Profilin1 的生物學(xué)作用研究進展

訾晶晶，楊旭，來裕婷，李新，丁向彬，張林林

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

Profilin（PFN）又稱抑制蛋白，是一種actin單體結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細胞中，目前在哺乳動物基因組中共鑒定到4 種 PFN 基因（PFN1-4）。PFN1 在整個胚胎階段都有表達，存在于成年小鼠除骨骼肌以外所有類型細胞和組織中[1]，PFN2 僅在發(fā)育中的神經(jīng)元和分化神經(jīng)元中表達，PFN3 和PFN4 僅在睪丸中表達[2]。本文主要討論 PFN1，PFN1 通過與 actin 結(jié)合形成PFN1-actin 復(fù)合體調(diào)控actin 細胞骨架的聚合，已經(jīng)證實在細胞遷移、細胞分裂、神經(jīng)元分化和突觸可塑性等多種細胞活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。敲除PFN1 的小鼠胚胎在二細胞期就無法存活[3]，說明PFN1 對生命活動發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在哺乳動物的腫瘤細胞中，PFN1 表達的部分喪失與隨后致瘤表型相關(guān)。野生型和突變型PFN1 在這些腫瘤細胞中表達的互補性表明調(diào)控細胞表型轉(zhuǎn)化所需的主要是肌動蛋白結(jié)合特性[4]。PFN1 突變或者缺失也會導(dǎo)致一些人類疾病，已成為研究的一個熱點。本文就PFN1 蛋白的結(jié)構(gòu)、相關(guān)生物學(xué)功能以及PFN1 在癌癥和人類疾病中的研究進展做簡要綜述。

1 PFN1 蛋白的結(jié)構(gòu)

PFN1 是重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白之一，其分子量約15 kDa，PFN1 的三級結(jié)構(gòu)主要由4 個α 螺旋和7 個β 折疊構(gòu)成[5]。PFN1 有3 個功能性結(jié)構(gòu)域，分別是肌動蛋白結(jié)構(gòu)域、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）結(jié)構(gòu)域以及多聚-L-脯氨酸（Poly-L-proline，PLP）結(jié)構(gòu)域。通過這3個結(jié)構(gòu)域，PFN1 能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用，這同樣也是PFN1 行使生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如PFN1 可以通過肌動蛋白結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白結(jié)合，進而調(diào)控細胞骨架聚合；PFN1 通過PI 結(jié)構(gòu)域與磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸（Phosphatidylinositol（4，5）-bisphosphate，PIP2）結(jié)合使PFN1-actin 復(fù)合體釋放actin；并通過PLP 結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸的蛋白結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。1995 年REINHARD 等發(fā)現(xiàn)第一個富含脯氨酸的血管舒張刺激磷蛋白（Vasodilator-stimulated phosphosphoprotein，VASP）與PFN1 通過PLP 結(jié)合域結(jié)合[6]。VASP 能夠促進actin 在微絲生長端聚合，并且可以防止帽蛋白的加帽作用，PFN1 與其結(jié)合能夠增強VASP 對微絲生長端的保護作用[7]。除此，越來越多的研究表明，PFN1 還可作為關(guān)鍵的信號分子作用于網(wǎng)絡(luò)樞紐，通過結(jié)構(gòu)域與靶蛋白（如核輸出蛋白6、轉(zhuǎn)錄因子P42pop等）結(jié)合從而參與蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄以及小GTPase 信號通路的活化等一系列重要的生理過程[8]。

