發(fā)芽對(duì)高粱氨基酸及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響

張 俊，張三杉，葉 丹，余夢(mèng)玲，雷 激,

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 四川成都 610039；2.四川天味食品集團(tuán)股份有限公司, 四川成都 610200）

高粱，又稱蜀黍，屬高粱科，一年生草本植物，自古以來就有“五谷之精”、“百谷之長”的盛譽(yù)，是世界上產(chǎn)量僅次于稻米、小麥、玉米及大麥的第五大糧食作物[1]，在非洲、亞洲等國家和地區(qū)，除用作釀造原料或飼料外，也作為主食。但高粱蛋白質(zhì)品質(zhì)較差，缺乏賴氨酸；抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧和植酸含量較高，植酸可與鈣、鋅、鐵、鎂等礦物質(zhì)結(jié)合，形成肌醇六磷酸，導(dǎo)致礦物質(zhì)無法吸收[2]；單寧與體內(nèi)消化酶結(jié)合，影響蛋白、淀粉的消化吸收[3-4]，不僅降低了高梁的營養(yǎng)價(jià)值，也降低了高粱的適口性，使得高粱在食品方面的加工應(yīng)用受到限制。因此，需要采取適當(dāng)方法改善其品質(zhì)。國內(nèi)外許多研究[5-7]表明，籽粒發(fā)芽可以降低谷物中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量，提高谷物中某些氨基酸、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，促進(jìn)人體對(duì)蛋白質(zhì)和淀粉的消化吸收，從而提高其營養(yǎng)價(jià)值。

GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于各種谷物和豆類中。它可以通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起到降低血壓、舒緩血管的作用，同時(shí)具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、調(diào)節(jié)心情、改善睡眠的作用[8-9]；在醫(yī)學(xué)上，GABA還能用于治療癲癇[10]、保護(hù)肝臟[11]等。目前，以富含GABA的發(fā)芽糙米、大豆和蠶豆等為原料開發(fā)的食品已經(jīng)面市，而國內(nèi)關(guān)于發(fā)芽高粱中GABA以及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化的研究相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究高粱發(fā)芽期間營養(yǎng)成分與抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化規(guī)律，為改善高粱營養(yǎng)價(jià)值以及促進(jìn)高粱在食品工業(yè)方面的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白高粱種子 產(chǎn)自江蘇省沭陽縣新河鎮(zhèn)，市售；鹽酸（濃度≥36%）、檸檬酸鈉 優(yōu)級(jí)純，購于成都科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉、三氯化鐵、磺基水楊酸、二甲基甲酰胺、谷氨酸（glutamic acid，GA） 分析純，購于成都科隆化學(xué)品有限公司；GABA標(biāo)準(zhǔn)品、氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)品、植酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品 購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

UV-2600型紫外分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；TG-5M型臺(tái)式離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；TB-214電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BZF型真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；MD200-2型氮吹儀 成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽高粱的制備 參考易翠平等[12]的高粱發(fā)芽實(shí)驗(yàn)：挑選高粱籽粒，確保沒有破損顆粒和其它雜質(zhì)。將浸泡20 h后的高粱用7.0%的H2O2溶液消毒15 min，再用去離子水反復(fù)沖洗。然后將高粱籽粒平鋪于雙層紗布之間，于30 ℃條件下避光發(fā)芽0、12、24、36、48、60、72 h，每隔12 h灑水一次，并清洗紗布和高粱籽粒防止發(fā)霉。將不同發(fā)芽階段的高粱籽粒取出后于40 ℃干燥至水分含量約為13%，粉碎過120目篩，放入4 ℃冰箱冷藏保存、備用。

1.2.2 淀粉含量的測(cè)定 按照國標(biāo)GB 5009.9-2016《食品中淀粉的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 氨基酸和γ-氨基丁酸（GABA）含量的測(cè)定按照國標(biāo)GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 谷氨酸脫羧酶（GAD）活性的測(cè)定 在Maha[13]和曹晶晶等[14]的方法基礎(chǔ)上作適當(dāng)調(diào)整，取1g發(fā)芽高粱與5 mL磷酸鉀緩沖液（0.05 mol/L，pH7.2）混合，10000 r/min離心20 min，上清液為粗酶提取液。取0.5 mL粗酶液，加入200 μL底物溶液（50 mmol/L GA）和1.8 mL磷酸鉀緩沖液（0.05 mol/L，pH5.8），于37 ℃反應(yīng)1 h后，90 ℃水浴10 min反應(yīng)滅酶，離心，取1 mL反應(yīng)液氮吹干燥。加入5 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液溶解干燥物，按照1.2.3方法測(cè)定GABA含量。GAD活性定義：在37 ℃下，1 g高粱每分鐘釋放1 μmol GABA作為一個(gè)酶活力單位，即GAD活力為1 U。

