS重復(fù)清洗3次，再用PBS重懸，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于 37℃載物臺(tái)預(yù)熱，再將精液樣品緩慢注入，使之均勻流入整個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)樣品觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子。

精子活力=直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/總精子數(shù)

1.3.2 質(zhì)膜完整率 將精子樣品解凍后600 ×g 4℃離心3 min，棄上清，PBS重復(fù)清洗3次，再加入SYBR Green 1和PI染液置于37℃水浴鍋中孵育10 min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)處理測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。SYBR Green I染色呈綠色熒光為質(zhì)膜完整，PI染色呈紅色熒光為質(zhì)膜損傷。

1.3.3 頂體完整率 利用異硫氰熒光素標(biāo)記的花生凝集素法（FITC-PNA）對(duì)精子頂體進(jìn)行特異性染色，樣品前期處理同上，并調(diào)整精子密度為每毫升2×10個(gè)精子，按試劑盒說(shuō)明染色后隨即進(jìn)行流式分析，每個(gè)處理測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。FITC-PNA染料能特異性地標(biāo)記在頂體膜上，其熒光強(qiáng)度可反映頂體大小，因此熒光強(qiáng)度可間接反映頂體結(jié)構(gòu)的完整性。

1.3.4 DNA完整率 采用AO染色法檢測(cè)精子DNA完整率。樣品前期處理同上，取適量的細(xì)胞懸液和AO 染液按19:1的比例混合，輕輕混勻。室溫避光染色15 min，上流式細(xì)胞儀分析。每個(gè)處理測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)精子受到損傷時(shí)，其DNA在酸的作用下會(huì)變性成單鏈，發(fā)出紅色或黃色熒光；而完整雙鏈DNA則發(fā)出綠色熒光。

1.3.5 線粒體膜電位 采用JC-1檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。樣品前期處理同上，加入1 mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，隨即進(jìn)行流式分析，每個(gè)處理測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)膜電位較高時(shí)可以產(chǎn)生紅色熒光，膜電位較低時(shí)則產(chǎn)生綠色熒光，用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化比例。

1.3.6 ROS水平檢測(cè) 采用DCFH-DA熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)，樣品前期處理同上，將精子懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，調(diào)整濃度為每毫升2×10個(gè)精子，置于37℃水浴鍋孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻一下，使探針和精子細(xì)胞充分接觸，隨后用PBS清洗3次，以充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，隨即進(jìn)行流式分析，每個(gè)處理測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 抗氧化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 精液解凍后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎精子細(xì)胞，吸取上清液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，CAT、SOD、GSH-Px和MDA含量嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定，隨即用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)組檢測(cè)3次。

1.3.8 ATP含量檢測(cè) 精液前期處理同（7），采用碧云天增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer）進(jìn)行檢測(cè)，從0.1至1.0 μmol/ L的5個(gè)ATP梯度濃度中檢測(cè)到ATP含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.3.9 凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響 參考NCBI獲得豬精子凋亡相關(guān)基因的cDNA序列，并用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物GAPDH為內(nèi)參基因作為試驗(yàn)基因的對(duì)照，引物序列見(jiàn)表1。樣品前期處理同上，試驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取凍融后精子總RNA，再用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒II將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)體系為：2×SYBR Green pro Taq HS premix（1×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.6 μL，加無(wú)RNA酶水至20 μL體系。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，60℃退火30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束，得到熒光定量PCR的試驗(yàn)結(jié)果以及結(jié)果曲線。

表1 4種PCR引物序列表

1.3.10 超微結(jié)構(gòu)觀察 精液解凍后滴于破碎的載玻片上，用2.5%戊二醛覆蓋，放入4℃冰箱中固定3 h后用PBS清洗3次，每次10 min。再用30%、50%、70%、90%、100%的丙酮進(jìn)行梯度脫水，隨后用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥處理，將干燥后的在玻片貼在貼有導(dǎo)電膠的噴金臺(tái)上進(jìn)行噴金，隨后使用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.4進(jìn)行單因素方差分析數(shù)據(jù)顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 冷凍-解凍后輔酶Q對(duì)豬精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及活率的影響 如表2所示，與空白對(duì)照組相比，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的輔酶Q后曲線速度（VCL）提高（＜0.01），150 μg/mL輔酶Q組直線速度（VSL）效果最佳。

