磁性印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用技術(shù)快速檢測(cè)肉制品中的紅霉素

龍 芳

（長(zhǎng)沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院湘菜學(xué)院, 長(zhǎng)沙商貿(mào)旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院湘菜研究所, 湖南長(zhǎng)沙 410116）

紅霉素（Erythromycin, ERY）是一種具有高效抗菌性的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在人類臨床醫(yī)學(xué)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被作為治療藥物廣泛使用，而且還被違規(guī)添加到動(dòng)物飼料中。由于紅霉素在動(dòng)物體內(nèi)代謝時(shí)間較長(zhǎng)，過量攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的藥物殘留[1-2]。殘留的紅霉素會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體，從而危害到人類健康，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)致癌、致畸和致突變[3-4]。因此，研究出一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中紅霉素含量的方法就變得尤為重要，目前紅霉素的檢測(cè)方法主要有色譜法[5]、紫外分光光度法[6]、電化學(xué)法[7]和毛細(xì)管電泳法[8]等。但這些檢測(cè)方法通常存在價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，建立靈敏度高的檢測(cè)方法來監(jiān)測(cè)食品中ERY的殘留是非常必要的。

分子印跡技術(shù)（Molecular imprinting technique，MIT），是以目標(biāo)分子為模板制備具有特異識(shí)別性能的一種聚合物分子識(shí)別仿生技術(shù)。分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）具有選擇性高、靈敏度大、抗干擾能力強(qiáng)以及良好的穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)傳感器的制備上得到廣泛應(yīng)用[9-10]。MIPs對(duì)特定的目標(biāo)分子具有專一性識(shí)別作用，對(duì)環(huán)境中的痕量（ng/g）有害成分也能夠進(jìn)行有效分離、富集。分子印跡電化學(xué)傳感器能特異性識(shí)別目標(biāo)分子，在食品安全檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物緩釋等諸多領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。例如，董燕婕等[11]采用電沉積法和共價(jià)吸附法將納米金和殼聚糖/普魯士藍(lán)/石墨烯復(fù)合物修飾到電極表面，構(gòu)建一種靈敏的電化學(xué)免疫傳感器對(duì)動(dòng)物源性食品中紅霉素殘留的測(cè)定，得到的線性范圍為0.3～1000 mg/mL，檢測(cè)限為0.15 ng/mL。何雪麗等[12]用鏈霉素為模板分子，吡咯為功能單體，構(gòu)建鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，該傳感器的線性范圍為5.0×10-8～8.0×10-5mol/L。孫大明[13]研究了氧氟沙星分子印跡碳納米管修飾電極快速測(cè)定水體中的氧氟沙星，該修飾電極線性范圍為1.0×10-7～5.0×10-6mol/L，檢出限為1.0×10-8mol/L。該方法雖然便捷、高效、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是線性范圍窄，檢出限較高成了研究工作的一個(gè)瓶頸。本文通過改進(jìn)傳統(tǒng)的印跡電化學(xué)方法，以磁性Fe3O4修飾石墨烯-碳納米管增敏紅霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，結(jié)合磁性印跡固相萃取技術(shù)，構(gòu)建磁性印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用技術(shù)快速檢測(cè)肉制品中痕量的ERY。該方法已被PRASAD等[14]和ZHANG等[15]進(jìn)行了報(bào)道，具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值。

本研究選擇以肉制品中殘留的紅霉素為模板分子，多巴胺（Dopamine，DA）為功能單體，采用組合印跡技術(shù)，以石墨烯-碳納米管為基底材料、磁性Fe3O4納米粒子為增敏基質(zhì)，通過優(yōu)化合成條件，研制出對(duì)紅霉素具有高選擇性、高吸附容量、印跡孔穴可塑和吸附速度快的印跡復(fù)合材料。將優(yōu)選后的印跡復(fù)合材料分別作為固相萃取劑和電化學(xué)傳感元，對(duì)肉制品中痕量的紅霉素經(jīng)過印跡萃取、富集，再結(jié)合印跡電化學(xué)傳感器對(duì)富集液中的紅霉素進(jìn)行檢測(cè)。成功構(gòu)建了一種應(yīng)用于肉制品中痕量紅霉素的印跡分離富集及檢測(cè)系統(tǒng)，從而簡(jiǎn)化肉制品中痕量復(fù)雜有害物質(zhì)的分離、富集和分析檢測(cè)工藝，實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜環(huán)境中快速分離富集檢測(cè)痕量紅霉素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羧基化碳納米管（MWCNTs-COOH） 深圳市納米港有限公司；氧化石墨粉（GO） 上海碳素有公司；紅霉素（ERY）、多巴胺（DA） 北京化學(xué)試劑公司；N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），偶氮二異丁腈（AIBN），二甲基丙烯酸乙二醇（EGDMA） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸、濃硫酸 重慶川東化工有限公司；氯化鐵，乙腈，乙酸，乙二醇，聚乙二醇，甲醇，乙醇，K3Fe[CN]6、K4Fe[CN]6南京化學(xué)試劑股份有限公司；豬肉、羊肉和牛肉樣品 購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；所有?shí)驗(yàn)用水如無特別注明均為超純水。