1.2.5 單寧含量的測(cè)定 按照GB/T15686-2008《高粱：?jiǎn)螌幒康臏y(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 植酸含量及植酸酶活性的測(cè)定 植酸含量按照GB5009.153-2016《食品中植酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；植酸酶活性按照GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測(cè)定-分光光度法》進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理組進(jìn)行3次重復(fù)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010分析處理，利用Origin 8.5作圖，通過SPSS 19.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱發(fā)芽過程中淀粉含量的變化

如圖1所示，與未發(fā)芽高粱相比，浸泡處理（0 h）對(duì)淀粉含量無顯著影響（P＞0.05）。隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，高粱淀粉含量顯著下降（P＜0.05）。發(fā)芽72 h后，從72.74%下降到54.44%，這與Li等[15]的研究結(jié)果相似。這是因?yàn)殡S著發(fā)芽時(shí)間的延長，高粱中淀粉酶活性增加，這些酶的作用使淀粉降解成還原糖，以滿足種子萌發(fā)和生長的物質(zhì)和能量的需要[16]。

圖1 高粱發(fā)芽過程中淀粉含量的變化Fig.1 Changes in starch content of sorghum during germination

2.2 高粱發(fā)芽過程中氨基酸含量的變化

由表1可知，不同發(fā)芽時(shí)間處理后高粱的氨基酸含量發(fā)生了很大的變化。與未發(fā)芽高粱相比，發(fā)芽處理后氨基酸總量顯著（P＜0.05）增加，在發(fā)芽60 h達(dá)到最大值為5.694 g/100 g，比未發(fā)芽上升28.50%，各種氨基酸含量也都有不同程度的增加，這與易翠平等[12]的研究結(jié)果相似。必需氨基酸的類型和數(shù)量可以評(píng)估食物蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，必需氨基酸總量顯著（P＜0.05）增加，在發(fā)芽60 h達(dá)到最大值為2.056 g/100 g，比未發(fā)芽上升28.42%；每一種必需氨基酸含量增長情況有所不同，在發(fā)芽48 h，苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸含量達(dá)到最大值，與未發(fā)芽相比分別增加了32.84%、65.12%、33.33%、29.19%；亮氨酸和纈氨酸分別在發(fā)芽60、72 h達(dá)到最大值，與未發(fā)芽相比分別增加了40.42%、26.00%；第一限制氨基酸賴氨酸含量也在發(fā)芽72 h達(dá)到最大值，由未發(fā)芽的0.129 g/100 g增加到0.157 g/100 g，增加了21.71%；而必需氨基酸在氨基酸總量中所占比重在48 h最大，占比37.24%。另外，谷氨酸是合成GABA的底物，對(duì)GABA含量有重要影響，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，谷氨酸含量顯著增加，在發(fā)芽60 h達(dá)到最大值1.423 g/100 g，增加了37.62%，之后有所下降，發(fā)芽至72 h含量降至1.311 g/100 g，這可能是限制 GABA 合成的因素之一[17]。其下降原因可能是發(fā)芽后期高粱呼吸強(qiáng)度增大，干物質(zhì)消耗量加劇，各種氨基酸消耗量增加[14]，這也是后期氨基酸總量下降的原因。綜上所述，發(fā)芽處理對(duì)改善高粱營養(yǎng)價(jià)值以及在食品中的應(yīng)用具有積極的意義。

2.3 高粱發(fā)芽過程中GABA含量和GAD活性的變化

GABA是一種非蛋白氨基酸，具有許多生理功效，主要是由谷氨酸脫羧反應(yīng)形成的[5]。由圖2可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，高粱中GABA 含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，60 h時(shí)GABA含量最高，從未發(fā)芽的4.005 mg/100 g增加到19.026 mg/100 g，增加到近5倍，與Yang等[18]的研究結(jié)果基本一致。高等植物 GABA 的合成主要由 GAD 和GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase，GABA-T）調(diào)控[19]。GAD是GABA合成的限速酶，對(duì)GABA的含量有直接影響。在發(fā)芽開始時(shí)，稻谷體內(nèi)的 GAD被激活，隨著時(shí)間的延長，GAD 活性開始增強(qiáng)，發(fā)芽至60 h時(shí)GAD活性最高，為8.139 U/100 g，在這個(gè)過程中GABA 開始大量生成、積累；GABA增加的另一個(gè)原因可能是發(fā)芽過程中由于高粱籽粒中的營養(yǎng)素溶于水后通過生化反應(yīng)發(fā)生降解，導(dǎo)致可溶性含氮化合物（如GABA）的積累[20]。發(fā)芽60 h后，GAD活性和GABA含量都有所下降，這是因?yàn)镚AD活性受谷氨酸的調(diào)節(jié)。GAD 定位于細(xì)胞質(zhì)中，其活性受細(xì)胞環(huán)境中Ca2+調(diào)節(jié)[21]， 而谷氨酸可以通過改變細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度來影響GAD活性[22]，因此谷氨酸含量的變化會(huì)對(duì)GAD活性產(chǎn)生一定影響。結(jié)合表1可知，隨著發(fā)芽時(shí)間延長，谷氨酸含量不斷增加，GAD活性增加；60 h后谷氨酸含量有所下降，GAD活性降低。谷氨酸含量的下降使得以其為底物形成的GABA含量也有所下降。另外，60 h后GABA含量下降也可能是因?yàn)镚ABA被GABA-T催化轉(zhuǎn)換為琥珀酸半醛進(jìn)入三羧酸循環(huán)[23]。

