不同方式制備的猴頭菇提取物對大鼠急性胃黏膜損傷保護(hù)作用對比

安苗青，賴玉健，徐雅囡，杜 冰,2，黎 攀,2,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室，廣東廣州 510642）

隨著人們生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增大，近年來胃黏膜損傷的發(fā)病概率逐漸呈上升趨勢，這種損傷可能會導(dǎo)致胃黏膜侵襲、出血甚至潰瘍。胃腔內(nèi)部炎癥微環(huán)境的形成會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞被激活，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子如白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子（TNF-α），進(jìn)一步激活某些信號通路，加速炎癥反應(yīng)，會阻礙胃黏膜的再生和修復(fù)最終導(dǎo)致胃潰瘍[1?2]，這種以胃粘膜潰瘍、炎性細(xì)胞浸潤和壞死為特征的胃潰瘍影響著大約10%的世界人口，成為一種普遍的消化系統(tǒng)疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，胃粘膜損傷與活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生有關(guān)，如自由基、過氧化物和氧離子[4]。胃粘膜中活性氧生成的增加引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)以及白細(xì)胞的聚集和活化[5]。目前對于胃潰瘍治療的藥物主要作用有抑酸藥、H2受體拮抗劑以及質(zhì)子泵抑制劑等，但現(xiàn)有臨床常用治療藥物副作用較多，不宜長期服用。因此，猴頭菇作為新型藥食兩用的功能性原料具有巨大的研究價值[6?7]。

猴頭菇（Hericium erinaceus）是食藥兼用的大型真菌，隸屬擔(dān)子菌綱多孔菌目齒菌科猴頭屬[8]。猴頭菇營養(yǎng)價值很高，富含蛋白、多糖、膳食纖維，必需氨基酸、酚類化合物和微量營養(yǎng)素等[9]。根據(jù)《本草綱目》和《中華本草》記載，猴頭菌性平、味甘，有“利五臟、助消化”的功能[10?11]?，F(xiàn)代研究表明：猴頭菇提取物具有抗炎、改善胃粘膜損傷的作用，其中，多糖是猴頭菇主要的活性物質(zhì)之一，其主要是從優(yōu)質(zhì)猴頭菇子實體中提取的有效活性成分，孫紅斌等[12?14]的研究結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基的C/N為26時，猴頭菌多糖產(chǎn)量最高，且在培養(yǎng)期間胞外多糖含量一直呈現(xiàn)上升趨勢。詹雪[15]通過分離純化將得到的多糖作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞，其研究結(jié)果顯示，猴頭菇多糖對SGC-7901細(xì)胞的增殖有抑制作用，且具有時間和濃度的依賴性，表明猴頭菇多糖可以抑制細(xì)胞遷移，具有抗胃癌的效果；然而胡文繼等[16]的研究表明，由猴頭菌菌絲體中提取的粗多糖不僅可以提高阿爾茨海默癥小鼠血液和腦中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，而且還能抑制活性氧（ROS）的增加，從而改善阿爾茨海默癥小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)。此外Liu等[17]通過體外細(xì)胞實驗研究，表明猴頭菇子實體多糖顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）的生長；Ali等[18]的研究結(jié)果表明猴頭菇菌絲體多糖通過減少血液和組織的氧化損傷，對結(jié)腸炎有積極的治療作用。綜上所述，關(guān)于猴頭菇子實體多糖和絲體多糖的研究已有廣泛報道；而液態(tài)深層發(fā)酵不僅可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，還可以在短時間內(nèi)獲得大量的菌絲體及其多糖代謝產(chǎn)物，但關(guān)于液態(tài)深層發(fā)酵提取猴頭菇多糖的相關(guān)研究卻鮮有報道，故對比以不同方式制備的猴頭菇提取物對乙醇誘導(dǎo)的急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用的相關(guān)研究具有一定的積極意義。

