不同產(chǎn)地黑枸杞中總酚含量的比較研究

王海燕，何文彬，李際紅，李玉琴*

（1.泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東泰安 271016；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，山東泰安 271016；3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安 271000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科，枸杞屬，多棘灌木，是我國(guó)特有的沙漠藥用植物品種，主要分布于青海、新疆、甘肅，以及內(nèi)蒙古西部的河床和鹽堿地，具有極強(qiáng)的耐旱性[1]。其植株分枝很多且形態(tài)各異，或斜升或橫臥于地面，常成白色或灰白色并以之字形形態(tài)曲折；其漿果球形，成熟后為紫黑色，皮薄。據(jù)《晶珠本草》等藏藥經(jīng)典所載[2]，黑枸杞具有治療心臟病、降低血壓的作用，也因此有較高的市場(chǎng)價(jià)值?，F(xiàn)代中藥化學(xué)研究結(jié)果表明，黑枸杞中不僅含有多酚類（花色苷、原花青素等）、黃酮、生物堿、多糖等多種活性成分，還富含脂肪酸、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和錳、硒、鋅等微量元素。而藥效學(xué)研究表明，黑枸杞中的多酚類物質(zhì)具有很高的抗氧化能力，能高效清除自由基，進(jìn)而保護(hù)心腦血管、降低血壓、延緩衰老、提高人體免疫能力，同時(shí)也在抗腫瘤方面具有一定的效果[3]。目前，黑枸杞的質(zhì)量沒有統(tǒng)一的評(píng)價(jià)方法。張旭[4]建立了黑枸杞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以總花色苷和原花青素為指標(biāo)，結(jié)合甜菜堿和多糖的含量評(píng)價(jià)黑枸杞的質(zhì)量；還有以花色苷為指標(biāo)的HPLC 法[5]、以綠原酸為指標(biāo)的 UHPLC-MS/MS[6]和差分脈沖伏安法[7]，以及以總酚為指標(biāo)的福林-酚比色法[8]。而黑枸杞中含有較高的花色苷、原花青素等多酚類物質(zhì)，其抗氧化能力也多來自于其中所含的多酚類物質(zhì)。黑枸杞中的多酚類物質(zhì)受各種因素的影響，尤其是產(chǎn)地。

基于此，本實(shí)驗(yàn)采用福林-酚比色法對(duì)青海柴達(dá)木、寧夏中寧和甘肅張掖產(chǎn)黑枸杞中總酚的含量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而探討不同產(chǎn)地黑枸杞中總酚成分含量的差異及其成因。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）、水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）、pH 計(jì)、電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司 FA224 型）、粉碎機(jī)（青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司）、KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥材

黑枸杞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李際紅教授自甘肅張掖、青海柴達(dá)木、寧夏中寧產(chǎn)地采收，并進(jìn)行鑒定。沒食子酸對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司）、福林酚試劑（上海索萊寶生物科技有限公司），其他試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

沒食子酸對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL）：精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇配制成 25 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于 4 ℃冰箱備用。

1.4 供試品溶液的制備

黑枸杞粉碎，精密稱取 1.0 g，加 150 mL 甲醇，加熱回流，2 h/次，提取 2 次，減壓濃縮后，用甲醇定容至 25 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 總酚含量測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物，采用福林-酚比色法測(cè)定[4]。酚類化合物中的酚羥基與福林酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。用該法測(cè)總酚含量簡(jiǎn)便快捷、穩(wěn)定性好，但測(cè)定結(jié)果受顯色試劑、顯色溫度的影響較大，因此對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 15% Na2CO3用量確定

Na2CO3用量不足會(huì)導(dǎo)致體系顯色不完全，使測(cè)定結(jié)果偏低。取 5 份 0.25mL 沒食子酸對(duì)照品溶液，加入福林酚試劑 0.25 mL，搖勻，分別加入 0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5mL的 15% Na2CO3溶液，混勻后加水定容至 10 mL，常溫下反應(yīng) 2 h 后，在 760 nm 處測(cè)定吸光度。15% Na2CO3對(duì)顯色體系的影響見圖1。如圖1 所示，當(dāng) 15% Na2CO3溶液與福林酚的體積比為2 : 1 時(shí)，吸光度達(dá)到最大值并趨于平緩，顯色完全。

Fig.1 The effect of 15% Na2CO3 dosage on color system圖1 15% Na2CO3 用量對(duì)顯色體系的影響