圖2 高粱發(fā)芽過程中GABA含量和GAD活性的變化Fig.2 Changes in GABA content and GAD activity of sorghum during germination

表1 發(fā)芽高粱氨基酸含量變化Table 1 Changes in amino acid content of germinated sorghum

2.4 高粱發(fā)芽過程中單寧含量的變化

單寧，可與蛋白質(zhì)作用生成難消化的高分子沉淀物質(zhì)，具有較強(qiáng)的苦澀味[24]；過量攝入單寧會(huì)使消化酶活力降低，從而影響人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化率和生物價(jià)[25]；同時(shí)會(huì)影響脂肪酶、胰蛋白酶以及α-糖化酶等的功能作用[26]。如圖2所示，發(fā)芽處理后高粱中單寧含量顯著（P＜0.05）下降，發(fā)芽至72 h，單寧含量從1.07%降到0.14%，下降了86.92%。這與Claver等[27]的研究結(jié)果一致。高粱單寧可溶于水，浸泡（0 h）處理使單寧部分?jǐn)U散到水中，含量有所下降；發(fā)芽過程中，單寧含量繼續(xù)下降，這可能與高粱中醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，發(fā)芽處理后，醇溶蛋白表面可能已經(jīng)暴露出新位點(diǎn)，可促進(jìn)單寧與醇溶蛋白單體之間的相互作用[28]；除此之外，單寧屬于多酚類化合物，其含量降低可能是發(fā)芽過程中多酚氧化酶活性增加所致[29]。

2.5 高粱發(fā)芽過程中植酸含量和植酸酶活性的變化

植酸，化學(xué)名為肌醇六磷酸酯，是谷類、豆類中磷的主要存在形式，可與Zn2+、Ca2+、Fe2+等多種礦物質(zhì)元素結(jié)合形成難溶性的植酸鹽絡(luò)合物，從而很難被人體吸收[2]；還可與蛋白質(zhì)生成復(fù)合物，影響蛋白質(zhì)的生理功能，或與酶結(jié)合，抑制其活性[30]。因此被看作是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。由圖3可知，浸泡（發(fā)芽0 h）處理后，植酸含量下降幅度較大，這可能是因?yàn)榻葸^程中植酸擴(kuò)散到浸泡介質(zhì)中[29]；隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，植酸含量持續(xù)下降，從94.85 mg/100 g下降到52.44 mg/100 g，下降了44.71%。這是因?yàn)楫?dāng)種子吸水開始發(fā)芽后，植酸酶活性被激發(fā)，植酸鹽水解并釋放出無機(jī)磷以供作物生長；隨著發(fā)芽時(shí)間延長，植酸酶活性不斷增加，由未發(fā)芽的28.88 U/g增加到36.52 U/g，這與丁俊胄等[31]對(duì)發(fā)芽糙米的研究結(jié)果相似。

圖3 高粱發(fā)芽過程中單寧含量的變化Fig.3 Changes in tannin content of sorghum during germination

3 結(jié)論

圖4 高粱發(fā)芽過程中植酸含量和植酸酶活性的變化Fig.4 Changes of phytic acid content and phytase activity of sorghum during germination

本研究探討了發(fā)芽過程中高粱營養(yǎng)成分以及抗?fàn)I養(yǎng)因子的變化規(guī)律，結(jié)果表明：隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，氨基酸總量顯著增加，60 h達(dá)到最大值，各種氨基酸含量均有不同程度的增加（P＜0.05），其中第一限制氨基酸賴氨酸含量增加了21.71%；GAD酶活性和GABA含量均比未發(fā)芽時(shí)顯著增加（P＜0.05），發(fā)芽至60 h GAD酶活性最強(qiáng)，GABA含量最高；植酸酶活性增強(qiáng)，單寧和植酸含量在發(fā)芽過程中始終呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）。綜上所述，發(fā)芽在一定程度上能夠提高高粱的營養(yǎng)價(jià)值，可為今后高粱在食品中的應(yīng)用提供參考。

目前我們國家對(duì)于發(fā)芽高粱的研究并不多見，且發(fā)芽后高粱中GABA含量盡管有很大程度的增長，但總量依然不高。因此，后續(xù)的研究可在發(fā)芽基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其他富集工藝對(duì)高粱GABA含量的影響，以進(jìn)一步提高高粱中GABA含量，為開發(fā)富含GABA的發(fā)芽高粱食品提供理論基礎(chǔ)。