表2 不同濃度輔酶Q10對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及活率的影響

2.2 冷凍-解凍后輔酶Q對(duì)豬精子SOD、CAT、GSHPx、MDA、ATP的影響 由表3可知，冷凍稀釋液中添加不同濃度的輔酶Q，均可提高精子解凍后SOD、CAT、GSH-Px活性（＜0.01），同時(shí)提高精子ATP含量（＜0.01），以及降低MDA含量（＜0.01）。其中添加150 μg/mL輔酶Q時(shí)效果最佳，較空白對(duì)照組SOD酶活性提高8.76%、CAT酶活性提高0.82%、GSH-Px活性提高8.04%、ATP含量提高6.7%。而MDA含量在添加150 μg/mL輔酶Q時(shí)降低（＜0.01），較空白對(duì)照組降低0.97%。所有指標(biāo)在隨添加量增加時(shí)均出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

表3 不同濃度輔酶Q10對(duì)精子SOD、CAT、GSH-Px、MDA、ATP的影響

2.3 冷凍-解凍后輔酶Q對(duì)豬精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率、DNA完整率、ROS含量以及的影響 由表4可知，冷凍稀釋液中添加不同濃度的輔酶Q均可提高精子解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、DNA完整率和線粒體膜電位（＜0.01），其中添加150 μg/mL輔酶Q時(shí)效果最佳，較空白對(duì)照組質(zhì)膜完整率提高了17.42%、頂體完整率提高了14.31%、DNA完整率提高了6.73%、線粒體膜電位提高了7.59%。而ROS含量在添加150 μg/mL輔酶Q時(shí)降低（＜0.01），較空白對(duì)照組降低了16.64%。所有指標(biāo)在隨添加量增加時(shí)均出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)中輔酶Q的最適添加量為150 μg/mL。

表4 不同濃度輔酶Q10對(duì)精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率、DNA完整率、線粒體膜位以及ROS含量的影響

2.4 冷凍-解凍后輔酶Q對(duì)豬精子凋亡基因表達(dá)量的影響 如圖1所示，在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中，2種基因的熔解曲線都只有1個(gè)特異峰（高峰為目的基因，低峰為內(nèi)參基因）。圖2顯示，基因在添加50 μg/mL和150 μg/mL輔酶Q的試驗(yàn)組中表達(dá)量高于空白對(duì)照組（＜0.05）；基因在添加輔酶Q150 μg/mL和250 μg/mL后表達(dá)量較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均降低（＜0.05）；基因試驗(yàn)組表達(dá)量也低于空白對(duì)照組（＜0.05）。

圖1 Bcl-2和GAPDH基因熔解曲線

圖2 輔酶Q10凍融精子后Bcl-2、Bax、Caspase3表達(dá)量

2.5 冷凍-解凍后輔酶Q對(duì)豬精子超微結(jié)構(gòu)的影響SEM觀察結(jié)果如圖3所示，精子經(jīng)冷凍后出現(xiàn)不同程度的損傷，主要表現(xiàn)在精子頂體表面粗糙，損傷大多在頂體和頸部。試驗(yàn)證明，經(jīng)輔酶Q處理后的試驗(yàn)組精子較未經(jīng)處理的對(duì)照組精子損傷更少，完整性更好，核均一，頂體結(jié)構(gòu)完整，邊界清洗，邊緣整齊。

圖3 豬精液冷凍-解凍后掃描電鏡圖

3 討 論

抗氧化劑一直是豬冷凍精液研究中的熱點(diǎn)，外源抗氧化劑是抵抗氧化應(yīng)激并提高冷凍保存過(guò)程中精子質(zhì)量的有效策略。近年來(lái)輔酶Q或泛醌等物質(zhì)作為抗氧化劑研究較熱，其主要作用是作為線粒體呼吸鏈中的電子載體在三磷酸腺苷合成中發(fā)揮作用，此外，它是天然存在的化合物，廣泛分布在動(dòng)物有機(jī)體和人類中。

