ARTP誘變法提高蠟狀芽孢桿菌中殼聚糖酶的產(chǎn)量

張朝正，李 意，趙 華

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300457）

甲殼素（Chitin）是地球上僅次于纖維素，第二豐富的生物聚合物。其來源非常廣泛，常存在于昆蟲和無脊椎動(dòng)物的外骨骼和甲殼動(dòng)物的殼肥料中，在食品、農(nóng)業(yè)、廢水處理、紡織工業(yè)、納米技術(shù)、醫(yī)療材料等方面被廣泛使用[1-2]。但是，甲殼素由于缺乏溶解度和高度有序的晶體結(jié)構(gòu)等原因，其應(yīng)用受到限制。甲殼素解聚之后得到殼聚糖，殼聚糖在醫(yī)藥、化妝品、紡織印刷、食品等各個(gè)領(lǐng)域也都有廣泛的應(yīng)用[3-4]。但是由于殼聚糖的分子量大，溶解性差和溶液黏度大等問題，限制了其在一些方面的應(yīng)用，殼聚糖和甲殼素均有溶解性差且不易被人體吸收的缺點(diǎn)，不過殼寡糖卻克服了這些缺點(diǎn)[5-7]，因此開發(fā)一種成本低、可工業(yè)化和高效生產(chǎn)殼寡糖的工藝，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

如今，傳統(tǒng)工藝制備殼寡糖均存在過程難以控制和無特異性等缺點(diǎn)，且會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染。利用酶降解法制備殼寡糖具有污染小[8-9]、過程易控、反應(yīng)條件溫和、得率高等優(yōu)點(diǎn)[10]，但由于目前殼聚糖酶的價(jià)格較高，因此得到一株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株是制備殼寡糖的首要任務(wù)。大量的研究已經(jīng)篩選到很多可以產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，但這些野生菌株的殼聚糖酶產(chǎn)量均偏低，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)[11-12]。如今，大量研究利用基因工程技術(shù)對(duì)不同菌株的殼聚糖酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，宿主基本為大腸桿菌和酵母[13-16]。

常溫常壓等離子體誘變（Atmospheric and Room Temperature Plasma， ARTP）是一種在大氣壓條件下，利用非平衡放電等離子體源的技術(shù)[17-18]。利用ARTP處理，DNA會(huì)被化學(xué)活性物質(zhì)破壞，而非高溫、紫外線、帶電粒子或強(qiáng)電場(chǎng)[19-20]。ARTP是一種新型物理誘變技術(shù)，具有比傳統(tǒng)誘變更高的突變率[21]，多樣性誘變體和無污染等特點(diǎn)[18,21-24]，同時(shí)還能保持較低的處理溫度。因此，在微生物突變中的使用越來越廣泛[25-26]。

本文采用ARTP誘變野生型菌株蠟狀芽孢桿菌提高殼聚糖酶酶活，較基因工程技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、突變率高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的物理誘變技術(shù)。本研究通過測(cè)其生長(zhǎng)曲線先確定蠟狀芽孢桿菌對(duì)數(shù)期中后期的時(shí)間，再測(cè)定ARTP的最佳致死率時(shí)間，對(duì)蠟狀芽孢桿菌進(jìn)行誘變，篩選酶活提高的菌株。經(jīng)穩(wěn)定性驗(yàn)證后，再通過電鏡觀察誘變菌株的形態(tài)變化，為以后的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鉀、氯化鈉、葡萄糖 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；吐溫-80 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；酵母浸粉 生物試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂 分析純，天津市化學(xué)試劑一廠；蛋白胨 生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酒石酸鉀鈉 分析純，天津市百世化工有限公司；亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸溶液 化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚 分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

ARTP-II常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng) 北京思清源生物科技有限公司；Bioscreen-C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭OY Growth Curves；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡， FEI Apreo HIVac，Czech；ELX800酶標(biāo)儀基因有限公司；ZWYR-D2401恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和溶液

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 為6.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉16 g/L，葡萄糖11.5 g/L，吐 溫-80 1.2 g/L，K2HPO41.4 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L， KH2PO40.6 g/L，NaCl 5 g/L，pH為 6.5,121 ℃滅菌20 min。

1% 膠體殼聚糖溶液：量取1 g殼聚糖粉末（脫乙酰度≥90%）于燒杯中，取20 mL蒸餾水倒入燒杯，室溫靜置2 min使其溶脹，然后倒入30 mL 0.2 mol/L的醋酸溶液中，攪拌至透明后，再加入0.2 mol/L的醋酸鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至5.5，再用蒸餾水定容至100 mL。