2.1.2 福林酚用量確定

福林酚與多酚在堿性條件下呈藍(lán)色，因此福林酚的用量也影響顯色體系是否反應(yīng)完全。取 5份 0.25 mL 沒食子酸對(duì)照品溶液，分別加入 0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1 mL 福林酚試劑，混勻，再加入 0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL 的 15% Na2CO3，混勻后加水定容至 10 mL。常溫下反應(yīng) 2 h 后，在 760 nm 處測(cè)定吸光度。福林酚用量對(duì)顯色體系的影響見圖2，如圖所示，當(dāng)福林酚用量是反應(yīng)液的 2 倍時(shí)，顯色完全。

Fig.2 The effect of Folin-phenol dosage on color system圖2 福林酚用量對(duì)顯色體系的影響

2.1.3 顯色時(shí)間與顯色溫度確定

溫度的高低會(huì)影響多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性。不同樣品中含有的酚類物質(zhì)種類和數(shù)目不同，受溫度影響也不同，因此顯色時(shí)間和顯色溫度針對(duì)樣品溶液進(jìn)行。取 0.1 mL 黑枸杞提取物 5 份于 25 mL量瓶中，加入 0.2 mL 福林酚試劑，混勻，再加入 0.4 mL15% Na2CO3，混勻，加水定容至刻度，分別置于 5 ℃、15 ℃、25 ℃、50 ℃、75 ℃水浴中，每 10 min 中將顯色液在 760 nm 處測(cè)定。溫度和時(shí)間對(duì)顯色體系的影響見圖3。如圖3 所示，在 75 ℃ 水浴中，反應(yīng) 10 min 后顯色完全。

Fig.3 The effect of different temperatures and time on color system圖3 不同溫度和時(shí)間對(duì)顯色體系的影響

綜上所述，反應(yīng)的最佳條件為：福林酚試劑為反應(yīng)液的 2 倍（體積比），15% Na2CO3溶液為福林酚的 2 倍（體積比），顯色溫度為 75 ℃，顯色時(shí)間 10 min。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍

按表1 所示的方法制備繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的沒食子酸工作液，于按最佳條件顯色后，以響應(yīng)試劑為空白，在 760 nm 處測(cè)定吸光度，以吸光度值 A 為縱坐標(biāo)，濃度 c（μg/mL）為橫坐標(biāo)，擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.1468x + 0.0846（R2= 0.9992），在 0.5～2.5 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

Table 1 Preparation method of the work solutions for drawing gallic acid standard curve表1 繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的制備方法

2.2.2 精密度考察

精密量取沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.15 mL，以表1 所示的方法，進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值 A，平行測(cè)定 5 份，其吸光度值 A 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.8%，說明該方法有較高的精密度。

2.2.3 樣品顯色液穩(wěn)定性考察

本研究測(cè)定總酚含量的方法為福林酚比色法，是通過顏色變化來反映樣品中各物質(zhì)的含量。因此，本研究考察了各顯色體系的穩(wěn)定性。以青海黑枸杞為例，按表1 所示的方法進(jìn)行反應(yīng)，30 min 內(nèi)每隔 5 min 測(cè)定一次吸光度值，吸光度值的 RSD為0.7%，因此在顯色完成后 30 min內(nèi)測(cè)定為宜。

2.2.4 加樣回收率考察

以青海黑枸杞為例，進(jìn)行加樣回收率考察。分別精密量取按“1.4”法制備的同一濃度（相當(dāng)于 100%）的柴達(dá)木黑枸杞供試品溶液適量，平行 9 份，分為 3 組，按表2 所示的方法，在供試品溶液中分別精密加入低、中、高3 種不同濃度的對(duì)照品溶液，每種濃度分別平行制備 3 份，用 9 份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。由表2 可得，回收率在 98.20～101.4% 范圍內(nèi)，表明方法準(zhǔn)確、可行。

Table 2 The recovery results of Chaidamu Lycium ruthenicum in Qinghai表2 青海柴達(dá)木黑枸杞回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 含量測(cè)定

精密量取樣品溶液 50 μL，按最佳條件顯色后，760 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚含量，結(jié)果如表3 所示。

Table 3 Total phenolic contents of Lycium ruthenicum from the different habitats表3 不同產(chǎn)地黑枸杞中總酚含量（n = 3）

由測(cè)定結(jié)果可知，青海柴達(dá)木產(chǎn)黑枸杞中總酚含量最高，達(dá)到了 17.40 mg/g，甘肅張掖次之，為 15.02 mg/g，寧夏中寧居末，只有 13.49 mg/g。