2 PFN1 對actin 細胞骨架聚合的調(diào)控作用

細胞骨架是細胞內(nèi)以蛋白纖維為主要成分的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括微管、肌動蛋白微絲和中間纖維。其中微管主要以細胞核為中線呈放射狀分布在胞質(zhì)周圍，微絲主要分布在細胞質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)。中間纖維在整個細胞中都有分布。Actin 是微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，在細胞中有兩種形式——單體球狀肌動蛋白（Globular actin，G-actin）和由G-actin 聚合形成的絲狀肌動蛋白（Fibrosis actin，F(xiàn)-actin）[9]。目前對于PFN1 對actin 細胞骨架聚合的調(diào)控作用有兩種截然不同的看法，一種是PFN1 可以促進actin 細胞骨架聚合，另一種是PFN1 可以抑制actin細胞骨架聚合，下面分別對這兩種結(jié)論進行描述。

2.1 PFN1 促進actin 細胞骨架聚合

在細胞中，G-actin 和F-actin 處于一種動態(tài)轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。PFN1 使G-actin 上ADP-ATP 交換加速1 000 倍，從而補充細胞中的ATP-actin 庫，同時保護微絲不受解聚蛋白及加帽蛋白的影響，促進G-actin 在微絲末端聚合形成F-actin 而延長微絲，使聚合速度加快[10]。PFN1 還可以降低肌動蛋白的臨界濃度（發(fā)生聚合所需的量），從而使聚合更早開始，持續(xù)時間更長[10]。Formins 蛋白是一類結(jié)構(gòu)蛋白，它與組成微絲的actin 有著密切的關(guān)系。已知Formins 蛋白結(jié)合到肌動蛋白微絲末端，可以提高聚合速度，而PFN1 的加入進一步提高了聚合速度[11]。在其他肌動蛋白結(jié)合蛋白存在的情況下，PFN1 會競爭性與G-actin 結(jié)合，并將結(jié)合的G-actin 轉(zhuǎn)移到微絲帶刺末端，從而提高了聚合速度[12]。這三種方式都說明了PFN1 可以促進actin 細胞骨架的聚合。

2.2 PFN1 抑制actin 細胞骨架聚合

PFN1 最初被鑒定時被當(dāng)作是一個actin 隔離蛋白，能夠與G-actin 形成1∶1 的復(fù)合物，從而阻止G-actin 發(fā)生聚合[3]。隨后，有些研究者認為PFN1 對G-actin 聚合的調(diào)控是一種濃度依賴的作用，即高濃度的PFN1 抑制聚合而低濃度的PFN1促進聚合[10]。另外在提取細胞裂解上清液體外研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)G-actin 濃度太低（＜0.1 μmol/L）時，PFN1-actin 能夠與肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體（Actinrelated protein 2/3（Arp2/3）complex）直接結(jié)合起始F-actin 成核反應(yīng)，而actin 濃度高時不依賴PFN1 即可體外成核[13]。更多細胞水平和組織水平的試驗證實PFN1 對actin 成核反應(yīng)有抑制作用，但由于PFN1 的三種配體都參與actin 成核反應(yīng)，所以現(xiàn)有的研究從多角度驗證了PFN1抑制actin 成核的分子機制。（1）PFN1 與actin 結(jié)合抑制成核反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞中過表達PFN1 會抑制ARP2/3 復(fù)合體介導(dǎo)的actin 成核反應(yīng)，而用不能結(jié)合actin 的R88E-PFN1 突變體則不會起到抑制作用[14-15]，這是由于ARP2/3 介導(dǎo)的成核反應(yīng)是游離的G-actin 聚合的結(jié)果，PFN1 與ARP2/3 競爭結(jié)合G-actin，導(dǎo)致G-actin 在細胞內(nèi)濃度下降從而抑制actin 成核。（2）PFN1 與含有PLP 結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合抑制成核反應(yīng)。WASP 家族成員均含有能與PFN1 結(jié)合的PLP 結(jié)構(gòu)域，而WASP 家族蛋白是激活A(yù)RP2/3-actin 成核反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，因而研究者對PFN1 與WASP 的結(jié)合是否會影響actin 的成核反應(yīng)也進行了細胞水平的相關(guān)驗證。神經(jīng)元分化成神經(jīng)突很大程度上依賴actin 細胞骨架的重排[16]，表達PLP 結(jié)合缺陷的W3A-PFN1 突變體比表達正常的PFN1 的PC12神經(jīng)元細胞能夠更快更多地分化出神經(jīng)突[17]，說明PFN1 結(jié)合WASP 導(dǎo)致活化的WASP 下降，從而抑制了actin 的成核反應(yīng)。

