小鼠H22 肝癌移植瘤模型在PD-1 單抗治療肝癌中的應(yīng)用

黃凝 ，祝思宇 ，李鴻泉 ，程曦 ，鄧向亮 ，2

1. 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 云浮 527300；2. 廣東藥科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 云浮 527300

近年來，基于T 細(xì)胞的腫瘤免疫治療研究取得了重大進(jìn)展，尤其是在常規(guī)療法無效的晚期腫瘤治療方面取得重大突破，因此受到廣泛關(guān)注。PD-1 ／PD-L1 單抗是基于T 細(xì)胞的腫瘤免疫療法的代表性藥物［1］。截至 2020 年 6 月，PD-1 ／ PD-L1 單抗已經(jīng)用于包括肝癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等16 種腫瘤的臨床治療［2］。隨著適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，PD-1 ／ PD-L1單抗藥物出現(xiàn)不良反應(yīng)、耐藥等問題，且對全部腫瘤的有效率僅為25% ～30%［3］。因此，目前全球有大量提高PD-1 ／ PD-L1 單抗藥物療效、降低其臨床不良反應(yīng)方法的相關(guān)研究［4-7］。據(jù)國家癌癥中心《2017中國腫瘤的現(xiàn)狀和趨勢》報(bào)告顯示，肝癌在我國腫瘤發(fā)病率和死亡率中均排前3 名，因此，基于PD-1 ／PD-L1 單抗藥物在肝癌中的防治研究具有重要意義。動(dòng)物腫瘤模型廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療研究，尤其是小鼠腫瘤模型［8］。小鼠H22 細(xì)胞型肝癌模型是1952 年由蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所發(fā)明，屬于皮下傳代肝臟實(shí)體瘤［9］。該模型目前廣泛用于中藥、納米藥物、各類生物制劑等抗腫瘤藥物藥理以及肝癌發(fā)病相關(guān)機(jī)制的研究，如片仔癀、藤茶總黃酮固體脂質(zhì)納米粒和基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑在抗肝癌中應(yīng)用的研究［10-12］。本研究通過考察該模型中T 細(xì)胞亞群浸潤和表型特點(diǎn)，結(jié)合對PD-1 單抗治療的反應(yīng)性，探討該模型用于PD-1 單抗治療腫瘤研究的可行性，為基于PD-1 的單抗藥物在肝癌治療上的相關(guān)研究提供模型參考。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級 BALB ／ c 小鼠，18 只，雄性，6 ~ 8 周齡，18 ~ 22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行小鼠的養(yǎng)殖和使用，且經(jīng)廣東藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會審查批準(zhǔn)，并按科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》、《廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（國科發(fā)財(cái)字［2006］398 號、廣東省第十一屆人民代表大會常務(wù)委員會公告［41 號］）。

1. 2 細(xì)胞 H22 細(xì)胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)周聯(lián)教授惠贈(zèng)，制備肝癌移植瘤模型前經(jīng)KM 小鼠腹腔傳代培養(yǎng)。

1. 3 主要試劑及儀器 流式檢測抗體（包括PE／CY7標(biāo)記的 CD3 單抗、PE ／ CY5 標(biāo)記的 CD8 和 CD25 單抗、FITC 標(biāo)記的 CD4 單抗、PE 標(biāo)記的 PD-1 單抗）購自美國eBioscience 公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；膠原酶Ⅳ和DNA 酶購自美國Sigma 公司；治療用PD-1 單抗購自美國BioXcell 公司；FACS CantoTMⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。

1. 4 動(dòng)物造模、分組及給藥 以H22 肝癌移植瘤模型為研究對象。經(jīng)小鼠右側(cè)前肢皮下接種2 ×107個(gè) ／ mL 的 H22 細(xì)胞懸液，0. 1 mL ／ 只，30 min內(nèi)接種完畢，4 d 后小鼠腫瘤形成即可供后續(xù)試驗(yàn)使用。為考察小鼠腫瘤組織中T 細(xì)胞浸潤和表型，于小鼠接種腫瘤14 d 后，取腫瘤組織分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。為考察腫瘤小鼠對PD-1 單抗治療的響應(yīng)，將小鼠分為模型組和PD-1 單抗治療組（以下簡稱治療組），每組6 只。以小鼠分組當(dāng)天計(jì)為實(shí)驗(yàn)第1 天。其中治療組分別在分組后的第4、7、10天給予腹腔注射PD-1 單抗，藥物劑量參考文獻(xiàn)［13］用量，為 200 μg ／ 只；模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后第3 天取材檢測。

1. 5 腫瘤生長情況的觀察 從動(dòng)物分組即開始用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，每2 d 測量1 次，按下式計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。