2.4 總酚含量差異和產(chǎn)地地理?xiàng)l件的關(guān)系討論

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，三種產(chǎn)地不同的黑枸杞之間總酚含量表現(xiàn)出了明顯差異，那么差異從何而來，供試品品質(zhì)和產(chǎn)地的地理因素之間有何必然聯(lián)系？因此，我們從青海柴達(dá)木盆地、甘肅張掖和寧夏中寧三個(gè)產(chǎn)地的地理環(huán)境入手進(jìn)行比較，希望可以從比較中發(fā)現(xiàn)適宜黑枸杞生長(zhǎng)的最佳環(huán)境條件。

2.4.1 柴達(dá)木盆地

柴達(dá)木地處青海省西北部，是一個(gè)被昆侖山、阿爾金山、祁連山等山脈環(huán)抱的封閉盆地，海拔 2 829～5 655 m，具有典型的高原大陸性氣候，年均氣溫 5 ℃ 以下，氣溫變化劇烈，絕對(duì)年溫差可達(dá) 60 ℃以上，日溫差也常在 30 ℃ 左右。以干旱為主，年降水量在 200 mm 以下，年均相對(duì)濕度極低。主要自然景觀為干旱荒漠，土壤條件差，多鹽化荒漠土，植被分布也很稀疏，加之區(qū)域內(nèi)常流河僅有十條，故而植被多以鹽生植物和高抗旱能力的灌木為主。

2.4.2 甘肅張掖

張掖位于甘肅省西部，河西走廊中段，海拔 1 200～5 565 m，屬冷溫帶干旱和祁連山高寒帶半干旱半濕潤(rùn)兩種氣候類型，其特點(diǎn)是夏季短而酷熱，冬季長(zhǎng)而嚴(yán)寒，年平均氣溫 4.1～8.3 ℃，平均為 6.6 ℃，晝夜溫差大。干旱少雨，且降水分布不均，年平均降水量 131 mm。張掖有黑河貫穿全境灌溉，地勢(shì)平坦，土壤肥沃，物產(chǎn)豐饒，形成了特有的沙漠綠洲景觀。

2.4.3 寧夏中寧

中寧縣位于寧夏回族自治區(qū)中部，寧夏平原之南端，地處黃河兩岸，是黃土高原和內(nèi)蒙古高原的過渡帶，海拔 1 100～2 955 m，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫 9.5 ℃，年降水量 202 mm，年蒸發(fā)量 1 947.1 mm，較為干旱。此地土壤礦物質(zhì)含量豐富，腐殖質(zhì)多，熟化度高，可以引黃河灌溉，四面環(huán)山，光照充足，有效積溫也很高，為枸杞生長(zhǎng)提供了優(yōu)越的自然條件，是我國(guó)枸杞的主要產(chǎn)區(qū)。

基于三個(gè)黑枸杞主要產(chǎn)地的地理環(huán)境，其共同點(diǎn)為氣溫較低，年氣溫溫差較大，氣候干燥，較為干旱但又有水源灌溉。不同點(diǎn)為青海柴達(dá)木地區(qū)的氣候環(huán)境較于其他兩地最為惡劣，全年降水極低，土壤鹽堿化程度高，灌溉水源也十分稀少，日溫差極大，氣候較為寒冷；其他兩地雖然干旱但灌溉水源充足，尤其寧夏地區(qū)降水更多，日溫差遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于柴達(dá)木地區(qū)。綜合上述分析，本文推想黑枸杞最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境為高海拔地區(qū)，全年氣溫較低，晝夜溫差以及年溫差都很大，氣候干燥，降水量和灌溉水都很少，土壤鹽堿化程度高并偏向沙質(zhì)土。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用福林-酚比色法測(cè)定了不同產(chǎn)地黑枸杞中總酚的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黑枸杞中總酚的含量不同，且青海柴達(dá)木產(chǎn)黑枸杞的總酚的含量最高為 17.40 mg/g，甘肅張掖產(chǎn)黑枸杞次之，為 15.02 mg/g，寧夏中寧黑枸杞最低，為 13.49mg/g。并根據(jù)測(cè)定結(jié)果，推測(cè)黑枸杞最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境應(yīng)當(dāng)具備高海拔、全年氣溫較低、晝夜溫差以及年溫差較大、氣候干燥、降水量和灌溉水較少、土壤鹽堿化程度高并偏向沙質(zhì)土。該結(jié)果可為合理有效的種植和使用黑枸杞提供了良好的理論指導(dǎo)。