珍珠肽螯合鈣的制備與性質(zhì)表征

馮思敏，王 晶，王羽瑩，孫培龍，邵 平

（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310014）

鈣是人體內(nèi)含量最高的無(wú)機(jī)元素，涉及人體內(nèi)多種生理功能。鈣攝入充足可減少骨損失、預(yù)防骨質(zhì)疏松和齲齒等，還可參與酶調(diào)節(jié)、凝血、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性、調(diào)節(jié)肌肉的正?；顒?dòng)等功能。人體內(nèi)許多關(guān)鍵的過(guò)程如細(xì)胞增殖、激素調(diào)節(jié)及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等也與鈣相關(guān)[1]，鈣攝入不足時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致許多不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致疾病產(chǎn)生。

珍珠為貝類(lèi)動(dòng)物外套膜受刺激后，不斷分泌珍珠質(zhì)而形成的粒狀體，除含有95%左右的碳酸鈣和5%左右的有機(jī)質(zhì)外[2]，還含有30多種常量和微量元素，其中相當(dāng)一部分是人體容易缺乏而需要補(bǔ)充的礦物質(zhì)元素[3]。珍珠的臨床應(yīng)用十分廣泛[4]，目前已有研究發(fā)現(xiàn)珍珠粉具有抗氧化[5]、抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)修復(fù)骨損傷[6-7]、可用于治療口瘡[8]等能力，并有減少感染風(fēng)險(xiǎn)、促進(jìn)凝血等效果。

肽鈣螯合物中的多肽可在鈣離子的跨膜運(yùn)輸中作為載體，有速度快、載體利用度高等優(yōu)勢(shì)，并且多肽種類(lèi)決定了腸道鈣吸收情況，其中降血壓活性肽[9]、金屬螯合活性肽[10-13]以及抗氧化活性肽[14]都有相關(guān)報(bào)道；酶水解法利用了酶的高效催化作用，在合適的條件下，通過(guò)酶水解蛋白釋放多種生物活性的肽段[15]。酶水解法因反應(yīng)條件溫和，水解時(shí)間較短，且能夠完整的保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)功能，基本不破壞氨基酸，不易發(fā)生消旋現(xiàn)象[16]等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的水解。如劉鳳茹[17]用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等酶解麥胚蛋白以制備肽螯合鈣。地衣芽孢桿菌可生成豐富的胞外酶系，其中一些蛋白酶能夠有效地降解各種大分子物質(zhì)，還能在有機(jī)溶劑中催化多肽的合成[18]。

目前，人類(lèi)最普遍的鈣來(lái)源是離子鈣，如碳酸鈣、葡萄糖酸鈣及乳酸鈣等[19]。然而，離子鈣易在腸道中生成鈣沉淀[20]，導(dǎo)致日常飲食中鈣的吸收率和生物利用度會(huì)減弱許多。另外，鈣攝入過(guò)多易對(duì)消化系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，如便秘、多氣、脹氣和腹脹等現(xiàn)象。關(guān)于肽螯合鈣的研究有很多，例如崔宇、丁媛媛、曲航、詹萍等[21-24]分別以大豆肽、麥胚多肽、黑木耳肽、葵花籽粕復(fù)合肽為原料制備肽螯合鈣，并對(duì)其生理活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)生成的肽螯合鈣具有一定的生理活性。BAO等[25]和ZHANG等[26]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白、磷光蛋白水解產(chǎn)物具有鈣螯合能力，可以作為鈣補(bǔ)充劑的生產(chǎn)原料。由于珍珠獨(dú)特的形成過(guò)程，使得珍珠肽具有較強(qiáng)的鈣螯合能力[27]，將珍珠肽與鈣通過(guò)螯合得到珍珠肽螯合鈣，可以在不影響其他微量元素及維生素等營(yíng)養(yǎng)成分吸收的情況下，具有吸收快、營(yíng)養(yǎng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。珍珠肽螯合鈣可作為一款新型鈣補(bǔ)充劑，代表著補(bǔ)鈣產(chǎn)品發(fā)展的新方向，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和可行性，值得深入研究。