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；CH660B電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR） 上海精密儀器儀表有限公司；Zeiss-SIGMA HD掃描電鏡儀（SEM） 卡爾蔡司（上海）管理有限公司；JEM-1010透射電鏡（TEM） JEOL日本電子公司； HSDZG-6050 臺(tái)式真空干燥箱 上海和晟儀器科技有限公司；PTFE高壓反應(yīng)釜 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；CSTHZ-82A超聲振蕩器 常州未來儀器制造有限公司；實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：鉑絲為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極（SCE），自制裸碳電極（CE）為工作電極。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性分子印跡聚合物（MMIP/Gr-MWCNTs）的制備

1.2.1.1 氨基化氧化石墨烯的制備 參考文獻(xiàn)[16-17]，稱取0.5 g GO加入到300 mL的水溶液中，在超聲功率為200 W，65 kHz下，超聲分散1 h，然后加入1.5 g硼酸，3.0 g N-羥基丁二酰亞胺（NHS）和5.0 g N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）于60 °C攪拌回流1 h后，再加入50 mL乙二胺回流5 h。反應(yīng)完全后將產(chǎn)物過濾并分別用大量乙醇和水反復(fù)洗滌濾餅。最后將其放入60 °C真空干燥箱中恒溫干燥10 h，獲得氨基化氧化石墨烯（GO-NH2），備用。

1.2.1.2 磁性多壁碳納米管制備 參照文獻(xiàn)[18-19]，首先，稱取1.5 g六水合三氯化鐵溶解于30 mL乙二醇中攪拌形成橙色溶液，接著稱取0.3 g羧基化碳納米管加入到該溶液中，在超聲功率為200 W，65 kHz的條件下超聲分散1 h，再加入5.0 g醋酸鈉和2.0 g聚乙二醇（2000）中繼續(xù)攪拌35 min。然后將混合物密封置高壓反應(yīng)釜中，并升溫至200 °C反應(yīng)8 h，待反應(yīng)完全后冷卻至常溫，分別用乙醇和超純水洗滌，收集磁性羧基化碳納米管（MWCNTs-COOH）復(fù)合材料，置于60 °C干燥箱中干燥10 h后獲得磁性羧基化多壁碳納米管。

1.2.1.3 磁性石墨烯-碳納米管復(fù)合材料的制備 參考方法[20]，分別稱取0.15 g磁性MWCNTs-COOH和0.2 g GO-NH2混合加入60 mL無水乙醇溶液在超聲功率為200 W，65 kHz的條件下超聲分散2 h。再加入2.0 g DCC和3.0 g NHS混合攪拌，然后將混合物置于60 °C高壓釜中反應(yīng)24 h。最后獲得磁性石墨烯-碳納米管復(fù)合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs），將產(chǎn)物移至真空烘箱中80 °C下干燥過夜備用。

1.2.1.4 磁性分子印跡聚合材料的制備 參照方法[21]，準(zhǔn)確稱取1.0 g ERY于錐形瓶中，加入0.5 g多巴胺、15 mL乙腈和 20 mL H2O在超聲功率為200 W，65 kHz的條件下超聲溶解，加入2.0 g Fe3O4@Gr-MWCNTs 納米顆粒，超聲混合。在混合液體中加入0.2 g EGDMA和0.3 g AIBN，在超聲功率為200 W，65 kHz的條件下超聲1 h分散，置于70 ℃反應(yīng)釜中反應(yīng)2 h，將聚合物用洗脫液進(jìn)行洗滌去除模板分子ERY，聚合物放入真空烘箱中80 °C下干燥10 h，取出研磨200目過篩。即制得MMIP/Gr-MWCNTs。磁性非印跡聚合物（MNIP/Gr-MWCNTs）的制備與上述過程相同，只是在制備過程中不加入模板分子ERY。