本文以不同部位不同方式制備的猴頭菇粗提物為原料，以無水乙醇誘導(dǎo)的急性胃粘膜損傷大鼠為模型，通過觀測不同實驗組大鼠的胃部胃黏膜切片、血清炎癥因子、胃組織炎癥因子和血清抗氧化指標(biāo)來對比不同部位猴頭菇以不同方式提取的粗提物對大鼠胃黏膜的保護(hù)作用，研究結(jié)果為改善胃黏膜功能健康產(chǎn)品提供了數(shù)據(jù)支持，不僅可以對醫(yī)藥和食品行業(yè)發(fā)展起到積極的作用，而且對人類健康做出有利貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

雌性SPF級SD大鼠 84只，體重為180~220 g，實驗動物使用許可證編號為SYXK（粵）2019-0136，普通飼料，廣東省醫(yī)學(xué)動物中心；猴頭菇菌絲體多糖粗提物、猴頭菇子實體多糖粗提物、猴頭菇水提粗提物 無限極（中國）有限公司；液態(tài)發(fā)酵水提粗提物由實驗室制備；枸櫞酸鉍鉀顆粒 河南九勢制藥股份有限公司；無水乙醇、苯酚、無水硫酸銅、濃硫酸廣州齊湘生物科技有限公司；10%甲醛、蘇木素伊紅染液、二甲苯、石蠟、ELISA試劑盒檢測、SOD、MDA、GSH等檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

全自動凱氏定氮儀 廣州格丹納儀器有限公司；體視解剖顯微鏡 北京上光儀器有限公司；游標(biāo)卡尺 寧波旗辰儀器有限公司；Tissue-Tek VIP?6 AI全封閉組織脫水機 上海聚慕器械有限公司；HistoStar 組織包埋機 杭州柏奧谷科技有限公司；HM340E 石蠟切片機 深圳市東測科技有限公司；Slimline Hotplate 烘片機 上海倍曼生物科技有限公司；GeminiAS自動染片機 廣州鴻琪光學(xué)儀器有限公司；CTM 6自動封片機 鄭州中普器械有限公司；ZEISS Lab. A1顯微鏡 東莞市三本精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液態(tài)發(fā)酵水提物的制備方法 取液態(tài)發(fā)酵猴頭菇菌絲體，加入20倍的水在90 ℃水浴提取3 h，4000 r/min離心10 min，取上清液，于60 ℃下減壓濃縮，過濾，取濾液加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜。抽濾，沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌，加水溶解。于?80 ℃真空冷凍干燥72 h，得猴頭菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體水提粗提物。

1.2.2 基本理化性質(zhì)測定 檢測指標(biāo)主要有多糖含量、蛋白質(zhì)含量及微量元素。其中，多糖含量檢測方法為苯酚硫酸法，方法參照參考文獻(xiàn)[19]略微改動；蛋白質(zhì)含量檢測方法為凱氏定氮法，方法參照國標(biāo)《GB 5009.5-2016食品中蛋白質(zhì)的測定》[20]；微量元素檢測方法為電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICPOES），方法參照參考文獻(xiàn)[21]略微改動。

1.2.3 大鼠急性胃黏膜損傷模型的建造 SD大鼠在屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)，實驗室室溫控制在：20~26 ℃，濕度控制在40%~70%。檢疫期結(jié)束后，將84只大鼠按體重隨機分為正常對照組（NC）、模型對照組（ETH）、猴頭菇子實體多糖粗提物干預(yù)組（WEH1）、猴頭菇菌絲體多糖粗提物干預(yù)組（WEH2）、猴頭菇水提粗提物干預(yù)組（WEH3）、液態(tài)發(fā)酵水提粗提物干預(yù)組（WEH4）及枸櫞酸鉍鉀顆粒藥物組（YWZ），共7組，每組12只。