本研究以珍珠粉為原料，使用丙酸對(duì)珍珠粉進(jìn)行酸解來(lái)提取珍珠蛋白，地衣芽孢桿菌源蛋白酶（BLP酶）對(duì)珍珠蛋白進(jìn)行酶解，將處理后的酶解液進(jìn)行冷凍干燥得到目標(biāo)肽，在得到的珍珠肽里面加入鈣源，于恰當(dāng)?shù)耐饨鐥l件下進(jìn)行螯合，最后用乙醇沉淀法使產(chǎn)物、游離鈣離子及目標(biāo)肽分開(kāi)，得到珍珠肽螯合鈣。并對(duì)珍珠肽和珍珠肽鈣螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，可證明反應(yīng)過(guò)程中螯合物的產(chǎn)生，為珍珠的深加工和利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珍珠粉 浙江長(zhǎng)生鳥(niǎo)健康科技股份有限公司提供；地衣芽孢桿菌源蛋白酶（BLP，200 U/mg） 南寧東恒華道生物科技有限公司提供；堿性蛋白酶（Alkaline proteinase，≥200000 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司；所用試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Allegra 64k臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)中國(guó)有限公司；MX-S旋渦混合器北京科博賽爾科技有限公司；RE-2000A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海研承儀器有限公司；UV-265分光光度計(jì)日本島津公司；RE-2000A真空離心濃縮儀 上海研承儀器有限公司；BTP-3XL冷凍干燥儀 美國(guó)Virtis公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀 海能儀器；Q20差示掃描量熱儀 美國(guó)TA儀器有限公司；ARL X’TRA X射線(xiàn)衍射儀、Nicolet iS 5傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；J-815圓二色光譜儀 北京國(guó)嘉恒業(yè)科學(xué)儀器有限公司； Nano nova 450掃描電子顯微鏡 FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 珍珠蛋白提取 用蒸餾水將乙酸、丙酸、檸檬酸分別配成2 mol/L的溶液。珍珠粉/酸液按1:15（w/v）混合反應(yīng)至溶液完全澄清，反應(yīng)完畢后，于4 ℃ 8000 r/min離心5 min，分離上清液，用蒸餾水反復(fù)清洗沉淀，合并上清液，進(jìn)行冷凍干燥，凍干結(jié)束后，及時(shí)取出樣品，置于干燥容器中保存?zhèn)溆?。珍珠蛋白含量的測(cè)定使用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.2 珍珠肽的制備 稱(chēng)取一定量的珍珠蛋白溶于水中，配置質(zhì)量濃度為50 g/L的珍珠蛋白溶液，酶與底物按1:50的比例分別加入堿性蛋白酶、BLP酶以及上述兩種酶復(fù)合（1:1），用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，于50 ℃恒溫水浴鍋水解4 h后升溫至100 ℃滅酶10 min，后過(guò)濾，將得到的濾過(guò)液凍干，得到珍珠肽。珍珠肽得率按照下式計(jì)算：

式中：m1為珍珠肽質(zhì)量，g；m2為珍珠蛋白質(zhì)量，g。

第四，我們就應(yīng)該將課標(biāo)中對(duì)朗讀的“一般要求”和“特殊要求”聯(lián)系起來(lái)加以理解。如同前述第一點(diǎn)所言，“朗讀”必須和“閱讀”聯(lián)系起來(lái)，融入一個(gè)更大的意義背景和審美語(yǔ)境，才有確證其存在的意義和價(jià)值。當(dāng)我們將“一般要求”（朗讀技巧）和“特殊要求”（朗讀意義）聯(lián)系起來(lái)解讀，就能真正切人朗讀教學(xué)的終極旨?xì)w——為人而讀。

1.2.3 珍珠肽-鈣絡(luò)合物的制備 配制20 mmol/L的Tris-HCl（pH7.8）溶液，將珍珠肽溶于此緩沖液中，得到濃度為20 mg/mL的溶液[28]，珍珠肽與氯化鈣按1:1（g/nmol）的比例，加入適量0.2 mol/L氯化鈣溶液，混勻。在恒溫水浴鍋中40 ℃下反應(yīng)1 h。離心（8000 r/min 5 min），按上清液和無(wú)水乙醇的體積比為4:3加入無(wú)水乙醇，靜置，沉淀即珍珠肽-鈣絡(luò)合物。螯合物得率按下式計(jì)算：

式中：M1為螯合物質(zhì)量，g；M2為珍珠蛋白肽質(zhì)量，g；M3為添加的鈣離子的質(zhì)量，g。

1.2.4 鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 經(jīng)醇沉得到的反應(yīng)產(chǎn)物加適量蒸餾水于錐形瓶中溶解，同時(shí)以50 mL的蒸餾水作為對(duì)照組。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到10.0，再滴入3～5滴鈣紅指示劑。用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液緩慢滴定并不斷搖晃錐形瓶，直至錐形瓶?jī)?nèi)溶液變?yōu)樗{(lán)色，記錄各個(gè)樣品所消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。樣品中鈣含量按下式計(jì)算：