腫瘤體積（mm3）＝（腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2）／ 2

1. 6 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的制備 剪除腫瘤表面皮毛，剝離腫瘤，剪成1 mm3大小碎塊，加入膠原酶Ⅳ和 DNA 酶，37 ℃消化 2 h；消化后組織在 200 目不銹鋼網(wǎng)上研磨、過濾后，收集細(xì)胞懸液至離心管，DHank’s 液離心洗滌細(xì)胞 2 次（200 × g 離心 5 min），經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離并收集腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs），再次離心洗滌2 次后備用。

1. 7 脾臟淋巴細(xì)胞的制備 摘取小鼠脾臟，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨、過濾，收集細(xì)胞懸液，D-Hank’s液離心洗滌細(xì)胞 2 次（200 × g 離心 5 min），經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離并收集淋巴細(xì)胞，再次離心洗滌2次后備用。

1. 8 T 淋巴細(xì)胞表型的檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取TILs 和脾淋巴細(xì)胞懸液，按流式抗體試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞的熒光染色，抗體包括PE ／ CY7-CD3 單抗、PE ／ CY5-CD8 單抗和 PE ／ CY5-CD25 單抗、FITC-CD4 單抗及PE-PD-1 單抗。細(xì)胞染色并經(jīng)PBS 離心洗滌后，加入300 μL PBS 重懸，采用FACS CantoTMⅡ檢測細(xì)胞表型。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 19. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用非配對t 檢驗(yàn)，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 肝癌小鼠腫瘤組織中T 細(xì)胞浸潤情況 小鼠腫瘤組織中有CD3+TILs 即T 細(xì)胞浸潤，占TILs 的（33. 7 ± 1. 5）%，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 T 細(xì)胞中有（22. 4 ± 0. 9）%是 CD8+T 細(xì)胞，見圖 1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析T 細(xì)胞在腫瘤中的浸潤情況（Mean ± SD，n = 6）Fig. 1 Flow cytometry of T cell infiltration in tumor（Mean ± SD，n = 6）

肝癌小鼠腫瘤組織中CD4+CD25+T 細(xì)胞比例為（24.0±2.3）%，脾臟組織中比例為（13.9±1.7）%，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 8. 676，P < 0. 01），見圖2。

圖2 腫瘤組織和脾臟組織中CD4+CD25+T 細(xì)胞比例（Mean ± SD，n = 6）Fig. 2 Proportions of CD4+CD25+T cells in tumor and spleen tissues（Mean ± SD，n = 6）

2. 2 肝癌小鼠腫瘤組織中T 細(xì)胞表達(dá)PD-1 分子的情況 腫瘤組織中CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞表達(dá)PD-1分子比例分別為（28. 6 ± 8. 7）%和（26. 0 ± 4. 6）%，脾臟組織中CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞表達(dá)PD-1 分子比例分別為（4. 3 ± 0. 7）%和（17. 2 ± 3. 8）%；兩組織T 細(xì)胞亞群表達(dá)PD-1 分子的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PD-1+CD8+T 細(xì)胞比較：t = 7. 842，PD-1+CD4+T細(xì)胞比較：t = 4. 118；P 均 ＜ 0. 01）。見圖 3。在肝癌移植瘤模型中，腫瘤浸潤T 細(xì)胞表達(dá)高水平PD-1 分子，提示該模型可能對PD-1 單抗治療具有響應(yīng)性。

圖3 腫瘤組織和脾臟組織中T 細(xì)胞表達(dá)PD-1 分子情況（Mean ± SD，n = 6）Fig. 3 Expression levels of PD-1 in T cells from tumor and spleen tissues（Mean ± SD，n = 6）

2. 3 PD-1 單抗對肝癌小鼠移植瘤生長的影響 試驗(yàn)開始時(shí)，模型組和治療組小鼠腫瘤大小無顯著差異；初次注射PD-1 單抗后，治療組小鼠腫瘤生長速度較模型組減緩；至第13 天，治療組小鼠腫瘤體積顯著小于模型組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4. 846，P < 0. 05）。見圖 4、圖 5 和表 1。

圖4 各組小鼠腫瘤組織的觀察Fig. 4 Observation of tumor tissues of mice in various groups

圖5 小鼠腫瘤生長曲線（Mean ± SD，n = 6）Fig. 5 Tumor growth curve of tumor-bearing mice（Mean ±SD，n = 6）

表1 PD-1 單抗對小鼠H22 肝癌移植瘤生長的影響Tab. 1 Effects of PD-1 McAb on growth of transplanted H22 hepatocellular carcinoma in mice

