樂伐替尼脂質(zhì)體的制備及處方工藝優(yōu)化研究

周艷艷，朱柯武，沈潤溥，袁喜英，駱 翔*

（1.紹興文理學(xué)院，浙江 紹興，312000；2.浙江創(chuàng)新生物有限公司，浙江 紹興，312000）

全球范圍內(nèi)，肝癌的死亡率在所有惡性腫瘤中排在第二位[1-2]，而晚期肝癌的愈后效果尤其不好[3]。因此，開發(fā)一種肝癌靶向藥物，尤其是針對(duì)晚期肝癌的靶向藥物具有重大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

Fig.1 The structure of Lenvatinib圖1 樂伐替尼化學(xué)結(jié)構(gòu)式

樂伐替尼（Lenvatinib，Len）（圖1）是一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，可作用于血管內(nèi)皮生長因子受體 1～3 型（VEGFR 1～3）、成纖維細(xì)胞生長因子受體 1～4 型（FGFR 1～4）、RET、KIT以及血小板衍生生長因子受體 α（PDGFR-α）等產(chǎn)生新生血管抑制和抗腫瘤作用[4-5]。2015 年2月，由日本衛(wèi)材公司研發(fā)甲磺酸樂伐替尼膠囊——樂衛(wèi)瑪（LenvimaTM）成功獲得 FDA 批準(zhǔn)用于晚期放射性-碘難治性分化型甲狀腺癌的治療[6]，隨后又相繼批準(zhǔn)用于腎癌聯(lián)合用藥治療和肝癌的臨床一線用藥[5]。樂伐替尼是肝癌新藥中最耀眼的明星，其臨床客觀緩解率是索拉非尼的 327%（40.6%vs12.4%），無進(jìn)展生存期是索拉非尼的 203%（7.3 個(gè)月vs3.6 個(gè)月）[7]；相較于索拉菲尼，針對(duì)中國肝癌患者的總生存期提高了 5 個(gè)月（15 個(gè)月vs10.2 個(gè)月，P= 0.02620）[8]。因此，樂伐替尼顯著優(yōu)于上一代肝癌靶向藥物索拉菲尼。

盡管樂伐替尼的臨床效果優(yōu)異，但其仍存在一些不良反應(yīng)。樂伐替尼膠囊（LenvimaTM）需要通過口服給藥，易出現(xiàn)消化道不良反應(yīng)，例如：口腔炎、腹瀉、嘔吐等，嚴(yán)重者導(dǎo)致消化道出血，甚至胃腸道穿孔和瘺道形成[9-10]。有研究報(bào)道，部分患者使用樂伐替尼出現(xiàn)了高血壓和動(dòng)脈血栓栓塞等不良反應(yīng)[11]，只能選擇降低給藥頻率或更換其他藥物。因此，亟需開發(fā)一種生物相容性好、腫瘤靶向性高的新型樂伐替尼藥物制劑。

脂質(zhì)體（Liposome）是由磷脂和（或）膽固醇為基本膜材構(gòu)建而成具有類似生物膜雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡[12]。脂質(zhì)體已在藥物遞送系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、無毒無免疫原性等優(yōu)勢(shì)[13-14]，尤其是脂質(zhì)體可以利用單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（Mononuclear phagocyte system，MPS）被動(dòng)靶向肝臟[15-16]。

本研究采用被動(dòng)載藥和主動(dòng)載藥兩類工藝制備 Len 脂質(zhì)體，以 Len 脂質(zhì)體包封率和體外釋放為指標(biāo)，通過處方工藝優(yōu)化篩選出最優(yōu)制備方法，為 Len 脂質(zhì)體的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供研究基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