1.2.2 制備紅霉素分子印跡傳感器（MMIP/Gr-MWCNTs/CE） 自制碳電極：首先對(duì)裸碳電極進(jìn)行預(yù)處理，將裸碳電極接上電線，在電極周圍涂覆一層膠水，干燥固化后，再用砂紙和1.0、0.05 μm Al2O3對(duì)裸露碳電極表面進(jìn)行拋光至鏡面，然后用蒸餾水超聲洗滌，干燥備用。

磁性石墨烯-碳納米管印跡傳感器（MMIP/Gr-MWCNTs/CE）的制備流程如圖1所示，首先制備磁性碳納米管-石墨烯復(fù)合物修飾電極Gr-MWCNTs/CE，步驟如下：將制備的電極浸入30 mL含有0.05 g磁性MWCNTs-Gr復(fù)合材料的PBS（pH7.5）溶液中，采用循環(huán)伏安法在掃描電位為0～0.8 V及掃描速度為0.05 V/s的條件下，循環(huán)掃描10圈，即獲得Gr-MWCNTs/CE。然后制備ERY修飾電極MWCNTs-Gr/CE：分別稱取0.15 g ERY和0.2 g多巴胺溶于10 mL乙醇溶液中配制成濃度為0.2 mol/L的ERY修飾液，采用電沉積技術(shù)在掃描電位為0～0.8 V及掃描速度為0.05 V/s，循環(huán)掃描10圈，獲得MMIP/Gr-MWCNTs/NBD/CE。

圖1 紅霉素分子印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用檢測(cè)示意圖Fig.1 Schematic diagram of erythromycin molecularly imprinted solid phase extraction combined with imprinted electrochemical sensor for detection

磁性石墨烯-碳納米管非印跡傳感器（MNIP/Gr-MWCNTs/CE）的制備，其制備過程跟磁性印跡聚合物MMIP/Gr-MWCNTs/CE相同，僅在聚合過程中不添加模板分子ERY。

1.2.3 肉制品樣品預(yù)處理 肉類樣品購(gòu)自本地的超市，將肉類樣品完全粉碎。準(zhǔn)確稱取粉碎的肉類樣品10.0 g于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5 mL 1.5 mol/L NaOH溶液除去樣品中的脂質(zhì)，再加入20 mL乙腈溶液，渦旋10 min，于7000 r/min下離心取上清液，備用。

1.2.4 磁性固相萃取實(shí)驗(yàn) 首先稱取50 mg磁性印跡聚合物MMIP/Gr-MWCNTs，將其分散在上述預(yù)處理后的肉制品樣品提取液中，ERY加標(biāo)濃度為1.0×10-5mol/L，靜置吸附30 min，吸附飽和后的磁性印跡聚合物在外部磁場(chǎng)作用下實(shí)現(xiàn)固液分離富集，將萃取液用高效液相色譜測(cè)定。接著收集磁性印跡聚合物，再用3.0 mL甲醇/乙酸（8:2，v/v）洗滌吸附在聚合物上的物質(zhì)，然后收集洗脫液，將含有ERY的洗脫液用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。液相色譜檢測(cè)條件，流動(dòng)相：25 mmol/L磷酸二氫銨溶液（pH3.0）/乙腈（3:7，v/v）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.5 構(gòu)建印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng) 印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用檢測(cè)方法，參照已報(bào)道的文獻(xiàn)[14-15,22]，將制備好的磁性印記聚合物MMIP/Gr-MWCNTs分別作為固相萃取劑以及修飾電化學(xué)傳感器，對(duì)肉制品樣品中紅霉素殘留經(jīng)過純化、印跡萃取、富集，再結(jié)合印跡電化學(xué)傳感器對(duì)富集液中紅霉素進(jìn)行檢測(cè)。步驟如下：分別稱取50 mg的MMIP/Gr-MWCNTs將其分散在25.0 mL ERY溶液中靜止吸附30 min，然后通過外部磁場(chǎng)萃取分離，接著將印跡傳感器孵入萃取液中10 min，然后通過外部磁場(chǎng)分離富集，富集液用3.0 mL甲醇/乙酸（8:2，v/v）洗滌。最后，以5.0×10-3mol/L Fe（CN）63-/4-為探針，測(cè)定印跡傳感器的DPV響應(yīng)電流。

