基于RNA-seq數(shù)據(jù)篩選雞睪丸附睪間差異表達(dá)基因及其功能分析

趙延輝，陳 余，王 梁，呂學(xué)澤，齊曉龍，王相國(guó)，倪和民，邢 凱*，盛熙暉*，郭 勇

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100107）

睪丸及附睪的發(fā)育對(duì)雄性個(gè)體的成熟以及維持其正常生殖活動(dòng)起著十分重要的調(diào)控作用。鳥類的生殖系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物中擁有獨(dú)一無二的解剖學(xué)和生理學(xué)特征。從精原細(xì)胞分裂到形成精子的全過程稱為精子生成。精子生成是一個(gè)復(fù)雜且受嚴(yán)格調(diào)控的過程，涉及到多種分子和信號(hào)通路以及亞細(xì)胞活動(dòng)，這個(gè)發(fā)育過程需要數(shù)千個(gè)基因的順序和協(xié)調(diào)表達(dá)，包括許多睪丸特異性基因。禽類的精子發(fā)生與其他脊椎動(dòng)物精子發(fā)生過程基本相同，但是與哺乳動(dòng)物的精子生成不同的是雞的精子在離開睪丸后就獲得了活力，一部分獲得受精能力。在鳥類中，睪丸精子活力低，睪丸后成熟對(duì)提高精子活力十分重要，附睪在精子的成熟過程中起著重要作用，包括精子獲得漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)和受精能力。然而，在整個(gè)過程中，雞睪丸和附睪發(fā)揮的作用尚不完全清楚。

基于精子生成及成熟過程的復(fù)雜，引入高通量測(cè)序技術(shù)可以更好地對(duì)睪丸附睪發(fā)揮的功能進(jìn)行探究。高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于雞的繁殖過程中。例如，Xu等利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雞的原始生殖細(xì)胞、精原干細(xì)胞和精子形成早期的精原細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行分析，確認(rèn)候選基因與結(jié)合，參與生殖細(xì)胞的發(fā)育；Liu等對(duì)雞睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，找到和可能通過調(diào)控其潛在靶基因和發(fā)揮調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的作用。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)雞附睪轉(zhuǎn)錄組的研究。本文利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)雞睪丸附睪轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了鑒定，并對(duì)兩者之間差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合分析，尋找睪丸附睪特異性相關(guān)通路。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入了解精子生成及成熟機(jī)制，為研究睪丸附睪在雞精子生成及成熟過程的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣品 海蘭褐公雞于北京農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地單籠飼養(yǎng)至45周齡，光照充足，溫度適宜，食物和飲水自由。最終選取8只發(fā)育良好、精子品質(zhì)優(yōu)良的公雞進(jìn)行安樂死收集樣本。在公雞宰殺后立即摘取睪丸附睪樣本并冷凍在液氮中，等待下一步處理。

1.2 總RNA的提取、文庫(kù)制備及測(cè)序 利用Trizol試劑盒，根據(jù)說明書提取公雞睪丸和附睪的總RNA。對(duì)總RNA的濃度、純度與完整性進(jìn)行檢測(cè)，最終表明所提RNA的完整性及濃度能夠滿足測(cè)序建庫(kù)要求。分別從每個(gè)樣品中取出約1 μg RNA 按照mRNA-seq樣品制備試劑盒說明，逆轉(zhuǎn)錄制備16個(gè)cDNA文庫(kù)。根據(jù)制造商的說明（Illumina），HiSeq 2500用于雙末端測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。

1.3 mRNA表達(dá)分析 使用軟件FastQC對(duì)測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，除去“N”含量10%以上和低質(zhì)量的reads。將高質(zhì)量的reads比對(duì)到雞參考基因組（-6.0）。雞基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)和基因轉(zhuǎn)換文件從Ensembl genome browser下載。各樣品中的每個(gè)基因的表達(dá)水平用HT-seq軟件來鑒定。根據(jù)基因表達(dá)水平分析得到的數(shù)據(jù)，使用R語(yǔ)言edgeR包鑒定差異表達(dá)基因（FDR＜0.05和|logFC|＞1）。

1.4 差異基因的GO功能注釋和KEGG通路分析 GO（Gene Ontology）功能富集分析分為三大類：生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因參與的通路。通過R包ClusterProfiler對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，其中＜0.05的GO條目和KEGG通路被認(rèn)為是顯著的。