式中：40.08為鈣的原子量，g/moL；c為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V為EDTA標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；m為肽螯合鈣質(zhì)量，g。

1.2.5 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析 分別稱(chēng)取一定量的珍珠肽和珍珠肽-鈣螯合物配置為質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定190～550 nm范圍內(nèi)吸光度值的變化，波長(zhǎng)掃描間隔2 nm，以波長(zhǎng)與吸光度值繪制該樣品的光譜曲線(xiàn)。

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析 將約含1%樣品（珍珠肽和珍珠肽鈣螯合物）的KBr粉末于瑪瑙研缽中研磨、壓片，采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)薄片掃描，波數(shù)范圍4000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1，分別測(cè)定測(cè)量珍珠肽和珍珠肽-鈣螯合物的紅外光譜，結(jié)果以透光率來(lái)表示[29]。

1.2.7 圓二色譜分析 分別稱(chēng)取一定量的珍珠肽和珍珠肽-鈣螯合物配置為質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，進(jìn)行圓二色譜分析。具體測(cè)試條件：樣品池厚0.1 cm，譜帶寬度1.0 nm，波長(zhǎng)范圍190～320 nm，掃速100 nm/min。

1.2.9 差示掃描量熱分析 分別稱(chēng)取5 mg珍珠肽及珍珠肽-鈣螯合物于坩堝內(nèi)，再置于儀器中，進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。溫度范圍為25～200 ℃，升溫速度10 ℃/min，N2流速50 mL/min[30]。

1.2.10 掃描電鏡分析 取珍珠肽及珍珠肽螯合鈣樣品均勻涂在樣盤(pán)的雙面膠上,噴金后放入掃描電鏡內(nèi)抽真空, 施加一定電壓后, 在設(shè)定倍數(shù)下保存掃描圖像。電鏡掃描條件：高壓15 kV，束流6.9×10-2mA，工作距離16.2 mm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Origin 2019軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。使用IBM公司的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 25.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三組數(shù)據(jù)平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 珍珠肽螯合鈣的制備

采用乙酸、丙酸、檸檬酸三種酸分別對(duì)珍珠粉進(jìn)行酸解來(lái)提取珍珠蛋白。由于使用檸檬酸提取珍珠蛋白的溶液底部存在較多白色固體顆粒，推測(cè)為珍珠粉殘留，因此檸檬酸不適用于酸解珍珠粉。如圖1（A）所示，利用乙酸、丙酸酸解珍珠粉后經(jīng)離心處理，再用凱氏定氮法測(cè)定所得產(chǎn)物，得到珍珠蛋白平均得率分別為1.07±0.02、2.13±0.05 g/100 g，且二者珍珠蛋白得率之比約為1:2，于是最終選用丙酸來(lái)酸解珍珠粉以制備珍珠蛋白。夏靜芬等[2]對(duì)珍珠粉的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明珍珠粉平均蛋白質(zhì)含量為2.21%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 酸種類(lèi)對(duì)珍珠蛋白（A）得率，酶種類(lèi)對(duì)珍珠肽（B）、珍珠肽螯合鈣（C）得率以及珍珠肽螯合鈣鈣含量（D）的影響Fig.1 Effect of acid types on the yield of pearl protein （A），effects of enzyme types on the yield of pearl peptide（B），the yield of calcium chelate of pearl peptide （C） and calcium content of pearl peptide chelate calcium（D）

將得到的珍珠蛋白離心后，分別用堿性蛋白酶、BLP酶及兩酶復(fù)合（1:1）使用對(duì)珍珠蛋白進(jìn)行酶解，把處理后的酶解液進(jìn)行冷凍干燥得到珍珠肽，按照步驟1.2.3，使珍珠肽與氯化鈣螯合得到珍珠肽螯合鈣。

如圖1（B）所示，堿性蛋白酶、BLP酶以及上述兩種酶復(fù)合（1：1）的珍珠肽平均得率分別為68.60%±8.40%、52.42%±10.00%、61.30%±4.30%。珍珠肽螯合鈣平均得率如圖1（C）所示，分別為17.97%±1.60%、27.24%±1.29%、22.51%±1.79%。接著使用EDTA滴定法測(cè)得珍珠肽螯合鈣鈣含量見(jiàn)圖1（D），珍珠肽螯合鈣中平均鈣含量分別為35.53%±0.92%、48.75%±1.20%、39.86%±1.00%，可知BLP酶處理珍珠蛋白所得珍珠肽與鈣螯合所得產(chǎn)物的鈣含量相對(duì)較高，其次為兩酶復(fù)合處理所得珍珠肽與鈣螯合產(chǎn)物。