甲磺酸樂伐替尼（Lenvatinib mesylate，Len，濟(jì)南凱恩醫(yī)藥科技有限公司，HPLC 純度 ≥ 99%，批號(hào)：190401）；氫化大豆磷脂（Hydrogenated soybean phospholipids，HSPC，德國Lipoid GmbH公司，批號(hào)：525600-2180653-01/026-031(6)）；膽固醇（Cholesterol，CH，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：B40333）；葡聚糖凝膠 G50（Sephadex G50，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：S8151）；氯型 717 型陰離子交換樹脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180309）；檸檬酸（C6H8O7·H2O，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：1029054-01-09）；磷酸鈉（Na3PO4，天津希恩思生化科技有限公司，批號(hào)：S-42550）；磷酸二氫鉀（KH2PO4，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：P815662）；氫氧化鈉（NaOH，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：S817968）；異丙醇（C3H8O，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：I811925）；無水乙醇（C2H6O，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：E809061）；甲醇（CH4O，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：M813907）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠）；RE-52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；JY92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV2700 紫外可見分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；JEM-1011 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；Agilent 1200 高效液相色譜（HPLC）及其色譜工作站測定（美國安捷倫科技有限公司）；C18 色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，迪馬科技有限公司）；SYWF-50 水浴恒溫震蕩器（天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；TopPette 微量移液器（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；透析袋（截留分子量 10 kDa，美國光譜醫(yī)學(xué)公司）。

1.3 Len 紫外檢測波長測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

首先，采用異丙醇 / 水（90 / 10,v/v）配制 Len 藥物溶液，藥物濃度為 0.1 mg/mL。然后，以異丙醇 / 水（90 / 10,v/v）作為空白溶劑，利用 UV2700 紫外分光光度計(jì)對(duì) 0.1 mg/mL 的 Len藥物溶液進(jìn)行 200～800 nm 全波長掃描，確定最適 Len 紫外檢測波長。

精密稱定 Len 原料藥 10.0 mg，置于 100 mL 量瓶中，以異丙醇/水（90 / 10,v/v）溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1的 Len 溶液作為儲(chǔ)備液。分別精密移取儲(chǔ)備液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 置于 10 mL 量瓶中，以異丙醇/水（90 / 10,v/v）稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度分別為 5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 μg·mL-1的 Len 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最適波長處測定吸光度值，并以 Len 溶液吸光度（A）對(duì) Len 濃度（C, μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 被動(dòng)載藥工藝

為了便于比較，若無特殊說明，統(tǒng)一采用經(jīng)典的脂質(zhì)體處方，其組成為 HSPC / CH / Len =100 mg / 33 mg / 5 mg，制備 10 mL 脂質(zhì)體，考察以下 3 種的 Len 脂質(zhì)體制備工藝。

1.4.1 薄膜分散法

精密稱定處方量的 HSPC 和 CH 置于 500 mL 圓底燒瓶中，加入 10 mL 無水乙醇，完全溶解 HSPC 和 CH 之后，在 65 ℃ 水浴加熱，轉(zhuǎn)速為 30 rpm，真空度為 0.09 MPa 條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，在圓底燒瓶壁上形成脂質(zhì)膜；然后，精密稱定 10 mg Len，完全溶解于10 mL含有 10% 乙醇的水溶液中，將 Len 溶液加入圓底燒瓶中，在轉(zhuǎn)速為 30 rpm，室溫常壓條件下水化脂質(zhì)膜 30 min；利用超聲波細(xì)胞粉碎儀分散脂質(zhì)體，采用 100W 分散 2 min，200W 分散 4 min，將脂質(zhì)體通過 0.8 μm 微孔濾膜整粒，即得 Len 脂質(zhì)體。

1.4.2 逆相蒸發(fā)法

精密稱定處方量的 HSPC 和 CH 置于 500 mL 圓底燒瓶中，加入 30 mL 二氯甲烷/異丙醚混合溶劑（50 / 50,v/v），完全溶解 HSPC 和 CH；然后，精密稱定 10 mg Len，完全溶解于 10 mL含有 10% 乙醇的水溶液中，將 Len 溶液加入圓底燒瓶中，在水浴超聲中快速振搖分散，形成W / O 型乳劑；在 65 ℃ 水浴加熱，轉(zhuǎn)速為 30 rpm，真空度為 0.09 MPa 條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完全除去有機(jī)溶劑，采用蒸餾水稀釋脂質(zhì)體至 10 mL；利用超聲波細(xì)胞粉碎儀分散脂質(zhì)體，采用 100 W分散 2 min，200 W 分散 4 min，將脂質(zhì)體通過 0.8 μm 微孔濾膜整粒，即得 Len 脂質(zhì)體。

