結(jié)腸癌中TMCO1、CALR的表達(dá)及對(duì)轉(zhuǎn)移的影響

齊順利，趙團(tuán)結(jié)，于曉倩，孫 平，劉紅剛

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，結(jié)直腸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌和肺癌，位居第3位，其病死率僅次于肺癌，位居第2位，且結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。雖然近年來(lái)臨床獲得大量防治結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的研究成果，但尋找特異性治療靶點(diǎn)仍是防治轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

跨膜和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域1(transmembrane and coiled-coil domains 1, TMCO1)是一種新型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道蛋白，其基因的缺失或蛋白表達(dá)異常將會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡和信號(hào)異常，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3-4]。鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CALR)是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中高度進(jìn)化保守的鈣結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞的各種生理和病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，CALR表達(dá)與不同類型腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-6]。目前，TMCO1、CALR在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)人結(jié)腸癌組織標(biāo)本和細(xì)胞模型，闡述TMCO1和CALR在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平，以及明確TMCO1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，為尋找新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2021年1月北京市肛腸醫(yī)院存檔的59例低～中分化結(jié)腸癌根治術(shù)標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本?；颊咝g(shù)前均未接受中醫(yī)治療、新輔助化療以及生物靶向等治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)北京市肛腸醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞與試劑結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自上海中喬新舟公司，TMCO1抗體購(gòu)自武漢華美公司，CALR抗體購(gòu)自武漢三鷹公司，N-cadherin、E-cadherin、β-actin抗體均購(gòu)自北京博奧森公司，Lipofectamine 3000購(gòu)自賽默飛世爾公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素溶液均購(gòu)自GIBCO公司，Transwell小室購(gòu)自Corning公司，vimentin、熒光二抗、免疫組化二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司，1%結(jié)晶紫染液購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 結(jié)腸癌和癌旁組織常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟至水，EDTA(pH 8.0)抗原修復(fù)，滴加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，滴加二抗工作液，37 ℃孵育1 h，PBS震蕩清洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、封片，400倍光鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測(cè)量TMCO1、CALR陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度(A)值，以間接反映TMCO1、CALR蛋白表達(dá)量，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 配置細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含10%FBS、1%雙抗、DMEM高糖)，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種于6孔板，將細(xì)胞分為對(duì)照組、Lip 3000組和TMCO1 siRNA組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，參照Lip 3000試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，TMCO1 siRNA序列(上游5′-GAGAUCUAUCAAUGGUUCG AATT-3′，下游5′-UUCGAACCAUUGAUAGAUCUCT T-3′)由上海生工公司合成。轉(zhuǎn)染48 h后收集所有分組細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)TMCO1 siRNA轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3免疫熒光 各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS漂洗3次，5%BSA封閉30 min，加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗3次，避光熒光二抗孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI核染5 min，封固后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4Western blot法 取各組細(xì)胞，PBS沖洗2次，加入500 μL細(xì)胞裂解液，吸至離心管中，12 000 r/min離心20 min后取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。100 ℃沸水浴5 min使蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗TMCO1(1 ∶500)、CALR(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃過(guò)夜，次日復(fù)溫1 h，加二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL暗室曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，灰度值=目的條帶/β-actin。

1.3.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每毫升2×105個(gè)細(xì)胞，每孔500 μL細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，用200 μL槍頭在培養(yǎng)板內(nèi)劃線，PBS清洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察并拍照，利用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.6Transwell檢測(cè) 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基重懸至細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)，將Transwell上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%血清的完全培養(yǎng)基，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦去上層細(xì)胞，隨機(jī)取中央及四周5個(gè)視野，倒置顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針檢測(cè) 去除細(xì)胞培養(yǎng)液，HBSS溶液洗滌，加入配置好的ER-Tracker Red工作液，37 ℃孵育15 min，細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次，10%中性福爾馬林37 ℃固定2 min，PBS清洗3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下封固并觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌和癌旁組織中TMCO1、CALR蛋白的表達(dá)結(jié)腸癌組織中TMCO1和CALR蛋白表達(dá)較癌旁組織增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.519、-7.256，P均<0.01，圖1)。