本文針對(duì)企業(yè)性質(zhì)深入探討上述假設(shè)，見表5?；谄髽I(yè)性質(zhì)分組，得到非國(guó)企和國(guó)企兩組非平衡面板數(shù)據(jù)，仍借鑒楊洋等（2015）［21］的做法利用面板Tobit隨機(jī)效應(yīng)對(duì)其進(jìn)行分析。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 紅外光譜表征 聚合物結(jié)構(gòu)測(cè)定采用Nicolet iS10型紅外光譜儀測(cè)試，精確稱取磁性羧基碳納米管（Fe3O4@MWCNTs-COOH）、磁性石墨烯-碳納米管復(fù)合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）各2 mg，加入200 mg的KBr，混合研磨均勻后壓片，然后置于恒溫箱中平衡溫度，紅外光譜儀進(jìn)行空氣空白掃描，然后在分辨率為4 cm-1、掃描波段為400～4000 cm-1范圍內(nèi)掃描次數(shù)32次采集樣品的紅外譜圖。

1.3.2 電鏡儀測(cè)試 取適量樣品均勻粘在掃描電鏡觀察臺(tái)上，采用Zeiss-SIGMA HD型掃面電鏡用InLens探測(cè)器，在加速電壓為3 kV條件下進(jìn)行觀測(cè)。采用JEM-1010透射電鏡，在點(diǎn)分辨率為0.3 nm，加速電壓為20 kV，放大倍數(shù)70000倍以上的條件下進(jìn)行觀測(cè)。

1.3.3 電化學(xué)性能表征 以各修飾電極為工作電極，鉑絲為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極（SCE），在鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀Fe（CN）63-/4-緩沖溶液（5.0×10-3mol/L，pH7.5）含有0.2 mol/L KCl的條件下測(cè)定電化學(xué)性能，每根電極重復(fù)測(cè)定三次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Origin 8.5、ChemDraw、Microsoft Windows、PPT用于數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)磁性羧基化碳納米管（MWCNTs-COOH），磁性石墨烯-碳納米管復(fù)合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。圖2a為磁性羧基碳納米管特有的FTIR光譜，其中，3300～3500 cm-1處為典型的羥基（OH）伸縮振動(dòng)峰，1618 cm-1和1382 cm-1處的吸收峰則是羰基（C=C）和羧基（C-OH）吸收峰[23]，此外在624 cm-1處的吸收峰為Fe-O官能團(tuán)所致[24]，表明磁性羧基化碳納米管含有羧基和羥基。圖2b為磁性石墨烯-碳納米管復(fù)合物（Fe3O4@Gr-MWCNTs）FTIR譜圖，在1701 cm-1處的吸收峰為C=O伸縮振特征吸收峰；此外，在1518 cm-1處的峰則對(duì)應(yīng)于-NH-的彎曲振動(dòng)特征吸收峰，1226 cm-1處的吸收峰來自C-N鍵的伸縮振動(dòng)，在1052 cm-1處和880～800 cm-1處的峰則是由于=C-H的彎曲振動(dòng)引起，說明含有氨基[17]。此外，在648 cm-1處的峰則為酰胺基團(tuán)的彎曲振動(dòng)的特征峰，說明含有酰胺基團(tuán)。綜上，可以推斷出該Fe3O4@Gr-MWCNTs復(fù)合材料成功制備。