1.4.3 改良乙醇注入法

精密稱定處方量的 HSPC 和 CH 置于 25 mL 西林瓶中，加入 0.5 mL 無水乙醇，在恒溫加熱磁力攪拌器 65 ℃ 水浴加熱，完全溶解 HSPC 和 CH，加入磁力攪拌子，揮發(fā)除去大部分乙醇；然后，精密稱定 10 mg Len，完全溶解于 10 mL 含有 10% 乙醇的水溶液中，將加熱至 65℃的 Len 溶液快速加入西林瓶中；在 65 ℃ 水浴，60 rpm 轉(zhuǎn)速條件下，孵育 20 min；利用超聲波細(xì)胞粉碎儀分散脂質(zhì)體，采用 100 W 分散 2 min，200 W 分散 4 min，將脂質(zhì)體通過 0.8 μm微孔濾膜整粒，即得 Len 脂質(zhì)體。

1.5 pH 梯度法

pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體時(shí)，統(tǒng)一采用經(jīng)典的脂質(zhì)體處方，其組成為 HSPC / CH / Len =100 mg / 33 mg / 5 mg，制備10 mL脂質(zhì)體，考察不同主動(dòng)載藥條件下制備的 Len 脂質(zhì)體。

首先，采用改良乙醇注入法制備空白脂質(zhì)體，將處方量的 HSPC 和 CH 置于 10 mL 西林瓶中，加入 0.5 mL 無水乙醇，在恒溫加熱磁力攪拌器 65 ℃ 水浴加熱，完全溶解 HSPC 和 CH，加入磁力攪拌子，揮發(fā)除去大部分乙醇；然后，將加熱至 65 ℃ 的 200 mM pH 3.0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 4 mL 快速加入西林瓶中；在 65 ℃ 水浴，60 rpm 轉(zhuǎn)速條件下，孵育 20 min；利用超聲波細(xì)胞粉碎儀分散脂質(zhì)體，采用 100 W 分散 2 min，200 W 分散 4 min，將脂質(zhì)體通過 0.8 μm微孔濾膜整粒，即得空白脂質(zhì)體，磷脂濃度為 25 mg/mL。

然后，在冰水浴條件下，使用 Na3PO4溶液將脂質(zhì)體外水相調(diào)節(jié)至 pH 7.0，即得梯度脂質(zhì)體，磷脂濃度為 20 mg/mL。

最后，移取 0.5 mL 梯度脂質(zhì)體，加入 1 mL Len 溶液（1 mg/mL），以藥脂比 1 / 10（w/w）進(jìn)行載藥，在 60 ℃ 下孵育 20 min，采用冰水浴終止載藥 3 min，即得 pH 梯度法制備的 Len脂質(zhì)體。

1.5.1 水化介質(zhì)濃度

為了比較不同水化介質(zhì)濃度對(duì) pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的影響，本實(shí)驗(yàn)配制了 50、100、200、300、400 mM 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為水化介質(zhì)制備空白脂質(zhì)體，其余步驟均按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行。

1.5.2 外水相陰離子

為了研究外水相陰離子（檸檬酸根陰離子）對(duì) pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的影響，本實(shí)驗(yàn)采用氯型 717 型陰離子交換樹脂微柱（柱體積約為 2 mL）置換空白脂質(zhì)體外水相檸檬酸根陰離子，移取 0.5 mL 空白脂質(zhì)體上樣于陰離子交換樹脂微柱頂端，2 000 rpm 離心 2 min，收集洗脫下來的空白脂質(zhì)體，調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外水相 pH，制備梯度脂質(zhì)體，其余步驟均按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行。

1.5.3 跨膜 pH 梯度

為了考察不同跨膜 pH 梯度對(duì) pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的影響，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)空白脂質(zhì)體外水相至 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，即分別制備跨膜 pH 梯度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 的梯度脂質(zhì)體，其余步驟均按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行。

1.5.4 載藥溫度

為了研究不同載藥溫度對(duì) pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的影響，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)梯度脂質(zhì)體載藥過程的孵育溫度至 30、40、50、60、70 ℃，其余步驟均按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行。

1.5.5 藥脂比

為了考察不同藥脂比對(duì) pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的影響，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)梯度脂質(zhì)體載藥過程中 Len / HSPC 的比例至 1/5、1/10、1/20、1/30、1/40（w/w），其余步驟均按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行。