綜上，結(jié)果表明，珍珠肽得率、珍珠肽螯合鈣得率以及珍珠肽螯合鈣鈣含量有顯著性差異（P＜0.05）。相比較之下，BLP酶處理珍珠蛋白所得肽鈣螯合物鈣含量最高，這極有可能與酶對(duì)底物的作用位點(diǎn)相關(guān)。在BLP酶作用下，珍珠肽暴露出的基團(tuán)更易與鈣螯合，故使用BLP酶對(duì)珍珠蛋白進(jìn)行酶解效果最優(yōu)。

2.2 珍珠肽螯合鈣的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析 珍珠肽與珍珠肽螯合鈣的溶液在190～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的掃描曲線(xiàn)如圖2所示。從圖2中可以看出，珍珠肽與珍珠肽螯合物的部分紫外吸收光譜發(fā)生了明顯的改變。珍珠肽在223 nm和267 nm處具有明顯的吸收峰，而珍珠肽與Ca2+螯合后，其吸收峰分別移至228 nm和270 nm處。此外，珍珠肽螯合物的吸光度與珍珠肽吸光度相比，明顯升高。珍珠肽的最大吸收峰在220 nm左右，主要是由肽鍵中C=O的n→π*躍遷引起的[31-32]；當(dāng)珍珠肽與Ca2+發(fā)生螯合反應(yīng)后，Ca2+與珍珠肽中的N、O形成配位鍵后，影響了肽鍵上C=O的n→π*電子躍遷，從而使其發(fā)生紅移現(xiàn)象。此外，珍珠肽在267 nm處的強(qiáng)吸收峰通常是苯丙氨酸的特征吸收峰，當(dāng)其與Ca2+發(fā)生螯合反應(yīng)后紅移[33-34]至270 nm，這是配體N-C-O中π→π*電子躍遷所導(dǎo)致[35]。由此可知珍珠肽與Ca2+之間發(fā)生了相互作用，并生成了一種不同于珍珠肽的新化合物。紫外可見(jiàn)光譜證明了珍珠肽與Ca2+發(fā)生螯合反應(yīng)并生成螯合物[36-38]。

圖2 珍珠肽及珍珠肽螯合鈣的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.2 UV spectra of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 圖3是珍珠肽和珍珠肽螯合鈣在400～4000 cm-1范圍內(nèi)的傅里葉紅外光譜圖，兩種物質(zhì)在吸收峰強(qiáng)度和位置方面均發(fā)生變化，可用來(lái)證明肽鈣螯合物的生成及螯合過(guò)程中發(fā)生反應(yīng)的具體基團(tuán)。如圖3所示，珍珠肽于1665.17 cm-1處吸收峰屬于酰胺Ⅰ帶，是由C=O的伸縮振動(dòng)引起的；1417.41 cm-1處的吸收峰屬于酰胺Ⅱ帶，是由CN鍵的伸縮振動(dòng)和N-H鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)引起的；珍珠肽光譜圖中3376.44 cm-1處吸收峰是由N-H伸縮振動(dòng)引起的，而在珍珠肽螯合鈣光譜圖中，該伸縮振動(dòng)吸收峰藍(lán)移到3353.53 cm-1處，吸收峰的改變說(shuō)明Ca2+與-NH2發(fā)生結(jié)合；于1690～1650 cm-1范圍的特征吸收峰主要源于C=O的伸縮振動(dòng)[39-40]，螯合后由原來(lái)的1665.17 cm-1移動(dòng)到1661.83 cm-1處，此峰位置的改變說(shuō)明羧酸基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式與鈣離子發(fā)生了結(jié)合；-COO-羧酸鹽基團(tuán)的特征吸收峰從1417.41 cm-1移到1411.62 cm-1，藍(lán)移了6個(gè)波數(shù)，表明-COOH參與了金屬離子的結(jié)合形成相應(yīng)的鹽，類(lèi)似于-COO-Ca-結(jié)構(gòu)[41]；C-O單鍵的伸縮振動(dòng)與-OH的彎曲振動(dòng)引起的特征吸收峰在1100～1000 cm-1范圍內(nèi)，圖3中1048.66 cm-1處的吸收峰來(lái)源于C-O的伸縮振動(dòng)[42]，螯合后發(fā)生紅移，于1094.19 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰；由于螯合過(guò)程中-CH彎曲振動(dòng)，珍珠肽于900～800 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰消失。傅里葉紅外光譜分析結(jié)果表明N、O原子與鈣形成了配位鍵，并參與了肽鈣螯合物的形成[43-46]，該結(jié)果與劉玉玉等[47]利用FTIR研究發(fā)現(xiàn)白鰱魚(yú)皮膠原蛋白肽的羧基和氨基與鈣離子螯合后生成肽-鈣螯合物結(jié)果趨于一致。