2 結(jié)果

2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)分析 通過Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)睪丸附睪樣本16個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行了高通量測(cè)序，經(jīng)質(zhì)控后，每個(gè)樣本平均獲得3.1×10個(gè)clean reads，大約80%的clean reads被比對(duì)到雞參考基因組。對(duì)樣本的基因表達(dá)水平進(jìn)行PCA分析，結(jié)果表明睪丸與附睪之間基因有明顯的分離（圖1A）。如圖1B所示，在睪丸及附睪組內(nèi)相關(guān)性很高，睪丸與附睪之間無明顯差異。綜上，clean reads數(shù)量和對(duì)比結(jié)果符合要求，為后面的數(shù)據(jù)分析提供了保障。

圖1 樣本間基因表達(dá)分析

2.2 差異基因的篩選 本研究在雞睪丸附睪組織樣本中共檢測(cè)得到24 881個(gè)基因，其中1 647個(gè)在睪丸中特異性表達(dá)，349個(gè)在附睪中特異性表達(dá)。以FDR＜0.05和|logFC|＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終得到5 124個(gè)差異表達(dá)的基因，其中2 300個(gè)基因在睪丸中高表達(dá)，2 824個(gè)基因在附睪中高表達(dá)（圖2）。

圖2 雞睪丸與附睪組織中的差異基因火山圖

2.3 差異基因GO注釋 GO分析結(jié)果顯示，睪丸組織中上調(diào)表達(dá)基因顯著富集在166個(gè)生物學(xué)過程、24個(gè)細(xì)胞組成、18個(gè)分子功能中。如圖3A所示，睪丸組織中上調(diào)表達(dá)基因在生物學(xué)過程上富集在解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生（Anatomical Structure Morphogenesis）、細(xì)胞分化（Cell Differentiation）、細(xì)胞發(fā)育過程（Cellular Developmental Process）等；在細(xì)胞組成上集中于細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix）、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（Collagen-Containing Extracellular Matrix）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架（Actin Cytoskeleton）等；在分子功能上主要集中于同源蛋白質(zhì)結(jié)合（Identical Protein Binding）、肌動(dòng)蛋白結(jié)合（Actin Binding）、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合（Cytoskeletal Protein Binding）等功能。

在附睪組織中上調(diào)表達(dá)基因主要富集在51個(gè)生物學(xué)過程、26個(gè)細(xì)胞組成、44個(gè)分子功能GO條目中。如圖3B所示，附睪組織中上調(diào)表達(dá)基因在生物學(xué)過程上主要集中于泛素依賴的蛋白質(zhì)分解代謝過程（Ubiquitin-dependent Protein Catabolic Process）、修飾依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程（Modification-dependent Protein Catabolic Process）等；在細(xì)胞組成上集中于核腔（Nuclear Lumen）、核質(zhì)（Nucleoplasm）、染色體（Chromosome）等；在分子功能上主要集中于核苷酸結(jié)合（Nucleotide Binding）、磷酸核苷結(jié)合（Nucleoside Phosphate Binding）、嘌呤核苷三磷酸結(jié)合（Purine Ribonucleoside Triphosphate Binding）等功能。

圖3 差異表達(dá)基因GO term富集分析

2.4 差異基因KEGG通路分析 睪丸組織中上調(diào)表達(dá)基因經(jīng)過KEGG通路富集分析共建立了154條通路，在MAPK信號(hào)通路（MAPK Signaling Pathway）上差異表達(dá)的基因數(shù)目最多，有63個(gè)；其次為焦點(diǎn)粘著（Focal Adhesion）、核糖體途徑（Ribosome）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)途徑（Regulation of Actin Cytoskeleton），分別有54、51、51個(gè)（圖4A）。另外，如圖4B所示，附睪組織中上調(diào)表達(dá)基因經(jīng)過KEGG通路富集分析共建立了150條pathway。其中，在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路富集差異基因數(shù)目最多，有55個(gè)；之后富集基因數(shù)目較多的為泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解（Ubiquitin Mediated Proteolysis），為46個(gè)基因；富集到細(xì)胞周期（Cell Cycle）通路的基因有45個(gè)。通過與GO富集分析結(jié)果結(jié)合，可以對(duì)差異表達(dá)基因功能有更加全面的理解。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