1.6 Len 脂質(zhì)體包封率測定[17]

采用葡聚糖凝膠 G50 制備成凝膠微柱（柱體積約為 1 mL）離心法測定 Len 脂質(zhì)體包封率。移取兩份 100 μL Len 脂質(zhì)體，一份直接置于 5 mL 量瓶中，加 200 μL 蒸餾水，加入異丙醇 / 水（90 / 10,v/v）至刻度并搖勻，采用紫外分光光度計(jì)于 260 nm 處測定吸光度，記為 Abefore；另一份上樣于葡聚糖凝膠 G50 微柱頂端，2 000 rpm 離心 2 min，繼續(xù)加 100 μL 蒸餾水于柱頂端，2 000 rpm 離心 2 min 洗脫，連續(xù)操作 2 次合并洗脫液，將合并洗脫液轉(zhuǎn)移至 5 mL 量瓶中，加入異丙醇/水（90 / 10,v/v）破乳并稀釋至刻度搖勻后，采用紫外分光光度計(jì)于最適吸收波長處測定吸光度，記為 AafterLen 脂質(zhì)體包封率（Encapsulation efficiency，EE）。計(jì)算公式為：

EE(%) = Aafter/ Abefore× 100%

1.7 粒徑和 Zeta 電位測定[18]

取適量 Len 脂質(zhì)體，經(jīng)蒸餾水稀釋后移取 1.5 mL 于樣品池內(nèi)，采用基于動(dòng)態(tài)光散射原理的Zetasizer nano ZS90 粒徑測定儀測定脂質(zhì)體的粒徑；然后，將稀釋完的樣品裝入 Zeta 電位樣品池中，利用 Smoluchowski 方程將測得的微粒遷移率轉(zhuǎn)換為Zeta電位。

1.8 微觀形態(tài)表征

將 Len 脂質(zhì)體稀釋至磷脂濃度 10 mg/mL，吸取 20 μL 脂質(zhì)體滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，用2%（w/v）磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染 1 min，用濾紙吸取剩余液體，紅外燈下烘干后，置于透射電鏡下觀察 Len 脂質(zhì)體的微觀形態(tài)并拍照。

1.9 體外釋放性質(zhì)考察

分別精密移取含有 2 mg Len 的游離 Len 溶液（Len-S）、被動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體（Len-PCL）、主動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體（Len-R-CL），分別加入至透析袋中，兩端夾好后，置于 100 mL釋放介質(zhì)（含有 0.5% (w/v) Tween 80 的 10 mM PBS）中，在 37 ± 2℃ 恒溫、避光、20 rpm條件下水浴恒溫震蕩孵育。分別于 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 分別吸取 1.0 mL 透析液，并補(bǔ)加等量同溫空白釋放介質(zhì)。

透析液用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液用 HPLC 法測定其中藥物濃度。采用 0.05 mM KH2PO4（磷酸調(diào)節(jié)至 pH 3.0）水溶液與甲醇比例為 30 : 70（v/v）作為流動(dòng)相[19]，Diamonsil C18色譜柱作為固定相，利用安捷倫 1200 HPLC 系統(tǒng)對(duì)透析液中的 Len 進(jìn)行分離和檢測。

根據(jù)透析液中的藥物濃度計(jì)算制劑的累計(jì)藥物釋放量，計(jì)算公式如下：

V0為釋放介質(zhì)體積，V為取樣體積，Cn為第 n 次取樣時(shí)濃度，M為藥物總量，1

2 結(jié)果

2.1 Len紫外檢測波長的確定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖2A 所示，Len 異丙醇溶液與空白脂質(zhì)體異丙醇溶液的 200～800 nm 紫外掃描結(jié)果表明，Len 在 211、245、290、300、329 nm 波長處均有吸收峰，但 223 nm 波長較短，存在末端吸收干擾；如圖2B 所示，空白脂質(zhì)體在 245 nm 波長下存在紫外吸收，存在藥物輔料干擾。因此，在 Len 不受干擾的紫外吸收峰中，優(yōu)選峰值較高的 300 nm 處為最適紫外檢測波長。

Fig.2 UV-vis spectroscopy of (A) Len and (B) empty liposomes in the wavelength range from 200 nm to 800 nm圖2 （A）Len和（B）空白脂質(zhì)體200~800 nm紫外可見全波長掃描