3 討 論

為了探討小鼠H22 肝癌移植瘤模型用于PD-1單抗治療腫瘤相關(guān)研究的可行性，本研究考察了該模型腫瘤組織中T 細(xì)胞浸潤、表型以及其對PD-1 單抗治療的響應(yīng)情況，結(jié)果顯示，在H22 肝癌移植瘤中有 CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞及 Tregs 浸潤，且CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞表達(dá)高水平的PD-1 分子；同時(shí)PD-1 單抗治療可抑制小鼠H22 肝癌移植瘤生長。表明小鼠H22 肝癌移植瘤模型用于PD-1 單抗治療腫瘤的研究具有可行性；同時(shí)由于H22 肝癌模型小鼠腫瘤組織中浸潤T 細(xì)胞包括CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和Tregs，推測該模型適用基于T 細(xì)胞的腫瘤免疫治療研究。

T 細(xì)胞在腫瘤組織浸潤是基于T 細(xì)胞的腫瘤免疫治療（包括 PD-1 ／ PD-L1 單抗、過繼 T 細(xì)胞療法、CTLA-4 單抗等）作用的前提，因此，本研究首先檢測了T 細(xì)胞在H22 肝癌移植瘤模型腫瘤組織中的浸潤情況。T 細(xì)胞主要由CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞組成［1］，這兩群T 細(xì)胞在腫瘤免疫中扮演著不同角色：CD8+T 細(xì)胞受抗原刺激后可分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能［14-15］；CD4+T 細(xì)胞中的輔助性T 細(xì)胞輔助CD8+T 細(xì)胞活化，具有免疫調(diào)節(jié)功能的亞群即Tregs 則參與腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成［14］，該群細(xì)胞表達(dá)高水平的 CD25 分子［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在H22 肝癌移植瘤浸潤的淋巴細(xì)胞有一部分是T 細(xì)胞，包括CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞。腫瘤組織T 細(xì)胞浸潤水平不但是基于T 細(xì)胞免疫治療的前提，而且也是判斷肝癌預(yù)后的重要指標(biāo)［17］。在本研究中，H22 肝癌組織有T 細(xì)胞浸潤，提示該模型用于PD-1 單抗治療具有可行性。此外，腫瘤組織中CD4+CD25+T 細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于脾臟組織，且該群細(xì)胞中幾乎均是Tregs［14］，也提示了在H22 肝癌組織中有大量的Tregs 浸潤。上述結(jié)果表明，H22 肝癌移植瘤模型可能適用于PD-1 單抗、CTLA-4 單抗和過繼T 細(xì)胞療法等免疫治療研究。

為了進(jìn)一步證明該模型應(yīng)用于PD-1 單抗治療的可行性，本研究還考察了腫瘤浸潤T 細(xì)胞表達(dá)PD-1分子的情況。這是由于腫瘤對PD-1 單抗治療響應(yīng)還需浸潤T 細(xì)胞表達(dá)高水平PD-1 分子，該分子也是T 細(xì)胞功能耗竭的表現(xiàn)［18-19］。一般情況下，受抗原刺激而活化的T 細(xì)胞隨后會上調(diào)以PD-1 分子為代表的多種共抑制性分子，通過這些分子的負(fù)反饋?zhàn)饔檬姑庖邞?yīng)答維持適度［20］。PD-1 分子通過與配體PD-L1 和PD-L2 結(jié)合，可誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，從而抑制T 細(xì)胞效應(yīng)功能，有利于維持自身免疫耐受［21］。但上述負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在腫瘤組織中卻能幫助腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的殺傷，這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞通過表達(dá)高水平PD-L1 分子與T 細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合產(chǎn)生抑制性信號，使T 細(xì)胞不能有效殺傷腫瘤細(xì)胞［22-23］。抗 PD-1 ／ PD-L1 單抗藥物通過阻斷表達(dá)在T 細(xì)胞表面的PD-1 與表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的配體PD-L1 結(jié)合，使T 細(xì)胞能正常識別并攻擊腫瘤細(xì)胞，即恢復(fù)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞表達(dá)PD-1分子水平明顯高于脾臟組織。有研究已報(bào)道，人肝癌腫瘤組織中T 細(xì)胞表達(dá)PD-1 分子水平顯著高于非腫瘤組織［26-27］，且腫瘤對PD-1 單抗的響應(yīng)與PD-1分子表達(dá)水平密切相關(guān)［28］。因此，本研究結(jié)果與過往研究具有高度一致性，推測該模型很可能適用于PD-1 單抗的腫瘤免疫治療研究。為了證明該假設(shè)，本研究最后考察了PD-1 單抗對H22 肝癌移植瘤生長的影響，結(jié)果顯示，PD-1 單抗干預(yù)能有效抑制肝癌小鼠移植瘤生長，即該模型對PD-1 單抗治療具有較好的響應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證明了小鼠H22 肝癌移植瘤模型可用于PD-1 單抗的肝癌免疫治療研究。此外，由于該腫瘤模型中具有較多T 細(xì)胞和Tregs浸潤，可能也適用于過繼T 細(xì)胞療法和CTLA-4 單抗等基于T 細(xì)胞的免疫療法。