圖3 珍珠肽及珍珠肽螯合鈣的傅里葉紅外光譜Fig.3 FTIR of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide

2.2.3 圓二色光譜分析 圓二色光譜是目前應(yīng)用最為廣泛的測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法；多肽的圓二色譜分為190～250 nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)和250～320 nm的近紫外區(qū)，前者范圍內(nèi)的主要發(fā)色基團(tuán)為肽鍵及多肽側(cè)鏈上的芳環(huán)，而在遠(yuǎn)紫外區(qū)，通常其圖譜中包含一個(gè)在190 nm附近的正峰及一個(gè)在205～240 nm范圍內(nèi)的負(fù)峰，其中負(fù)峰的形狀主要由多肽主鏈的結(jié)構(gòu)決定[48]。對(duì)珍珠肽和珍珠肽鈣螯合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)用圓二色譜儀進(jìn)行分析，如圖4所示，珍珠肽的圓二色光譜圖在190 nm附近有一正峰，于208 nm和220 nm附近出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶；當(dāng)珍珠肽與鈣螯合后，珍珠肽在遠(yuǎn)紫外區(qū)205 nm附近的負(fù)峰消失，且峰明顯減弱；近紫外區(qū)260 nm、278 nm附近的正峰位置發(fā)生改變，且峰增強(qiáng)。綜上，珍珠肽與鈣離子螯合過(guò)程中，有新的離子鍵和共價(jià)鍵等產(chǎn)生，導(dǎo)致珍珠肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，由原來(lái)的無(wú)序結(jié)構(gòu)向更加有序、規(guī)則的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，體現(xiàn)為圓二色譜中峰的位置及吸收強(qiáng)弱的變化。在對(duì)雞肉蛋白肽螯合鈣進(jìn)行圓二色譜檢測(cè)時(shí)，魏新顏[49]發(fā)現(xiàn)，在螯合鈣離子后，240 nm處的負(fù)峰減小，兩旁的肩峰也略有減小。

圖4 珍珠肽及珍珠肽螯合鈣的圓二色譜Fig.4 CD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide

2.2.4 X射線(xiàn)衍射分析 利用晶體形成的X射線(xiàn)衍射，對(duì)物質(zhì)內(nèi)部原子在空間分布狀況的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的一種方法。分別對(duì)珍珠肽、珍珠肽鈣螯合物進(jìn)行XRD分析，結(jié)果如圖5所示，由圖可見(jiàn)珍珠肽與鈣離子螯合前后，X射線(xiàn)衍射結(jié)果發(fā)生顯著的變化。珍珠肽作為有機(jī)物，僅在22°附近有一較寬的峰，且強(qiáng)度較低，說(shuō)明珍珠肽的內(nèi)部狀態(tài)還較為松散，在珍珠肽和CaCl2反應(yīng)后，珍珠肽鈣螯合物于22°附近存在兩處衍射峰，且角度較小處的峰強(qiáng)度遠(yuǎn)大于原珍珠肽在此處的峰強(qiáng)度，同時(shí)，在39°～42°也存在新的衍射峰，原峰的變化及新峰的出現(xiàn)說(shuō)明珍珠肽與鈣離子間通過(guò)共價(jià)鍵與離子鍵螯合，形成了新的產(chǎn)物。珍珠肽螯合鈣的X射線(xiàn)衍射圖譜具有多個(gè)典型晶型的尖銳的衍射峰，同時(shí)也存在著幾個(gè)弱的彌散型衍射峰。這表明珍珠肽在螯合Ca2+之后，自身的結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，由結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無(wú)定型結(jié)構(gòu)兩部分組成，結(jié)晶度較螯合前有大幅度提高。同樣的王俊強(qiáng)[50]在大豆肽鈣螯合物的結(jié)合機(jī)理及其性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大豆肽與CaCl2反應(yīng)后，其特征衍射峰會(huì)消失，并且大豆肽于20°的衍射峰強(qiáng)度下降，峰寬變窄，并衍射峰向右偏移，同時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)新的衍射峰。