圖1 結(jié)腸癌和癌旁組織中TMCO1、CALR蛋白表達(dá)水平：與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2 Western blot法檢測(cè)TMCO1 siRNA干擾效果應(yīng)用Western blot法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞經(jīng)TMCO1 siRNA干擾后TMCO1蛋白表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，TMCO1 siRNA干擾組TMCO1蛋白表達(dá)水平顯著降低(F=232.118，P<0.001，圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)TMCO1 siRNA干擾效果

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMCO1對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響對(duì)照組、Lip 3000組和TMCO1 siRNA組0 h劃痕距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.176，P>0.05)。TMCO1 siRNA組48 h劃痕距離顯著長(zhǎng)于對(duì)照組和Lip 3000組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.307，P<0.01，圖3)。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMCO1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移能力的影響：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMCO1對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響TMCO1 siRNA組(44.67±6.51)穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組(190.33±16.56)和Lip 3000組(184.67±14.98)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.265，P<0.001，圖4)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMCO1對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 免疫熒光檢測(cè)HCT116細(xì)胞TMCO1、CALR蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組和Lip 3000組相比，TMCO1 siRNA組HCT116細(xì)胞TMCO1、CALR蛋白熒光強(qiáng)度顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=153.078、153.039，P均<0.001，圖5)。

圖5 免疫熒光檢測(cè)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中TMCO1、CALR蛋白表達(dá)水平：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.6 Western blot法檢測(cè)TMCO1對(duì)HCT116細(xì)胞CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TMCO1 siRNA組CALR、TMCO1、vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和Lip 3000組顯著降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.4396、69.806、170.146、58.713、283.747，P均<0.001，圖6)。

圖6 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞TMCO1、CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針檢測(cè)TMCO1對(duì)HCT116細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激水平的影響TMCO1siRNA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針熒光強(qiáng)度較對(duì)照組和Lip 3000組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.003，P<0.001，圖7)。

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲是導(dǎo)致我國(guó)結(jié)腸癌患者生存率低、病死率高的主要因素。所以，探索敏感性、特異性靶點(diǎn)成為防治結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

Ca2+作為細(xì)胞的第二信使，參與機(jī)體細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖和死亡、蛋白質(zhì)磷酸化、神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理活動(dòng)[7-8]。Ca2+濃度的異常升高可以激活癌細(xì)胞的活性，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。TMCO1作為一種新型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道蛋白，其基因缺失或蛋白表達(dá)異常將會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡和信號(hào)異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TMCO1能夠通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路抑制膀胱尿路上皮癌的增殖和遷移，表明TMCO1是新型的抑癌因子，抑制其蛋白表達(dá)可影響患者預(yù)后。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TMCO1可以促進(jìn)肺腺癌的侵襲和遷移，抑制TMCO1表達(dá)水平肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制。TMCO1表達(dá)可能在不同的腫瘤和癌細(xì)胞中具有不同的功能，這可能與腫瘤細(xì)胞類型特異性差異有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)干擾TMCO1表達(dá)，可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且我們推測(cè)其可能與CALR蛋白相關(guān)。

CALR蛋白在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。諸多研究表明，CALR在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌中表達(dá)顯著升高，其表達(dá)水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[12-14]。Harada等[15]報(bào)道CALR高表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者TNM分期、總生存率以及預(yù)后不良有關(guān)，CALR可作為衡量口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的重要標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人結(jié)腸癌組織中TMCO1、CALR蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，提示TMCO1、CALR高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMCO1對(duì)CALR表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)TMCO1 siRNA組中CALR表達(dá)顯著降低，提示TMCO1 siRNA抑制結(jié)腸癌侵襲和遷移過(guò)程與調(diào)控CALR表達(dá)水平相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TMCO1 siRNA可顯著降低探針強(qiáng)度，作者推測(cè)TMCO1可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)階段并未驗(yàn)證，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。此外，本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)干擾TMCO1表達(dá)后EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高。這提示，TMCO1的促癌作用可能與調(diào)控vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)有關(guān)。Chen等[11]的研究亦發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中抑制TMCO1表達(dá)，vimentin、N-cadherin表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高，從而導(dǎo)致遷移能力顯著降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中TMCO1、CALR蛋白表達(dá)水平顯著升高。干擾TMCO1表達(dá)后，HCT116細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低，其作用機(jī)制可能與CALR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激水平以及EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白顯著相關(guān)。