如圖3 所示，Len 藥物溶液在 300 nm 處的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A = 0.0255C + 0.0029，相關(guān)系數(shù)R = 0.9997，Len 質(zhì)量濃度在 5.0～40.0 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

Fig.3 Standard curve of Len圖3 Len標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 被動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體制備工藝的確定

采用 3 種被動(dòng)載藥工藝制備 Len 脂質(zhì)體并測定其包封率，結(jié)果如表1 所示。雖然有研究報(bào)道逆相蒸發(fā)法比較適宜制備水溶性藥物，但是逆相蒸發(fā)法制備的 Len 脂質(zhì)體包封率最低，僅為11.3 ± 3.5%。這是由于 Len 在 10% 的乙醇水溶液中具有較好的溶解效果，當(dāng)乙醇與二氯甲烷、異丙醚等互溶之后，導(dǎo)致水相中的 Len 溶解度下降，并出現(xiàn)顆粒狀析出。因此，在逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體過程中，大量 Len 沒有被有效包封入脂質(zhì)體，導(dǎo)致包封率較低。薄膜分散法與改良乙醇注入法制備的 Len 脂質(zhì)體包封率無顯著性差異，分別為 23.5 ± 2.7% 和 27.6 ± 3.1%，但薄膜分散法制備過程時(shí)間較長，操作繁瑣，且在轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體過程中易出現(xiàn)制劑損失。因此，優(yōu)選乙醇注入法作為 Len 脂質(zhì)體被動(dòng)載藥工藝。為了保證實(shí)驗(yàn)的平行性，主動(dòng)載藥技術(shù)也選擇乙醇注入法制備空白脂質(zhì)體。

Table 1 Encapsulation efficiencies and contents of Len liposomes prepared by film dispersion method, reverse phase evaporation method, and modified ethanol injection method (n = 3)表1 薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法和改良乙醇注入法制備Len脂質(zhì)體的包封率和藥物含量（n = 3）

2.3 主動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體制備工藝的確定

2.3.1 水化介質(zhì)濃度

采用 pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體，水化介質(zhì)濃度對(duì)脂質(zhì)體包封率有重要影響[20-21]。如圖4所示，隨著水化介質(zhì)濃度從 50 mM 增大到 200 mM 過程中，Len 脂質(zhì)體包封率先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)水化介質(zhì)濃度達(dá)到 200 mM 時(shí)，包封率最高。這可能是由于當(dāng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液濃度較低時(shí)，脂質(zhì)體內(nèi)水相 pH 緩沖能力較弱，隨著 Len 不斷裝載入內(nèi)水相，內(nèi)水相 pH 迅速升高，跨膜 pH 梯度下降，pH 梯度法的動(dòng)力源逐漸喪失，導(dǎo)致 Len 包封率隨著水化介質(zhì)濃度增大而升高；當(dāng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液濃度達(dá)到和超過 300 mM 時(shí)，脂質(zhì)體外水相中的檸檬酸根離子易與 Len 藥物溶液形成低溶解度復(fù)合物，不利于 Len 主動(dòng)載藥進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)水相，導(dǎo)致Len 脂質(zhì)體包封率隨著水化介質(zhì)濃度繼續(xù)增大而下降。我們進(jìn)一步采用氯型陰離子交換樹脂將梯度脂質(zhì)體外水相的檸檬酸根離子置換成氯離子，考察不同外水相陰離子制備 Len 脂質(zhì)體的包封率[22]。當(dāng)梯度脂質(zhì)體外水相陰離子置換成氯離子之后，相較于檸檬酸根離子存在時(shí)，各組 Len脂質(zhì)體包封率提高了 5～60%。

因此，pH 梯度法優(yōu)選 200 mM 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為水化介質(zhì)制備空白脂質(zhì)體，并且載藥之前需要將外水相檸檬酸根離子置換成氯離子。

Fig 4 Encapsulation efficiencies of Len liposomes prepared with aqueous medium of different concentrations(n = 3)圖4 不同濃度水化介質(zhì)制備 Len 脂質(zhì)體的包封率（n = 3）

2.3.2 跨膜 pH 梯度

根據(jù) Henderson-Hasselbalch 理論[23-24]，脂質(zhì)體每個(gè)跨膜 pH 單位的變化，會(huì)產(chǎn)生分子型與離子型藥物濃度 10 倍變化，當(dāng)達(dá)到 3 個(gè)單位的跨膜 pH 梯度時(shí)，理論上能夠?qū)?99.9% 的藥物裝載入脂質(zhì)體。