圖2 紅外光譜表征圖Fig.2 FT-IR spectra characterization

2.2 電化學(xué)性能表征

本研究以多巴胺為功能單體，采用電聚合法，將修飾電極置于聚合液中以0.5 V/s掃速循環(huán)掃描10圈，如圖3A所示。采用循環(huán)伏安法（CV）表征各修飾印跡電極的電化學(xué)性能。以5.0×10-3mol/L Fe（CN）63-/4-為探針，掃描速度為0.05 V/s，電位為-0.3～0.8 V范圍內(nèi)循環(huán)掃描1圈，結(jié)果如圖3B所示，裸電極（CE）呈現(xiàn)一對(duì)可逆的氧化還原峰如圖3B（a），峰電流值為0.36 mA。當(dāng)Fe3O4@Gr-MWCNTs復(fù)合材料修飾至裸表面，可見Fe3O4@Gr-MWCNTs/CE的峰值電流1.33 mA較裸電極相比增大很多如圖3B（b），這是由于Gr-MWCNTs復(fù)合材料具有高表面積和優(yōu)異的導(dǎo)電性[25]。此外，磁性納米粒子Fe3O4摻雜MWCNTs-Gr復(fù)合材料產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)e3O4提供了更多的電化學(xué)活性位點(diǎn)[26]。以多巴胺為功能單體，通過電聚合物法將ERY修飾至復(fù)合物表面，此時(shí)印跡電極MMIP/Gr-MWCNTs/CE峰電流降到最低1.05 mA，如圖3B（c），說明模板分子ERY被特異吸附至印跡孔穴，阻礙了Fe（CN）63-/4-的擴(kuò)散通道，導(dǎo)致印跡電極的峰電流減小。當(dāng)模板分子被洗脫下來時(shí)峰電流為1.50 mA，峰電流明顯增大圖3B（d），這是由于洗脫后的印跡膜中形成大量的印跡孔穴，加速了Fe（CN）63-/4-電子轉(zhuǎn)移速率。非印跡傳感器MNIP/Gr-MWCNTs/CE在電極因?yàn)樵陔姌O表面沒有形成印跡腔，但仍然存在響應(yīng)峰電流1.25 mA，這是非特異吸附所致圖3B（e）。

2.3 形態(tài)分析

各修飾電極的電鏡測(cè)試結(jié)果如圖4所示，圖4（a）為裸電極的SEM顯微鏡照片，觀察到修飾前裸碳電極表面光滑。將聚合物Fe3O4@Gr-MWCNTs修飾至電極表面，結(jié)果如圖4（b）所示，通過SEM和TEM顯微儀觀察到電極表面被聚合物覆蓋，磁性Fe3O4納米粒子包裹在復(fù)合物材料中，結(jié)合上述電學(xué)性能分析可知，此時(shí)該電極的峰電流達(dá)到1.33 mA，相比裸電極（0.36 mA）增大了0.97 mA，說明該聚合材料被成功修飾至電極上。圖4（c）為磁性印跡聚合物MMIP/Gr-MWCNTs/CE的SEM照片，通過電聚合法將ERY分子修飾至電極表面，可見電極表面被緊密覆蓋一層厚厚的膜，結(jié)合電化學(xué)結(jié)果被修飾后的印跡傳感器峰電流降低至1.05 mA，說明非電化學(xué)活性的ERY被成功修飾至電極上。圖4（d）為洗脫模板分子ERY后的印跡電極MMIP/Gr-MWCNTs/CE的SEM照片，可見電極表面被一層聚合物包裹，表面沒有呈現(xiàn)印跡孔穴是因?yàn)橛≯E孔穴大多在印跡聚合物的內(nèi)部，結(jié)合電學(xué)性能結(jié)果顯示，洗脫后的印跡傳感器峰電流達(dá)到最大值1.50 mA，表明模板分子ERY被成功洗脫。圖4（e）為Fe3O4@Gr-MWCNTs形成的TEM照片，由透射電鏡圖可見，F(xiàn)e3O4納米粒子粘附在碳納米管和片層石墨烯上。

圖4 不同修飾電極的電鏡圖Fig.4 Electron microscopic images of different modified electrodes

2.4 pH和孵化時(shí)間對(duì)印跡傳感器的影響

將印跡電極分別浸泡在濃度為1.0×10-5mol/L ERY乙醇溶液中，探討電極孵化時(shí)間0～20 min對(duì)印跡傳感器的DPV峰電流的影響，結(jié)果如圖5B所示。在0～10 min內(nèi)，MMIP/Gr-MWCNTs/CE的峰電流逐漸降低，表明模板分子ERY與印跡孔穴快速結(jié)合；當(dāng)超過10 min時(shí)，峰電流趨于平衡，說明印跡孔穴吸附ERY達(dá)到飽和，因此該印跡電化學(xué)傳感器最優(yōu)孵化時(shí)間為10 min。

圖5 不同條件對(duì)印跡傳感器的影響Fig.5 Influences of different conditions on imprinted electrode