圖5 珍珠肽及珍珠肽螯合鈣的X射線(xiàn)衍射Fig.5 XRD of pearl peptide and calcium chelate by pearl peptide

2.2.5 差示掃描量熱分析 掃描差示量熱法是熱分析的一種方法，其在程序升溫的條件下，測(cè)量試樣與參比物之間的能量差隨溫度變化，可用來(lái)分析蛋白質(zhì)、核酸等的構(gòu)象變化。圖6是對(duì)珍珠肽和珍珠肽螯合鈣進(jìn)行DSC分析的圖譜，由圖6（A）可知，珍珠肽在119.4 ℃處有一吸熱峰，主要由珍珠肽中的化學(xué)鍵斷裂吸熱導(dǎo)致，其鍵能為279.9 J/g。由圖6（B）可知，在珍珠肽與鈣螯合后，其吸熱峰左移至108.3 ℃處，鍵能則變?yōu)?06.5 J/g。珍珠肽與鈣離子螯合后發(fā)生熱變性，生成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的新物質(zhì)[51-52]，由于螯合后自然結(jié)構(gòu)被改變導(dǎo)致了鍵能的升高，珍珠肽的化學(xué)鍵受到了鈣的影響，于是可初步判斷珍珠肽與鈣離子發(fā)生了螯合。

圖6 珍珠肽（A）和珍珠肽螯合鈣（B）的差示掃描量熱曲線(xiàn)Fig.6 DSC of pearl peptide（A）and calcium chelate by pearl peptide（B）

2.2.6 掃描電鏡分析 圖7是珍珠肽及珍珠肽螯合鈣的電鏡掃描圖，從圖中可以看出，珍珠肽的微觀表面光滑平整，且聚集成團(tuán)；而肽鈣螯合后，珍珠肽與鈣離子主要通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵等作用形成粗糙的小顆粒聚集現(xiàn)象[53-54]，并可以看出一些小顆粒附著在結(jié)構(gòu)表面，類(lèi)似鹽的結(jié)構(gòu)；這是由于珍珠肽與鈣螯合過(guò)程中形成了多肽螯合鈣，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并且分子量由小變大，同時(shí)在螯合過(guò)程中出現(xiàn)了一定量的鈣晶體，并附著在螯合物表面，因此由原來(lái)的細(xì)膩?zhàn)兊拇植?；證明珍珠肽與鈣離子螯合后生成螯合鹽類(lèi)物質(zhì)[55]，也佐證了珍珠肽與珍珠肽螯合鈣的X射線(xiàn)衍射結(jié)果中，珍珠肽呈無(wú)定型狀態(tài)且螯合后的產(chǎn)物向晶體態(tài)轉(zhuǎn)變的結(jié)論[56]。丁媛媛等[22]在麥胚多肽-鈣螯合物研究中，通過(guò)掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)麥胚多肽之間通過(guò)鈣離子連接發(fā)生交聯(lián)，形成較大顆粒，而且這些顆粒之間相互吸引進(jìn)而發(fā)生聚集。

圖7 珍珠肽（A）和珍珠肽螯合鈣（B）的掃描電鏡圖Fig.7 SEM of pearl peptide（A） and calcium chelate by pearl peptide（B）

3 結(jié)論

珍珠粉經(jīng)過(guò)丙酸酸解、重復(fù)離心除雜后，使用BLP酶對(duì)珍珠蛋白進(jìn)行酶解，最終珍珠肽螯合鈣得率和珍珠肽螯合物中鈣含量相對(duì)較高。紫外-可見(jiàn)吸收光譜，傅里葉紅外光譜說(shuō)明珍珠肽的氨基和羧基都參與了螯合反應(yīng)。圓二色譜、X射線(xiàn)衍射分析結(jié)果表明在珍珠肽與鈣離子螯合過(guò)程中，有新的離子鍵和共價(jià)鍵等產(chǎn)生，并且珍珠肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。差示掃描量熱和掃描電鏡分析結(jié)果表明在珍珠肽螯合鈣之后，珍珠肽鈣螯合物的熱穩(wěn)定變差并且鍵能升高，并且微觀表面由光滑平整且聚集成團(tuán)變?yōu)榇植诘男☆w粒聚集現(xiàn)象，生成類(lèi)似螯合鹽類(lèi)物質(zhì)。