3 PFN1 與人類疾病

3.1 PFN1 與癌癥

PFN 構(gòu)成一組進化保守的小肌動蛋白結(jié)合蛋白，在許多細胞活動（包括增殖和運動）中起調(diào)節(jié)作用[18]。PFN1 是該家族的創(chuàng)始成員，已與多種類型的人類癌癥相關(guān)。例如，在胰腺癌中，PFN1在臨床腫瘤組織中被下調(diào)，而PFN1 的過表達損害了腫瘤細胞的惡性表型[19]。此外，PFN1 的過表達增加了乳腺癌細胞對喜樹堿誘導(dǎo)的細胞凋亡的敏感性[20]。在肝癌組織和細胞系中PFN1 的表達水平顯著降低，全反式維A 酸誘導(dǎo)的細胞增殖與遷移的抑制是通過PFN1 表達水平改變來實現(xiàn)的[21]。SHEN 發(fā)現(xiàn)使肝細胞癌（Hepatocellar carcinoma，HCC）中異常減少的PFN1 得到恢復(fù)能夠抑制HCC運動與轉(zhuǎn)移[22]。研究發(fā)現(xiàn)，PFN1 的過表達顯著抑制HCC 細胞增殖、遷移和入侵[23]。這些研究說明PFN1 在肝細胞癌中起著抑癌作用，并可能作為肝細胞癌患者的診斷和治療靶點。JANKE 等發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，致瘤乳腺癌細胞PFN1 表達水平是降低的[27]。等ZOU 發(fā)現(xiàn)PFN1 也參與調(diào)控乳腺癌細胞遷移[25]。基因沉默研究發(fā)現(xiàn)PFN1 參與調(diào)控內(nèi)皮細胞遷移與增殖[26]。這些研究進展都說明，PFN1 在癌癥中扮演著重要的角色，并且可以作為一些癌癥的診斷和治療靶點。

癌癥具有細胞分化和增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征，其發(fā)生是一個多因子、多步驟的復(fù)雜過程。PFN1 過表達抑制細胞增殖和遷移，RNA 干擾PFN1 可逆轉(zhuǎn)這一抑制作用。乳腺癌細胞系野生型和突變型PFN1 過表達的試驗研究發(fā)現(xiàn)PFN1 肌動蛋白結(jié)合位點的存在是其抑制細胞運動的必要條件，actin 和PLP 結(jié)合位點都是PFN1 誘導(dǎo)增強細胞遷移能力的必要條件[26]。PFN1 發(fā)生磷酸化增加了PFN1 對G-actin的親和力，從而改變actin 聚合動力，從而以不同的方式影響細胞。例如，PFN1 的磷酸化通過參與常氧條件下缺氧因子的積累來促進膠質(zhì)母細胞瘤的進展[27]。ZOU 等[20,28]發(fā)現(xiàn)PFN1 可以抑制乳腺癌細胞增殖，其機制為PFN1 的表達可以上調(diào)PTEN基因，從而抑制AKT 通路，引起p27 蛋白增加，p27 和Cdk2 復(fù)合體結(jié)合使細胞周期停滯在G1期，最終抑制細胞增殖。PFN1 與雌激素受體α（Estrogen receptor alpha，Erα）相互作用，已知ERα 除了促進轉(zhuǎn)移外，還介導(dǎo)某些細胞系的凋亡。在這些細胞中，已有研究證明他莫昔芬（Tamoxifen，Tam）可以上調(diào)PFN1，PFN1 隨后與ERα 共存于細胞核。在17α-雌二醇（17α-estradiol，E2）和Tam 存在的情況下，觀察到PFN1 顯著降低ERα 介導(dǎo)的雌激素反應(yīng)元件（Estrogen response element，ERE）啟動子的反式激活，但在沒有其他兩個分子的情況下不起作用。這些發(fā)現(xiàn)表明這三種蛋白（Profilin1-Tam-E2）都形成了ERα 的一系列輔阻遏物。因此，一組profilin1-Tam-E2 可以抑制ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。此外，PFN1 對ERα 活性的抑制導(dǎo)致caspase9 和caspase3 的表達增加，這兩種酶與真核細胞凋亡密切相關(guān)，并參與細胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。因此，PFN1 的上調(diào)為抑制癌細胞增殖提供了一條潛在的途徑[29]。但是在乳腺癌細胞中過表達PFN1 可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機制是PFN1 和actin 之間相互作用誘導(dǎo)G-actin 和F-actin 之間失衡，進而影響肌動蛋白聚合；同時PFN1 的過表達也增加了R-鈣黏蛋白表達，R-鈣黏蛋白也能夠促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增進腫瘤細胞遷移和侵襲[30]。不同類型的癌癥中PFN1 的表達水平存在不同的改變，并不會保持一致，這可能是由于不同類型的癌癥發(fā)生機制不同，PFN1 在不同環(huán)境中發(fā)揮不同的功能。