每組動物給予普通飼料，不禁飲水，正常對照組和模型對照組直接給予蒸餾水，其他各劑量組每日灌胃給藥1次連續(xù)灌胃30 d，經(jīng)預(yù)試驗后確定依據(jù)大鼠體重變化調(diào)整樣品灌胃劑量（10 mL/kg）；猴頭菇子實體多糖粗提物，猴頭菇菌絲體多糖粗提物，猴頭菇水提粗提物，液態(tài)發(fā)酵水提粗提物給藥劑量均為167 mg/kg，枸櫞酸鉍鉀顆粒（0.24 g/kg，含鉍24.1 mg）。

灌胃30 d后，全部動物嚴(yán)格禁食24 h（不禁水），此期間亦禁止給予受試物。開始造模，除正常對照組外，所有試驗組動物給予無水乙醇5.0 mL/kg，1 h后脊椎脫臼法處死所有動物，腹主動脈采血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，吸取上清?20 ℃保存。

1.2.4 胃黏膜病理組織學(xué)觀察及評分 暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，展開胃粘膜，將每只動物胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位切下10 mm×2 mm的組織，固定于10%甲醛溶液，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察。注意選擇胃粘膜正橫切面，包括粘膜全層的區(qū)域觀察。評分方法：以充血、出血、粘膜細(xì)胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分為5級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3，根據(jù)表1評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[22]。

表1 急性胃粘膜損傷鏡下評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Microscopic scoring criteria for acute gastric mucosal injury

1.2.5 大鼠血清中抗氧化指標(biāo)的測定 吸取血清按照試劑盒說明方法進(jìn)行操作，測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。

1.2.6 用ELISA法檢測大鼠血清及胃黏膜組織炎癥因子水平 造模結(jié)束后，取大鼠胃部組織，去水稱量剪碎后放入預(yù)冷的10%生理鹽水中，均質(zhì)，靜置30 min后，2000 r/min離心10 min，?20 ℃儲藏，備用。吸取上層血清和胃組織勻漿上清液按照ELISA試劑盒說明操作，在酶標(biāo)儀450 nm下測定吸光度，測定血清及胃組織炎癥因子指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗中使用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用GraphPad8.0.2進(jìn)行作圖；數(shù)據(jù)用方差分析，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同提取方式制備的猴頭菇提取物的基本成分分析

由表2可以得出，猴頭菇中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，多糖是猴頭菇中主要的營養(yǎng)成分，除此之外還含有較高含量的蛋白質(zhì)和微量元素，但其中猴頭菇液態(tài)發(fā)酵水提粗提物、猴頭菇子實體多糖粗提物和猴頭菇菌絲體多糖粗提物中多糖含量差別較大，猴頭菇菌絲體多糖粗提物和猴頭菇水提粗提物的多糖含量較高，其原因可能與多糖提取方式以及提取部位的不同有關(guān)。而猴頭菇多糖作為猴頭菌中主要功效成分，有大量研究數(shù)據(jù)表明其具有顯著的抗炎[15]，治療胃潰瘍[23]、胃炎的功效[24]，而其中的其他成分未有其相應(yīng)功效。

表2 幾種猴頭菇提取物基本成分分析Table 2 Analysis of the basic components of several Hericium erinaceus extracts