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

配制系列紅霉素濃度范圍為1.0×10-10～1.0×10-5mol/L，將印跡電極置于含有0.2 mol/L （pH7.5）PBS溶液中，掃描速率為0.05 V/s，結(jié)果如圖6A所示，印跡傳感器MMIP/Gr-MWCNTs/CE的峰電流隨著ERY濃度的增加而降低，這說明目標(biāo)分子被逐漸吸附至印跡電極上，DPV的響應(yīng)電流（ΔIR, ΔIR=IB-IP）與紅霉素濃度的負(fù)對(duì)數(shù)（-logC[ERY]）呈線性關(guān)系。如圖6B所示，該線性回歸方程如下：

圖6 不同濃度的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液差分脈沖伏安圖Fig.6 Differential pulse voltammetry of the different concentration erythromycin standard solutions

式中：ΔIR和IP分別是MMIP/Gr-MWCNTs/CE印跡電極的響應(yīng)電流和峰電流，IB是MMIP/Gr-MWCNTs/CE印跡電極的空白信號(hào)，C[ERY]為紅霉素溶液濃度（mol/L)，該印跡電極MMIP/Gr-MWCNTs/CE的檢出限為1.0×10-10mol/L （S/N=3）。每一次檢測(cè)以后，印跡電極應(yīng)放在甲醇/乙酸溶液中除去模板分子。

2.6 聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果分析

為了評(píng)估紅霉素磁性分子印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器（MMISPE-MMIP-sensor）聯(lián)用系統(tǒng)的優(yōu)越性，對(duì)肉制品樣品中的ERY進(jìn)行了分離富集，步驟參照第1.2.3-1.2.4節(jié)中的描述。分別用MMIPsensor和MMISPE-MMIP-sensor對(duì)ERY樣品溶液進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，樣品經(jīng)磁性印跡固相萃取MMISPE處理前和處理后的峰值電流如圖7A所示，由圖可知，電化學(xué)傳感器MMIP-sensor對(duì)肉制品樣品溶液進(jìn)行直接檢測(cè)，得到的峰電流圖7A中b低于空白電流圖7A中a。然而，采用MMISPE預(yù)先進(jìn)行富集（萃取效果見圖7B），再與磁性印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用（MMISPE-MMIP-sensor）檢測(cè)獲得的峰電流值最低，如圖7A中c所示，響應(yīng)電流最大。結(jié)果表明，磁性印跡固相萃取-印跡電化學(xué)聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)具有雙預(yù)濃縮的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜環(huán)境中痕量的ERY經(jīng)過印跡萃取、分離富集快速檢測(cè)。與單獨(dú)的印跡電化學(xué)傳感器MMIP-sensor檢測(cè)相比，使用MMISPEMMIP-sensor檢測(cè)的峰值電流降低了0.22 mA左右。根據(jù)回歸式（1）計(jì)算出磁性印跡固相萃取處理前后溶液中ERY濃度，雙預(yù)濃縮過程將樣品中ERY濃度提高了9～12倍。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMISPEMMIP-sensor聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性，利用MMIPsensor與MMISPE聯(lián)用（MMISPE-MMIP-sensor）檢測(cè)肉制品中ERY，萃取液采用高效液相色譜法檢測(cè)。

圖7 B為肉制品樣品中的ERY經(jīng)MMISPE預(yù)處理后的色譜圖。圖7B（b）為MMIP/Gr-MWCNTs對(duì)樣品溶液萃取后溶液的色譜圖，可見圖中ERY的峰面積小于圖7B（a）中所示的ERY的標(biāo)樣，這是由于MMIP/Gr-MWCNTs對(duì)ERY具有較高的吸附能力。圖7B（c）為ERY洗脫液的色譜圖，洗脫液中ERY的峰面積大于標(biāo)樣的峰面積，進(jìn)一步表明，MMISPE對(duì)ERY表現(xiàn)出更高的選擇性和預(yù)富集能力。

圖7 磁性印跡電化學(xué)和磁性固相萃取與磁性印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)對(duì)3種肉制品中紅霉素含量測(cè)定的應(yīng)用Fig.7 Application of magnetic imprinting electrochemistry and magnetic solid phase extraction combined with magnetic imprinting electrochemistry sensor for the determination of erythromycin content in three meat products