如圖5 所示，隨著跨膜 pH 梯度的增大，Len 脂質(zhì)體包封率先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)跨膜pH 梯度達(dá)到 3 個(gè)單位時(shí)，包封率最高。這可能是由于當(dāng)跨膜 pH 梯度小于 3 個(gè)單位時(shí)，即當(dāng)外水相 pH 值小于 6，脂質(zhì)體外水相呈弱酸性，Len 的溶解度較大，隨著跨膜 pH 梯度逐漸增大（內(nèi)水相 pH 不變，外水相 pH 逐漸增大），極性較小的分子型 Len 比例逐漸增加，Len脂質(zhì)體載藥效率顯著提升，包封率增大；但當(dāng)跨膜 pH 梯度大于 3 個(gè)單位時(shí)，即當(dāng)外水相 pH值大于 6，脂質(zhì)體外水相呈中性或偏堿性，Len 的溶解度急劇下降，隨著跨膜 pH 梯度繼續(xù)增大，Len 大量析出，導(dǎo)致 Len 脂質(zhì)體包封率快速下降。因此，Len 脂質(zhì)體的載藥過程優(yōu)選 3 個(gè)單位跨膜 pH 梯度。

Fig 5 Encapsulation efficiencies of Len liposomes prepared with different transmembrane pH gradients (n = 3)圖5 不同跨膜pH梯度制備Len脂質(zhì)體的包封率（n = 3）

2.3.3 載藥溫度

脂質(zhì)體主動(dòng)載藥過程可以采用經(jīng)典 Arrhenius 化學(xué)動(dòng)力學(xué)方程[25]進(jìn)行解釋?？捎蒬lnk /dT =Ea / RT2式中，k 為速率常數(shù)，R 為摩爾氣體常數(shù)，T 為熱力學(xué)溫度，Ea 為表觀活化能。對(duì)于同一脂質(zhì)體主動(dòng)載藥過程，Ea（跨膜活化能）為定值，當(dāng)T（孵育溫度）升高時(shí)，k（載藥速率）增大，Len 脂質(zhì)體快速達(dá)到載藥平衡，但不會(huì)增大 Len 脂質(zhì)體最大包封率[26]。

Fig 6 Encapsulation efficiencies of Len liposomes prepared with different drug loading temperatures (n=3)圖6 不同載藥溫度制備 Len 脂質(zhì)體的包封率（n = 3）

如圖6 所示，隨著載藥溫度的增大，Len 脂質(zhì)體包封率先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)。由于載藥溫度較低時(shí)，Len 分子熱運(yùn)動(dòng)不足以克服 Ea（跨膜活化能），無法有效裝載入脂質(zhì)體，包封率較低；隨著載藥溫度逐漸升高，一方面，Len 分子動(dòng)能增大，Len 具備較強(qiáng)的跨膜能力，另一方面，HSPC的相變溫度為 55 ℃ 左右[12]，當(dāng)載藥溫度超過相變溫度，脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性顯著增強(qiáng)，更加有利于 Len 進(jìn)入脂質(zhì)體。然而，磷脂分子易在高溫下氧化和降解，因此，優(yōu)選 60 ℃ 作為Len 脂質(zhì)體的載藥溫度。

2.3.4 藥脂比

按“1.4”項(xiàng)下操作步驟，以 Len / HSPC 比例 1/5、1/10、1/20、1/30（w/w）進(jìn)行主動(dòng)載藥，結(jié)果如圖7 所示。隨著藥脂比的降低，Len 脂質(zhì)體的包封率逐漸升高，但當(dāng)藥脂比達(dá)到 1/20 之后，包封率基本不變。因此，Len 脂質(zhì)體優(yōu)選以 1/20（w/w）藥脂比進(jìn)行主動(dòng)載藥。

Fig.7 Encapsulation efficiencies of Len liposomes was prepared with different drug-lipid ratio (n=3)圖7 不同藥脂比制備 Len 脂質(zhì)體的包封率（n=3）