朱振東研究發(fā)現(xiàn)，隨著精子中ROS水平升高，ATP的產(chǎn)生和線粒體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)都受到破壞，精子呈現(xiàn)線性運(yùn)動(dòng)模式，而在低糖稀釋液中添加100 nmol/L輔酶Q可顯著提高精子的直線運(yùn)動(dòng)，直線運(yùn)動(dòng)速度以及精子的總活率。另有研究發(fā)現(xiàn)在馬凍精稀釋液中添加輔酶Q改善了解凍后精子的總運(yùn)動(dòng)能力，并且當(dāng)輔酶Q與-生育酚聯(lián)合使用時(shí)能更有效預(yù)防冷凍精子的脂質(zhì)過(guò)氧化。本實(shí)驗(yàn)中，添加不同濃度輔酶Q組精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)和活率較空白對(duì)照組顯著提高，其中添加150 μg/mL時(shí)精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)最好，活率最佳，說(shuō)明輔酶Q對(duì)精子的活率及運(yùn)動(dòng)能力有所提高。精液在冷凍過(guò)程中ROS增高是引起精子脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的一個(gè)重要原因，孟佳等研究發(fā)現(xiàn)輔酶Q與維生素E聯(lián)合使用能顯著提高衰老老鼠血液中的SOD活性，并且明顯降低MDA含量。在豬精液冷凍過(guò)程中，SOD、GSHPx、CAT活性變化在一定程度上能影響豬精子脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。張斌等研究表明，超低溫冷凍保存會(huì)破壞姜曲海豬的精子酶系統(tǒng)，導(dǎo)致多數(shù)酶活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，添加輔酶Q可顯著提高SOD、GSH-Px、CAT活性，增加ATP含量，同時(shí)也顯著降低了MDA含量，由此可見(jiàn)，添加輔酶Q能有效改善冷凍精液品質(zhì)。從結(jié)果來(lái)看，相較于空白對(duì)照組，隨著輔酶Q添加量的增加，效果也在逐漸變化，其中添加150 μg/mL輔酶Q效果最好，當(dāng)添加量為350 μg/mL時(shí)，效果與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。

霍敏等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)輔酶Q添加量為40 μg/mL時(shí)能顯著提高綿羊精子的質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位。而精子冷凍后會(huì)破壞精子的線粒體功能并刺激精子產(chǎn)生過(guò)量的ROS，過(guò)量ROS導(dǎo)致精子的抗氧化防御系統(tǒng)失靈，致使精子進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS還通過(guò)其脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA直接氧化精子DNA堿基或與DNA的共價(jià)鍵，從而導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在牛凍精稀釋液中補(bǔ)充輔酶Q可增強(qiáng)精子的運(yùn)動(dòng)性、活率、質(zhì)膜完整性，并提高精子的頂體完整率。本研究中，與空白對(duì)照組相比，在稀釋液中添加不同濃度的輔酶Q均能顯著提高精液冷凍-解凍后的質(zhì)膜完整率、頂體完整率DNA完整率、線粒體膜電位，同時(shí)ROS含量也顯著降低，添加量為150 μg/mL輔酶Q時(shí)效果最好；當(dāng)添加量到達(dá)350 μg/mL時(shí)的頂體完整率和DNA完整率較空白對(duì)照組降低，ROS含量升高，說(shuō)明超過(guò)適宜添加量后，輔酶Q反而會(huì)破環(huán)精液品質(zhì)。這可能是由于輔酶Q在脂膜中的作用類似于膽固醇，其通過(guò)脂膜的調(diào)節(jié)作用來(lái)提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，起到提高冷凍精液質(zhì)量的作用。

精子在冷凍-解凍過(guò)程中不僅DNA會(huì)受到損傷，也會(huì)受外界影響而發(fā)生精子細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡則是由凋亡基因控制下的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)引起的。家族中的基因是一個(gè)促凋亡基因，該基因是通過(guò)激活家族蛋白酶系統(tǒng)和水解酶來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而就是家族中的一員。鄧瑩瑩研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制細(xì)胞氧化損傷與凋亡發(fā)生相關(guān)因子表達(dá)能夠促進(jìn)凋亡抑制因子的表達(dá)量。本研究中基因在添加量為150 μg/mL輔酶Q時(shí)表達(dá)量顯著升高，和表達(dá)量較空白對(duì)照組均降低。由此可見(jiàn)在冷凍稀釋液中添加輔酶Q能有效提高抗凋亡因子的表達(dá)量，同時(shí)降低促凋亡因子和表達(dá)量，從而提高冷凍精液解凍后的精子活率。這可能是由于輔酶Q能保護(hù)線粒體DNA，維持線粒體呼吸鏈的的完整性，從而達(dá)到減少細(xì)胞凋亡的作用；另一方面可能是由于輔酶Q能增加線粒體ATP的產(chǎn)生效率，促進(jìn)了細(xì)胞的新陳代謝，從而延緩了細(xì)胞凋亡；也可能跟抑制線粒體去極化的凋亡通路有關(guān)，但這方面的研究較少，還需進(jìn)一步探討。

精子進(jìn)行超低溫保存超微結(jié)構(gòu)觀察研究中，本研究發(fā)現(xiàn)精子凍融后主要損傷在頂體和頸部，表現(xiàn)為頂體表面粗糙，頸部斷裂等，這與劉莉的研究結(jié)果一致。因此需要進(jìn)一步探索能保護(hù)精子膜的保護(hù)劑，才能更有效地降低冷凍對(duì)精子功能和結(jié)構(gòu)的損傷。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在豬精液冷凍過(guò)程中添加輔酶Q能顯著提高解凍后精子質(zhì)量，以添加150 μg/mL效果最佳。