2.7 選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

為了檢驗(yàn)MMIP/Gr-MWCNTs/CE和MNIP/Gr-MWCNTs/CE的特異選擇性，選擇阿奇霉素（AZI）、鏈霉素（STM）和羅紅霉素（ROX）三種與紅霉素結(jié)構(gòu)相似的類似物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，如圖8所示。本實(shí)驗(yàn)采用DPV法檢驗(yàn)印跡電極和非印跡電極的響應(yīng)電流，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將印跡電極和非印跡電極分別浸入1.0×10-5mol/L紅霉素、阿奇霉素、鏈霉素和羅紅霉素溶液中，孵化10 min。結(jié)果如圖9所示，印跡電極的響應(yīng)電流分別為0.72、0.25、0.28和0.42 mA，相比于STM、AZI和ROX，紅霉素印跡電極MMIP/Gr-MWCNTs/CE對(duì)ERY響應(yīng)電流最大，這說明印跡電極對(duì)ERY具有特異識(shí)別性，主要是因?yàn)樵诤铣蒑MIP/Gr-MWCNTs/CE時(shí)，印跡在聚合物中的ERY經(jīng)洗脫后，在MMIP/Gr-MWCNTs/CE中留下了印跡孔穴與ERY的結(jié)構(gòu)大小和形狀一致，而其他分子空間結(jié)構(gòu)不能與印跡孔穴完全匹配，結(jié)合少，所以響應(yīng)電流小。非印跡傳感器響應(yīng)電流都比較小，是由于沒有添加目標(biāo)物質(zhì)。

圖8 紅霉素、阿奇霉素、羅紅霉素和鏈霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.8 Chemical structures of ERY、AZI、ROX and STM

取5根制備好的印跡電極，將印跡電極浸入1.0×10-5mol/L ERY溶液，孵化10 min，取出置于5.0×10-3mol/L Fe（CN）63-/4-PBS （pH7.5）中采用DPV檢測(cè)（結(jié)果如圖9），計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%，這表明此印跡傳感器具有良好的重現(xiàn)性。取制備好的印跡電極5根，在4 ℃下保存一個(gè)月后，置于1.0×10-5mol/L ERY溶液中經(jīng)過孵化、洗脫、檢測(cè)，結(jié)果顯示，平均響應(yīng)電流減小了19.3%，這表明該印跡傳感器良好的穩(wěn)定性。

圖9 印跡電極和非印跡電極對(duì)1.0×10-5 mol/L紅霉素、阿奇霉素、鏈霉素和羅紅霉素的DPV響應(yīng)Fig.9 Current responses of selective recognition for the ERY and structural analogs with concentration of 1.0×10-5 mol/L on MMIP/Gr-MWCNTs/CE and MNIP/Gr-MWCNTs/CE electrochemical sensors by DPV response current

3 結(jié)論

本研究以MMIP/Gr-MWCNTs分別作為固相萃取劑和電化學(xué)傳感元，構(gòu)建了印跡固相萃取-印跡電化學(xué)傳感器聯(lián)用檢測(cè)方法。對(duì)肉制品中紅霉素殘留經(jīng)過印跡萃取、富集，再結(jié)合印跡電化學(xué)傳感器對(duì)富集液中紅霉素進(jìn)行檢測(cè)。采用FTIR/SEM/TEM對(duì)其結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征，并利用CV及DPV等手段對(duì)電學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，磁性印跡聚合物被成功制備，該印跡電極響應(yīng)電流△IR與ERY濃度的負(fù)對(duì)數(shù)（-logC[ERY]）在1.0×10-10～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.991，最低檢出限為1.0×10-10mol/L。聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果顯示通過磁固相萃取和印跡電化學(xué)雙預(yù)濃縮過程將樣品中ERY富集濃度提高了9～12倍。該印跡電化學(xué)傳感器對(duì)紅霉素具有良好的選擇性穩(wěn)定性，并成功用于實(shí)際樣品中痕量ERY印跡分離富集與檢測(cè)。

本研究成功構(gòu)建了一種應(yīng)用于肉制品中痕量紅霉素的印跡分離富集及檢測(cè)方法，從而簡(jiǎn)化肉制品中痕量復(fù)雜有害物質(zhì)的分離、富集和分析檢測(cè)工藝，實(shí)現(xiàn)了從復(fù)雜環(huán)境中快速分離富集檢測(cè)痕量的紅霉素，具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。然而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)工作電極受環(huán)境因素影響大，未來要提高工作電極的穩(wěn)定性。以期為肉類等動(dòng)物源性食品中ERY殘留的日常監(jiān)控提供一種穩(wěn)定性高、選擇性好的分析方法。