2.3.5 主動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體最優(yōu)處方工藝

經(jīng)過一系列單因素考察，確定主動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體的最優(yōu)處方工藝為：脂質(zhì)體處方組成為HSPC / CH / Len = 100 mg / 33 mg / 5 mg，采用 200 mM pH 3.0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為水化介質(zhì)，利用氯型陰離子交換樹脂將空白脂質(zhì)體外水相檸檬酸根離子置換成氯離子，使用 Na3PO4溶液將脂質(zhì)體外水相調(diào)節(jié)至 pH 6.0，即得梯度脂質(zhì)體；然后，按 Len / HSPC = 1/20 (w/w)混合梯度脂質(zhì)體和 Len 藥物溶液，在 60 ℃ 下孵育載藥 20 min，采用冰水浴終止載藥 3 min，即得 pH梯度法制備的最優(yōu) Len 脂質(zhì)體，其包封率達(dá)到 91.8 ± 2.1%，藥物含量為 0.92 ± 0.02 mg·mL-1。

2.4 Len 脂質(zhì)體的粒徑和 Zeta 電位

采用馬爾文激光粒度儀分別對(duì)被動(dòng)載藥工藝（改良乙醇注入法）和主動(dòng)載藥技術(shù)（pH 梯度法）制備的 Len 脂質(zhì)體平均粒徑、粒徑分布與Zeta電位進(jìn)行測定。如圖8A 和 8C 所示，被動(dòng)載藥工藝與主動(dòng)載藥技術(shù)制備的 Len 脂質(zhì)體平均粒徑分別為 191.3 ± 15.2 nm 和 134.8 ± 7.5 nm，多分散系數(shù) PDI 分別為 0.327 和 0.113。因此，主動(dòng)載藥法制備的 Len 脂質(zhì)體粒徑較小且均一。如圖8B 和 8D 所示，被動(dòng)載藥工藝與主動(dòng)載藥技術(shù)制備的 Len 脂質(zhì)體具有相似的Zeta電位，分別為 -7.7 ± 3.1 mV 和 -12.6 ± 2.3 mV。

Fig.8 The (A and C) sizes and (B and D) Zeta potentials of Len liposomes (A and B：Passive loading method；C and D：Remote loading method)圖8 Len脂質(zhì)體的（A和C）粒徑和（B和D）Zeta電位（A和B：被動(dòng)載藥；C和D：主動(dòng)載藥）

2.5 Len 脂質(zhì)體微觀形態(tài)

Len 脂質(zhì)體透射電子顯微鏡成像結(jié)果如圖9 所示。脂質(zhì)體為球形或橢球形封閉囊泡，具有明顯的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，典型大單室脂質(zhì)體，Len 脂質(zhì)體的平均粒徑與馬爾文激光粒度儀測定的數(shù)據(jù)基本一致。

Fig 9 Transmission electron microscopy images of Len liposomes (A：Passive loading method；B：Remote loading method), the scale bars indicate 100 nm圖9 Len 脂質(zhì)體透射電子顯微鏡成像（A：被動(dòng)載藥；B：主動(dòng)載藥），標(biāo)尺為100 nm

2.6 Len 脂質(zhì)體體外釋放性質(zhì)

如圖10 所示，Len 溶液與被動(dòng)載藥工藝制備的 Len 脂質(zhì)體分別在 4 h 和 12 h 內(nèi)完全釋放藥物，而主動(dòng)載藥技術(shù)制備的 Len 脂質(zhì)體在 24 h 內(nèi)僅釋放 63% 的藥物。結(jié)果表明，兩種 Len脂質(zhì)體較 Len 溶液均表現(xiàn)出明顯的緩釋特征，主動(dòng)載藥法制備的 Len 脂質(zhì)體釋放較緩慢，且穩(wěn)定性較好，具備后續(xù)開發(fā)潛力。

Fig 10 In vitro release profiles of Len liposomes (Len-S: free Len solution，Len-P-CL: Len liposome prepared by passive loading method，Len-R-CL: Len liposome prepared by remote loading method)圖10 Len脂質(zhì)體的體外釋放（Len-S：Len溶液，Len-P-CL：被動(dòng)載藥Len脂質(zhì)體，Len-R-CL：主動(dòng)載藥Len脂質(zhì)體）