3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：甲液：稱取 6.9 g結(jié)晶苯酚溶解于 15.2 mL 10%的 NaOH 溶液中，稀釋至 69 mL，在此溶液中加入 6.9 g亞硫酸鈉。乙液：稱取 255.0 g 酒石酸鉀鈉，加到 300 mL 10%的NaOH 溶液中，再加入 1% 的3,5-二硝基水楊酸溶液880 mL。將甲乙溶液混合，棕色瓶中室溫下暗處放置一周后使用。

As為內(nèi)參物對(duì)照品s的峰面積，Cs為內(nèi)參物對(duì)照品s的質(zhì)量濃度，Ai為某待測(cè)成分對(duì)照品i的峰面積，Ci為某待測(cè)成分對(duì)照品i的質(zhì)量濃度

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 為得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌株種子發(fā)酵液，將保藏在天津科技大學(xué)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)為：TCCC 150018 的蠟狀芽孢桿菌接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔1 h，測(cè)定種子液的OD600nm。

1.3.2 菌懸液的制備 將在4 ℃冰箱平板上保存的菌株活化后，再接入50 mL種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)6 h，在8000 r/min條件下，離心5 min，去除上清液，收集菌體，生理鹽水清洗2～3次后，再用生理鹽水稀釋菌液濃度為106～108CFU/mL，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度。

1.3.3 菌株誘變 吸取10 μL 1.3.2所制菌液，均勻涂于載片表面，利用無菌鑷子將載片放于ARTP系統(tǒng)操作室的旋轉(zhuǎn)臺(tái)上的對(duì)應(yīng)孔位，調(diào)整照射距離2 mm，氣流量10 L/min，輸出功率為100 W，進(jìn)行誘變，分別處理0、10、20、30、40、50、60和70 s，誘變結(jié)束后，將載片放置于裝有1 mL無菌生理鹽水的1 mL離心管中，劇烈振蕩，將菌液洗脫下來，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，分別取200 μL涂布于種子液固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，并獲取致死曲線，致死率公式如下[27]：

式（1）中：T為ARTP處理0 s時(shí)的菌落數(shù)（未處理的的總菌落數(shù)）；A為ARTP處理后存活的菌落數(shù)。

1.3.4 誘變菌株的篩選 根據(jù)致死率曲線選擇最佳照射時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)[28]，將誘變后的菌液載片置于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中搖勻，接于兩塊100孔微孔板中，每孔接200 μL，將微孔板置于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中[29]，培養(yǎng)48 h，選擇OD600nm差值大的微孔，吸取100 μL，按照1.3.5所示的方法測(cè)量所選擇微孔的酶活，得到酶活/OD600nm較高的孔。

將酶活較高的微孔中剩余的100 μL菌液，均勻涂布于種子培養(yǎng)基的平板上，30℃培養(yǎng)24 h，再根據(jù)平板上菌落的形態(tài)大小，挑選一些單個(gè)菌落保存，然后對(duì)所挑選菌株，再次進(jìn)行酶活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，利用發(fā)酵培養(yǎng)基，160 r/min，30 ℃搖瓶培養(yǎng)72 h，得到高產(chǎn)酶活的菌株。

1.3.5 殼聚糖酶活力的測(cè)定方法 空白組：將0.9 mL緩沖液和0.1 mL上清酶液混合在沸水浴中10 min進(jìn)行滅酶處理，然后加入1 mL 1%膠體殼聚糖放在35 ℃水浴15 min，

反應(yīng)組：將0.9 mL緩沖液、0.1 mL上清酶液和1 mL 1%膠體殼聚糖放在35 ℃水浴15 min，然后沸水浴中10 min，

1.3.6 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液以8000 r/min離心5 min去除菌體，取上清液即發(fā)酵粗酶液，按照1.3.5的方法，取稀釋后的0.1 mL發(fā)酵粗酶液測(cè)定發(fā)酵液的酶活力。測(cè)量反應(yīng)組和空白組OD490nm，通過計(jì)算差值，根據(jù)氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖，再根據(jù)酶活力定義[31]，測(cè)定發(fā)酵粗酶液的酶活力，從而繪制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線[32-33]。