3.2 PFN1 與高血壓

高血壓是常見的一種慢性疾病，目前已經(jīng)證實血管重塑是高血壓的重要發(fā)病機制。WANG 等[31]發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠模型中過表達PFN1 可以促進升高導(dǎo)致的血管重塑。轉(zhuǎn)基因PFN1 的過表達通過治療血管重塑導(dǎo)致血壓升高[32]。PFN1 在通過p38iNOS-過氧亞硝酸鹽途徑引起的高血壓誘導(dǎo)的動脈重塑中也起著至關(guān)重要的作用[31]。HASSONA 等[33]在研究中發(fā)現(xiàn)，腸系膜動脈中PFN1過表達與高血壓發(fā)病加速、應(yīng)力纖維形成增加以及Rho/ROCK 和肥大信號通路激活有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，PFN1 是通過激活JAK2-STAT3、JNK 和P38-MAPK 通路使細胞骨架的動力學(xué)發(fā)生改變，從而促進血管壁增厚和血管腔直徑減少，最終導(dǎo)致高血壓發(fā)生[32]。這表明，PFN1 在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和血管重塑中起關(guān)鍵作用，由此可以看出PFN1可能作為一種新的預(yù)測因子來預(yù)測高血壓。

3.3 PFN1 與動脈粥樣硬化和糖尿病

動脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性炎癥疾病，糖尿病是動脈粥樣硬化的等危癥，糖尿病患者常有血脂異常、高凝狀態(tài)、肥胖等癥狀[34]，這些也是動脈粥樣硬化的危險因素。動脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)病機制具有共同的基礎(chǔ)，而這些共同基礎(chǔ)的可能性原因是慢性炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗。內(nèi)皮功能障礙是糖尿病導(dǎo)致發(fā)病的最關(guān)鍵的危險因素之一，其特征是胰島素缺乏或胰島素信號傳導(dǎo)受損[35-36]。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激與包括糖尿病在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)[37-39]。已發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的內(nèi)皮細胞和動脈粥樣硬化病變的巨噬細胞中的PFN1 升高，并且氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotetin，oxLDL）能夠觸發(fā)PFN1 的升高[40]。進一步的研究表明，在培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細胞中，抑制PFN1表達可防止oxLDL 觸發(fā)內(nèi)皮功能障礙[41]。在過表達PFN1 的小鼠腸系膜動脈中，觀察到應(yīng)力纖維數(shù)量增加，導(dǎo)致α-1 和β-1 整合素增加，這與動脈僵硬有關(guān)[33]。PFN1 和動脈僵硬之間的確切關(guān)系尚不清楚，但過高的PFN1 水平可能會導(dǎo)致血管系統(tǒng)的廣泛重構(gòu)和應(yīng)力纖維的出現(xiàn)，觸發(fā)信號級聯(lián)釋放更多的整合素，進而導(dǎo)致動脈僵硬。敲除小鼠體內(nèi)PFN1基因，小鼠主動脈中內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性和一氧化氮依賴性增加，而血管細胞的炎癥因子表達降低[41]。PFN1的缺失，使oxLDL 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)水平降低，從而改善內(nèi)皮功能，對動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展起到一定的保護作用[41]。據(jù)報道PFN1 與晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷有關(guān)[42]。因此通過一定方法干擾PFN1 表達或許可成為治療動脈粥樣硬化的一種新途徑。