3 討論

3.1 主動(dòng)載藥高包封率的原因

被動(dòng)載藥工藝制備的 Len 脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的內(nèi)外水相中 Len 的濃度基本一致。因此，脂質(zhì)體包封體積的大小直接決定了被動(dòng)載藥脂質(zhì)體的包封率。有研究報(bào)道，脂質(zhì)體內(nèi)水相體積一般小于 20%[27]，直接導(dǎo)致了被動(dòng)載藥脂質(zhì)體包封率較低。主動(dòng)載藥技術(shù)是脂質(zhì)體技術(shù)的重要突破，尤其是成功產(chǎn)業(yè)化的 pH 梯度法[28]。如圖11 所示，首先，在近中性（pH 6.0）的脂質(zhì)體外水相中，離子態(tài)的 LenH+逐漸失去 H+，形成分子態(tài)的 Len；由于 Len 的極性較小，分子熱運(yùn)動(dòng)促使 Len可以自由通過疏水性的磷脂雙分子層，當(dāng) Len 進(jìn)入內(nèi)水相時(shí)，酸性環(huán)境（pH 3.0）使其快速質(zhì)子化形成離子態(tài) LenH+；緊接著，離子態(tài)的 LenH+能夠與檸檬酸根離子（Citrate ion, Cit）迅速形成低溶解度復(fù)合物 CitLenH+，導(dǎo)致 Len 被穩(wěn)定的裝載于脂質(zhì)體內(nèi)水相。根據(jù)化學(xué)平衡移動(dòng)原理[29]，游離的 Len 分子不斷自發(fā)從高濃度的外水相涌入低濃度的內(nèi)水相，通過 LenH+-Len-LenH+-CitLenH+途徑裝載入脂質(zhì)體，從而形成高包封率的 Len 脂質(zhì)體。雖然主動(dòng)載藥技術(shù)制備的 Len脂質(zhì)體內(nèi)水相表觀 Len 濃度遠(yuǎn)大于外水相，但是能夠“自由進(jìn)出”脂質(zhì)體的游離的 Len 分子濃度在脂質(zhì)體膜兩側(cè)是相似的。

3.2 外水相陰離子對(duì)主動(dòng)載藥過程的影響

如圖4 所示，外水相陰離子對(duì)主動(dòng)載藥過程影響較大，尤其是當(dāng)高濃度水化介質(zhì)狀態(tài)下。由圖11 可知，當(dāng)藥物加入脂質(zhì)體外水相，離子態(tài)的 LenH+一方面去質(zhì)子化形成分子態(tài)的 Len，其極易跨膜進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)水相；另一方面能夠與 LenH+外水相的 Cit 結(jié)合，形成低溶解度復(fù)合物CitLenH+，導(dǎo)致藥物無法跨膜進(jìn)入脂質(zhì)體。當(dāng)外水相 Cit 置換成 Cl-之后，不影響 LenH+的溶解情況，從而成功制備高包封率的 Len 脂質(zhì)體。

3.3 Len 藥物溶液、被動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體與主動(dòng)載藥 Len 脂質(zhì)體釋放速率的差異

由于 Len 在純水中的溶解度較小，我們通過向釋放介質(zhì)中加入 0.5% (w/v) Tween 80[30]，從而達(dá)到 Len 的漏槽條件。實(shí)驗(yàn)用透析袋的截留分子量為 10 kDa，游離藥物可以自由擴(kuò)散通過。因此，Len 藥物溶液可以快速完全釋放。然而，脂質(zhì)體膜會(huì)大大降低 Len 的擴(kuò)散速率，表現(xiàn)為Len 脂質(zhì)體的緩釋效應(yīng)。被動(dòng)載藥工藝制備的 Len 脂質(zhì)體，Len 主要以離子型 LenH+形式分布于內(nèi)水相和分子型 Len 形式分布于磷脂雙分子層，藥物通過濃度梯度擴(kuò)散，釋放過程相對(duì)較快；由圖11 可知，主動(dòng)載藥技術(shù)制備的 Len 脂質(zhì)體，藥物以低溶解度復(fù)合物 CitLenH+穩(wěn)定包封于脂質(zhì)體內(nèi)水相，LenH+和 Len 的濃度均較低，導(dǎo)致 Len 釋放較慢。

Fig.11 Drug loading mechanism of Len liposomes prepared by pH gradient method圖11 pH 梯度法制備 Len 脂質(zhì)體的載藥機(jī)制