1.3.7 穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 將篩選得到的高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)6代，對(duì)該突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，并將各代進(jìn)行相應(yīng)的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較每代殼聚糖酶酶活力變化，測(cè)定菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 菌株電鏡觀察 為觀察單個(gè)突變菌株和原始菌株在形態(tài)大小方面的差異，需使用電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。操作方法如下：將突變株和原始菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，在8000 r/min下，離心5 min，收集菌體，使用無菌水清洗3 次以上，再使用25%的戊二醛固定菌體，在4 ℃冰箱中放置4 h。再使用酒精進(jìn)行梯度洗脫，先使用30%、50%和70%的酒精各浸泡10 min，離心，再使用80%和90%的酒精浸泡8 min，離心，最后使用100%的酒精浸泡5 min，將菌懸液滴至蓋玻片（4～6 mm2）上，揮發(fā)干燥后，最后噴金使用電鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2019數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上述1.3.5和1.3.6的方法以酶活A(yù)ct為縱坐標(biāo)，OD490nm值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析，得到如圖1所示的回歸方程和R2，R2=0.9994＞0.999，所以此回歸方程可用于測(cè)定溶液中的酶活。

圖1 酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of enzyme activity

2.2 蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖2所示， 前8 h是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～12 h 是生長(zhǎng)周期的穩(wěn)定期，其中6～8 h是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期， ARTP誘變需要收集處于對(duì)數(shù)期中后期的菌液，6～8 h的菌液符合對(duì)數(shù)期中后期要求，因此，選擇第6 h的菌液作為ARTP實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖2 蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Bacillus cereus

2.3 致死率曲線

利用ARTP誘變蠟狀芽孢桿菌致死率曲線如圖3所示，隨著誘變時(shí)間的增加，菌株致死率逐漸上升。當(dāng)菌株在照射時(shí)間為30 s和50 s時(shí)，出現(xiàn)致死率下降的現(xiàn)象，推斷原因可能是菌體自身的修復(fù)機(jī)制作用，使菌體修復(fù)了ARTP所造成的損傷[34]。當(dāng)照射時(shí)間為60 s時(shí)，菌株的致死率達(dá)到85%左右，70 s時(shí)菌株存活率幾乎為零，有研究表明，在一定的處理?xiàng)l件下，孢子的致死率在70%～85%之間時(shí)[35]，正突變率較高，隨著孢子致死率的增加，正突變率逐漸降低而負(fù)突變率急劇上升，無法達(dá)到篩選優(yōu)良目的，故本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)選用致死率在70%～85%菌種為篩選菌種。且在此突變率下回復(fù)性更小[36]，所以選擇60 s作為ARTP的照射時(shí)間。

圖3 致死率曲線Fig.3 Curve of lethality rate

2.4 誘變菌株的篩選

菌株發(fā)酵殼聚糖酶的產(chǎn)量與菌株的濃度有著密切聯(lián)系，因此在進(jìn)一步誘變處理后，根據(jù)高密度培養(yǎng)所得的OD600nm值，選擇了OD600nm增加值較大的30個(gè)孔，吸取100 μL發(fā)酵液測(cè)定酶活，計(jì)算出酶活/OD600nm，并根據(jù)酶活/OD600nm的大小降序排列，如表1所示。

根據(jù)表1所示，將這30個(gè)孔中酶活/OD600nm值最大的六個(gè)孔，即202、129、115、221、113和188六個(gè)微孔，涂布于種子培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，使孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)并且大量繁殖菌絲體，使誘變后的菌體長(zhǎng)得更加粗壯，活力強(qiáng)[37]。培養(yǎng)6 h后，在選擇的這六個(gè)孔中分別挑選菌落大小、與形態(tài)大小不同的菌株，進(jìn)行酶活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。0號(hào)菌株為原菌株，其他為所挑選的誘變之后的菌株，可以明確地看到僅有202-1一株菌株的酶活較原菌株高。經(jīng)測(cè)定，ARTP誘變之前，原始菌株的酶活為8.3581 U/mL，誘變后，酶活提高到9.4606 U/mL，較原菌株酶活提高了13.19%。有研究用紫外誘變菌株，在紫外照射100 s時(shí)生產(chǎn)殼聚糖酶，菌株的產(chǎn)酶活力最高為8.92 U/mL；用DES誘變菌株處理 50 min生產(chǎn)殼聚糖酶，菌株殼聚糖酶活最高達(dá)到8.12 U/mL[38]?？梢园l(fā)現(xiàn)ARTP誘變可以有效地改變菌株的酶活。還有研究利用ARTP 誘變黑曲霉以提高產(chǎn)單寧酶的能力[39]，通過APTP 提高菌株葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量[40]，這些研究可以發(fā)現(xiàn)，ARTP誘變技術(shù)還可以有效地改變不同酶的酶活。