3.4 PFN1 與肌萎縮側(cè)索硬化

肌萎縮側(cè)索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種運動神經(jīng)元病，又稱為漸凍癥。發(fā)病的個體會逐漸出現(xiàn)肌肉無力和萎縮，最終因呼吸衰竭而死亡[43]。ALS 病例可以分為兩種——散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化（Sporadic amyotrophic lateral sclerosis，sALS）和家族性肌萎縮側(cè)索硬化（Familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS）[44]。廣泛的基礎(chǔ)研究和臨床研究為ALS 的發(fā)病機制提供了初步的認識，fALS 病例占ALS 患者的20%，研究表明fALS 與越來越多的基因突變有關(guān)[45-47]，而PFN1 突變是導(dǎo)致fALS 的一種罕見原因。到目前為止，在fALS 患者中發(fā)現(xiàn)了8 種不同的PFN1基因突變（A20T，C71G，G118V，M114T，E117G，T109M，R136W，Q139L）[48-50]。一開始發(fā)現(xiàn)PFN1在肌動蛋白結(jié)構(gòu)域存在突變位點從而導(dǎo)致fALS，所以研究人員假設(shè)是因為PFN1 基因發(fā)生突變，不能與actin 結(jié)合，最終導(dǎo)致fALS[51]。但后來又發(fā)現(xiàn)在PLP 結(jié)構(gòu)域也有導(dǎo)致fALS 的突變位點（例如T109M，Q139L）[49,52-53]，這說明PFN1 突變而導(dǎo)致與actin 結(jié)合障礙的假說并不是fALS 發(fā)病的唯一機制。PFN1 突變通過不同的作用機制導(dǎo)致ALS[52-54]。WU 等[50]研究發(fā)現(xiàn)野生型PFN1 分散在細胞質(zhì)中，突變型PFN1（C71G，G118V 和M114T）在細胞質(zhì)泛素化的聚集體中，ALS 的標(biāo)志之一就是聚集體形成，并證實突變型PFN1 在神經(jīng)元中形成聚集體，這進一步說明了PFN1 突變與ALS的關(guān)系，PFN1突變誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集從而導(dǎo)致ALS。解析PFN1 突變導(dǎo)致ALS 的發(fā)病機制一直這個領(lǐng)域的研究熱點，這些具體機制的闡明也將為尋找ALS 新的治療靶點提供科學(xué)依據(jù)和治療策略。

4 展望

PFN1 作為一個肌動蛋白結(jié)合蛋白，從被發(fā)現(xiàn)至今，越來越多的生物學(xué)作用被發(fā)現(xiàn)，能否作為一種新的治療手段抑制癌癥和疾病，還有待驗證PFN1 對癌癥和一些人類疾病的影響和具體的作用機制。以及，PFN1 是如何精確調(diào)控肌動蛋白細胞骨架聚合，而肌動蛋白細胞骨架的重建是成肌細胞分化成肌管的必要過程，PFN1 是否對成肌分化的調(diào)控有重要作用，這些問題都有待進一步研究。