3 討 論

本研究對(duì)公雞睪丸附睪進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)到5 124個(gè)差異表達(dá)的基因，GO和KEGG分析結(jié)果表明這些差異基因在雞的生長(zhǎng)發(fā)育及精子生成中發(fā)揮重要作用。S?owińska等在火雞的睪丸與附睪中找到1 682個(gè)差異表達(dá)基因，主要參與細(xì)胞周期、有絲分裂和生殖過程，包括配子的產(chǎn)生和發(fā)育以及精子的發(fā)生。在本研究同樣注意到差異基因富集于有關(guān)細(xì)胞周期、精子生成、成熟和運(yùn)動(dòng)等多個(gè)方面。睪丸組織中上調(diào)表達(dá)基因在生物學(xué)過程上主要集中于細(xì)胞分化、細(xì)胞分化調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育過程和細(xì)胞粘附過程，這可能與睪丸中原始生殖細(xì)胞分化成精子這一相關(guān)過程的調(diào)控有關(guān)。在本研究中睪丸組織上調(diào)表達(dá)基因在MAPK信號(hào)通路顯著富集，研究表明此通路涉及到細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面，是重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。在哺乳動(dòng)物睪丸中，MAPK可以對(duì)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡起調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是精子發(fā)育的重要因素之一。因此認(rèn)為MAPK信號(hào)通路是調(diào)節(jié)公雞睪丸內(nèi)精子生成及精子質(zhì)量保障的關(guān)鍵通路。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在睪丸組織中上調(diào)表達(dá)，Jun等和Araujo等研究表明可以對(duì)MAPK活化起到調(diào)節(jié)作用。Das等研究表明作為AVBD家族中的一員，其含量與精子表達(dá)有關(guān)。另外Sun等研究表明的表達(dá)與精子運(yùn)動(dòng)能力以及精子品質(zhì)有關(guān)，說明這3個(gè)基因可能是精子發(fā)生及品質(zhì)保障的關(guān)鍵基因，其功能作用有待進(jìn)一步挖掘。

精子離開睪丸后尚未獲得受精能力，需要在附睪發(fā)生多種生化及生理變化，例如對(duì)精子發(fā)生過程中翻譯合成的內(nèi)源性蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾以及加入附睪新分子等。哺乳動(dòng)物精子在附睪成熟階段有幾波miRNA和tRNA被送進(jìn)精子中。附睪組織中上調(diào)表達(dá)基因在生物學(xué)過程上主要集中于各種依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程以及蛋白質(zhì)修飾過程，這可能與精子成熟過程中表面蛋白質(zhì)變化、精子線粒體激活及精子運(yùn)動(dòng)所需要的能量有關(guān)。附睪組織中上調(diào)表達(dá)基因在糖酵解途徑中富集，Aitken等研究表明糖酵解途徑對(duì)精子獲得漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)是必要的，當(dāng)精子缺乏糖酵解活性時(shí)，精子由于缺乏能量而無法運(yùn)動(dòng)。本研究中，附睪組織中基因顯著表達(dá)，TRIM36是一種泛素連接酶，介導(dǎo)目標(biāo)蛋白的泛素化和隨后的蛋白酶體降解，Aoki等研究表明TRIM36缺陷會(huì)導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力降低以及精子品質(zhì)下降。另外，泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解涉及到多種生理功能，參與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等過程。TCP11能賦予精子運(yùn)動(dòng)的能力，以及對(duì)于通過cAMP/蛋白激酶A途徑進(jìn)行精子獲能起重要作用。上述結(jié)果表明基因可能在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)中起重要作用。

睪丸上調(diào)表達(dá)基因在谷胱甘肽代謝途徑、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝作用途徑、藥物代謝-細(xì)胞色素P450途徑明顯富集。谷胱甘肽是細(xì)胞的主要抗氧化劑，并且在異種生物化合物的解毒、細(xì)胞增殖的調(diào)制、半胱氨酸的運(yùn)輸和儲(chǔ)存以及氧化還原狀態(tài)的維持等細(xì)胞途徑也發(fā)揮重要作用。細(xì)胞色素P450酶系是重要的酶系統(tǒng)，能夠催化環(huán)境中的藥物和其他異生素（如草藥和有毒化合物）的代謝。因此，公雞睪丸在對(duì)外源藥物代謝和異種生物代謝過程中可能發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

睪丸中影響精子生成的候選基因?yàn)椋桓讲G中調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)鍵基因?yàn)?；此外，睪丸在外源物質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。本研究數(shù)據(jù)可以為探究睪丸附睪功能差異提供參考。