表1 突變菌株的篩選Table 1 The mutant strains screening

表2 突變株搖瓶發(fā)酵復(fù)篩Table 2 The mutants strains in shake flask screening

2.5 突變株穩(wěn)定性分析

以防此突變株在傳代過程中發(fā)生菌株“衰退”的情況，所以進(jìn)行突變穩(wěn)定性的分析。對(duì)編號(hào)202-1菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用種子培養(yǎng)基斜面連續(xù)培養(yǎng)6代。將每代菌株制成種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)之后，結(jié)果如圖4所示。該菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)之后，測(cè)定其酶活力，傳代 1～6 次的酶活分別為9.6345、9.2578、9.8158、9.7349、9.3157和10.1015 U/mL，這六代培養(yǎng)的平均酶活為9.643367 U/mL，波動(dòng)在5%之內(nèi)，由此可以看出該菌株能穩(wěn)定產(chǎn)酶。

由圖4可知，殼聚糖酶活力出現(xiàn)上下波動(dòng)的趨勢(shì)，在第2代、第5代下降較為明顯，而在第3代、第6代明顯提高，可能是由于菌體自身的正負(fù)調(diào)控基因的修復(fù)機(jī)制[34]。篩選的編號(hào)202-1菌株，在連續(xù)傳代6次的酶活較穩(wěn)定。說明該菌株在傳代的過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，從工業(yè)化生產(chǎn)的角度分析，該菌株可保證在生產(chǎn)過程中殼聚糖酶產(chǎn)量的穩(wěn)定性，即在相同條件下該菌株產(chǎn)酶性能不變。因此，編號(hào)202-1具有產(chǎn)酶量高，穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于后續(xù)的出發(fā)菌株。也有研究利用ARTP誘變對(duì)番茄枯萎病有拮抗作用的枯草芽孢桿菌，經(jīng)過6次傳代，獲得番茄枯萎病高效拮抗突變株，證實(shí)該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性[26]。因此用ARTP誘變技術(shù)對(duì)培育突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變株遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strains

2.6 菌株電鏡觀察

微生物的突變株往往伴隨菌落形態(tài)的變化[41]，圖5（a）為菌株的菌落劃線圖，圖5（b）、圖5（c）分別為原始菌株和突變菌株單個(gè)菌體的電鏡掃描圖。突變株和原始菌株的菌落形態(tài)均為圖5（a）所示，菌落形態(tài)呈白色圓形狀，表面光滑具有粘性。圖5（b）、圖5（c）所示分別為原始菌株和突變菌株的電鏡掃描圖，兩張電鏡掃描圖進(jìn)行比較，單個(gè)原始菌株長(zhǎng)4.02 μm，寬1.15 μm，單個(gè)突變菌株長(zhǎng)5.05 μm，寬1.07 μm，突變菌株的單個(gè)菌株較原始菌株更加細(xì)長(zhǎng)。雖然從菌落形態(tài)沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化，但是從電鏡掃描圖可看出ARTP對(duì)菌體的個(gè)體形態(tài)造成了明顯變化。研究表明，大多數(shù)的突變菌株比原始出發(fā)菌株偏大，而菌株的大小說明了突變株的生長(zhǎng)速度[41]，突變菌株比原始菌株偏大，生長(zhǎng)速度也較快。

圖5 蠟狀芽孢桿菌菌株形態(tài)Fig.5 Bacillus cereus strain morphology

3 結(jié)論

本研究采用 ARTP 誘變野生型菌株蠟狀芽孢桿菌提高殼聚糖酶酶活，較基因工程技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，突變率高和無污染等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的物理誘變技術(shù)。本研究以生長(zhǎng)6 h的蠟狀芽孢桿菌為基礎(chǔ)菌株，在ARTP誘變60 s時(shí)，其致死率可達(dá)到85%，誘變得到一株酶活提高了13.19%的菌株。然后進(jìn)行酶活穩(wěn)定性驗(yàn)證，經(jīng)六代培養(yǎng)的平均酶活為9.643367 U/mL，波動(dòng)在5%之內(nèi)，表明其產(chǎn)酶量高，穩(wěn)定性強(qiáng)。最后對(duì)菌株進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)誘變菌株的個(gè)體形態(tài)發(fā)生變化，較初始菌株細(xì)長(zhǎng)，證明菌株的生長(zhǎng)速度變快，同時(shí)也表明酶活提高是ARTP誘變起到的作用。