2.2 胃黏膜切片分析及病理組織評分情況

如圖1B所示，模型組大鼠胃黏膜腺管充血水腫，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤，具有明顯的細(xì)胞破損現(xiàn)象。這與張曉風(fēng)等[25]用75%酒精灌胃大鼠造模的結(jié)果一致，經(jīng)過乙醇灌胃，能夠致使胃黏膜遭受大范圍損傷，表明急性胃黏膜損傷模型構(gòu)造成功。經(jīng)過猴頭菇子實體多糖粗提物、猴頭菇菌絲體多糖粗提物、猴頭菇水提粗提物、液態(tài)發(fā)酵猴頭菇粗提物及藥物組預(yù)先給藥后，正常組大鼠胃粘膜組織腺體結(jié)構(gòu)整齊，未見有上皮細(xì)胞脫落和胃粘膜充血現(xiàn)象，與之相比，模型組大鼠胃粘膜組織腺體紊亂、腺管充血，有炎細(xì)胞浸潤，具有明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象；與模型組相比，WEH1組胃粘膜組織有較明顯的細(xì)胞脫落、破損現(xiàn)象；WEH2組胃粘膜組織有輕微的細(xì)胞破損現(xiàn)象；WEH3胃粘膜組織有較明顯的腺管充血、出血和輕微的細(xì)胞脫落現(xiàn)象；WEH4胃粘膜組織切片與正常組組織切片結(jié)果相似，表現(xiàn)為腺體排列整齊，未有充血、細(xì)胞脫落、破損現(xiàn)象，這與毛湘君芝[26]研究結(jié)果類似。說明這幾種不同方式制備的猴頭菇粗提物對急性胃粘膜損傷均具有不同程度的保護(hù)作用，其中液態(tài)發(fā)酵猴頭菇多糖粗取物的保護(hù)效果最佳，猴頭菇菌絲體多糖粗提物保護(hù)效果次之，雖效果不及臨床藥物效果，但能夠緩解胃粘膜的急性損傷。這可能是由于液態(tài)發(fā)酵猴頭菇提取物中某些微量成分的協(xié)同作用。

圖1 胃黏膜切片及病理組織評分Fig.1 Gastric mucosa section and pathological score

病理組織評分如圖1H所示，病理組織切片結(jié)果，以充血、出血、粘膜細(xì)胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分級進(jìn)行評分，相比于NC正常組，ETH模型組病變總積分明顯升高，說明乙醇對胃粘膜的損傷比較嚴(yán)重，經(jīng)過WEH1、WEH2、WEH3、WEH4及YWZ藥物組預(yù)先給藥后，病變積分顯著下降，與模型組相比具有顯著性差異（P<0.05,P<0.01），且WEH2呈現(xiàn)極顯著性差異（P<0.01）。說明它們對胃粘膜具有保護(hù)作用，能夠減輕乙醇對胃粘膜的損傷。

2.3 抗氧化指標(biāo)及炎癥因子的測定

2.3.1 血清抗氧化指標(biāo)的測定結(jié)果 胃粘膜受到酒精刺激時，會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)生成大量的氧自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷。當(dāng)機體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡時，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎癥浸潤，形成炎癥[27]，所以可以通過測定血清抗氧化指標(biāo)間接反映機體內(nèi)部的炎癥反應(yīng)。SOD和GSH是自由基清除酶，其表達(dá)量的增加可減輕胃黏膜損傷，是胃粘膜保護(hù)因子。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化防御體系之一[28]。它的存在可以間接控制MDA的含量，使二者之間達(dá)到相對平衡的狀態(tài)。MDA是過氧化產(chǎn)物，可間接反應(yīng)機體代謝清除自由基的能力，是評價機體脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)[29]，因此可以通過檢測大鼠血清中SOD、GSH的活性以及MDA的含量來間接反映胃粘膜細(xì)胞損傷的程度。如圖2所示，經(jīng)乙醇灌胃可顯著降低SD大鼠SOD活性及GSH水平（P<0.05），而猴頭菇粗提物干預(yù)后，大鼠SOD活性及GSH水平被顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05），說明猴頭菇提取物對乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷具有一定的保護(hù)作用。如圖2A所示，與NC正常組相比，ETH模型組MDA含量顯著升高（P<0.05），而WEH1、WEH2、WEH3、WEH4各組MDA含量均低于ETH組，但影響不明顯。這可能是由于高濃度乙醇導(dǎo)致大鼠的是急性胃粘膜損傷，在較短時間內(nèi)作用不能引起顯著差異，這與之前魏巍等[30]研究結(jié)果相一致。所以推測：不同猴頭菇粗提物是通過使SOD及GSH水平降低和MDA的升高，從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜損傷的作用。

圖2 血清抗氧化指標(biāo)測定Fig.2 Determination of serum antioxidant indexes

2.3.2 炎癥因子檢測結(jié)果 TNF-α?xí)r炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早、最重要的介質(zhì)。TNF-α的顯著升高會誘導(dǎo)IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的大量分泌，而IL-6是炎癥反應(yīng)的催化劑，可以促進(jìn)其他炎癥因子的表達(dá)，增強局部炎癥反應(yīng)[31?32]。圖3是血清和胃組織中炎癥因子的表達(dá)量，由圖3可知，與NC正常組相比，ETH模型組中SD大鼠血清和胃組織中的TNF-α、IL-6、IL-1β水平表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。表明乙醇灌胃大鼠會導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)量增加，使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；當(dāng)經(jīng)過WEH1、WEH2、WEH3、WEH4等猴頭菇粗提物的干預(yù)，其藥物組中SD大鼠血清和胃組織中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均表達(dá)量均呈下降趨勢，其中WEH2的下降趨勢更加明顯，表明猴頭菇菌絲體多糖粗提物中主要成分通過抑制炎癥因子的釋放發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用。

圖3 炎癥因子表達(dá)量測定Fig.3 Determination of expression of inflammatory cytokines

2.3.3 猴頭菇提取物與大鼠抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)性分析 猴頭菇提取物組成成分與大鼠抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)性分析如圖4所示，猴頭菇提取物中多糖是影響大鼠抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的主要成分，其對血清中MDA含量和IL-1β的表達(dá)量以及對胃黏膜中TNF-α和IL-1β的表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；鐵、鋅、硒等微量成分與猴頭菇多糖對抗氧化和炎癥因子的調(diào)節(jié)具有協(xié)同作用；然而猴頭菇提取物中的蛋白質(zhì)對抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)性與多糖對其相關(guān)性相反，所以猴頭菇中蛋白質(zhì)分子的相關(guān)研究仍需進(jìn)一步的探索。故根據(jù)其相關(guān)性分析結(jié)果和上述研究結(jié)果表明，猴頭菇多糖能夠減輕乙醇誘導(dǎo)的急性胃黏膜損傷，提高機體抗氧化能力，減輕炎癥反應(yīng)。

圖4 猴頭菇提取物與抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of Hericium erinaceus extract with antioxidant indexes and inflammatory factors

3 結(jié)論

本實驗通過給大鼠灌喂無水乙醇建立胃黏膜損傷模型，探究了不同方式制備的猴頭菇粗提物對大鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，經(jīng)過高濃度乙醇刺激，模型組大鼠血清和胃粘膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞因子表達(dá)量呈顯著性升高（P<0.05），同時胃粘膜組織切片顯示其腺管充血，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，具有明顯的破損，甚至細(xì)胞脫落；血清中MDA含量顯著升高(P<0.05) ，SOD和GSH活性降低，但經(jīng)過猴頭菇粗提物預(yù)先干預(yù)后，血清和胃粘膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子表達(dá)量顯著降低，且血清中藥物組MDA含量均低于ETH組，SOD和GSH活性顯著性升高(P<0.05) 。猴頭菇提取物中多糖是影響大鼠抗氧化指標(biāo)和炎癥因子的主要成分，其對血清中MDA含量和IL-1β的表達(dá)量以及對胃黏膜中TNF-α和IL-1β的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05) ，其中猴頭菇菌絲體多糖粗提物中多糖含量最高，且對胃黏膜損傷的保護(hù)效果最佳。

綜上所述，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致急性胃黏膜損傷的重要原因，不同猴頭菇粗提物均能有效減輕乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性胃粘膜損傷，提高抗氧化活性，改善炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用。綜合四組受試物對炎癥因子的表達(dá)量和抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，猴頭菇菌絲體多糖對于減輕乙醇胃粘膜的損傷效果最佳。該研究將為急性胃黏膜損傷的功能性產(chǎn)品開發(fā)提供研究基礎(chǔ)和新的思路。