靶向視黃酸（維甲酸）誘導(dǎo)基因蛋白-Ⅰ受體應(yīng)用的研究進(jìn)展

李克雷，吳星 綜述，鄭海發(fā)，梁爭(zhēng)論 審校

1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院肝炎病毒腸道病毒疫苗室，北京 102629；2. 北京民海生物科技有限公司，北京 102629

在天然免疫中，模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），包括 Toll-樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、C-型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）、NOD-樣受體（Nod-like receptors，NLRs）和視黃酸（維甲酸）誘導(dǎo)基因蛋白-Ⅰ（retinoic acid inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）等，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)模式分子，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生和促炎癥因子釋放［1］。其中，RLRs 是重要的外源核酸傳感器，可識(shí)別病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA 發(fā)揮抗病毒作用。

目前，靶向TLRs、CLRs 和NLRs 的藥物已進(jìn)入臨床研究階段或已上市，而靶向RLRs 的藥物尚還處于研究階段。RLRs 作為新的藥物靶點(diǎn)，其配體顯示了良好的應(yīng)用前景，因此，本文對(duì)靶向RLRs 的抗病毒作用及其相關(guān)應(yīng)用研究作一綜述，為新型抗病毒和腫瘤藥物及疫苗佐劑的研究提供參考。

1 RLRs 結(jié)構(gòu)

RLRs 屬于 DExD ／H 盒子 RNA 解旋酶，由 RIG-Ⅰ受體、黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differen-tiation-associated gene 5，MDA5）、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白 2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2）組成，其主要功能是識(shí)別病毒RNA，激活干擾素信號(hào)通路，進(jìn)而啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)［2-3］。

RLRs 的 3 種受體均包含 1 個(gè) DExD ／ H 盒 RNA解螺旋酶結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)C-端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD），其中，RIG-Ⅰ和 MDA5 的 N-端還有半胱天冬酶激活招募結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domain，CARD）。當(dāng) RNA 解螺旋酶和CTD識(shí)別病毒 RNA 后，RIG-Ⅰ和 MDA5 通過(guò) CARD 與下游蛋白分子線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondria anti-viral signaling protein，MAVS）相互作用傳導(dǎo)信號(hào)［4］。RLRs 的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖 1［5］。

圖1 RLRs 的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure of RLRs

2 RLRs 活化和信號(hào)傳導(dǎo)

研究顯示，多種病毒可激活RLRs，如登革病毒（Dengue virus）、腸道病毒 EV71 型（enterovirus 71）和寨卡病毒（Zika virus）等［6-8］。在病毒感染過(guò)程中，RIG-Ⅰ可識(shí)別病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的5′端三磷酸化的富含 polyU ／UC 的短鏈 dsRNA（5′ppp-dsRNA）［9-11］。一般情況下，RIG-Ⅰ的CARD 處于自我抑制狀態(tài)，當(dāng)5′ppp-dsRNA 被 RIG-Ⅰ的 CTD 識(shí)別，RIG-Ⅰ構(gòu)象發(fā)生變化，CTD 中的蓋環(huán)結(jié)構(gòu)與帶負(fù)電荷的5′端的三磷酸結(jié)合，形成螺旋酶結(jié)構(gòu)域 ／ CTD 與dsRNA的復(fù)合物，CARD 由抑制狀態(tài)釋放，與MAVS 相互作用［12］。與 RIG-Ⅰ不同，MAD5 結(jié)合長(zhǎng)的 dsRNA（＞2 000 bp），主要識(shí)別小RNA 病毒的感染，如脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒等［13］。由于RIG-Ⅰ與MAD5識(shí)別核酸序列機(jī)制的差異，麻疹病毒和VSV 等可同時(shí)活化這兩種受體［14-15］。盡管LGP2 與dsRNA 也具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，但其主要作用是調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ和MAD5 活性［16-17］。

RLRs 介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通過(guò) MAVS 蛋白傳導(dǎo)［18］。MVAS 蛋白通過(guò)自身的CARD 與RIG-Ⅰ或MAD5的CARD 相互作用后發(fā)生活化，活化的MVAS 招募腫瘤壞死因子相關(guān)受體3（tumor necrosis factor receptoras ociated factor 3，TRAF3）和絲氨酸蛋白激酶（IKKε／TBK1）復(fù)合物，IKKε ／ TBK1 復(fù)合物隨后誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子 3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和干擾素調(diào)節(jié)因子 7（interferon regulatory factor 7，IRF7）活化，進(jìn)而IRF3 和IRF7 調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅲ型干擾素產(chǎn)生。最終，干擾素通過(guò)Ⅰ型干擾素受體激活JAK-STAT 途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生大量干擾素刺激基因（interferon stimulated gene，ISGs）和促炎癥細(xì)胞因子，引發(fā)抗病毒反應(yīng)［19-20］。

3 靶向RLRs 的應(yīng)用研究

RLRs 是抗病毒免疫反應(yīng)的重要部分，因此成為抗病毒治療的靶點(diǎn)；RLRs 活化后可激活內(nèi)源和外源凋亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，因而其配體可在癌癥治療中發(fā)揮作用。RLRs 活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子可活化CD4+和CD8+，因此，RIG-Ⅰ配體可作為新型疫苗佐劑，提高疫苗的免疫效果。

3. 1 抗病毒藥物 當(dāng)前靶向RIG-Ⅰ的抗病毒藥物主要有3 類(lèi)：一類(lèi)是化學(xué)合成的二核苷酸衍生的小分子化合物，以SB9200 為代表；另一類(lèi)是病毒來(lái)源的 5′ppp-dsRNA，以 VSV 來(lái)源的 M8 為代表；還有一類(lèi)是小分子化合物，以異黃酮類(lèi)化合物為代表。

SB9200 主要治療慢性乙肝患者，具有直接抗病毒作用，也可激活宿主的抗病毒應(yīng)答。SB9200 通過(guò)與RIG-Ⅰ和NOD2 結(jié)合激活RIG-Ⅰ，并增強(qiáng)RIG-Ⅰ與 HBV 前基因組 RNA（pgRNA）的 5′-區(qū)域的結(jié)合，置換乙肝病毒聚合酶蛋白（HBV-Pol）或阻止pgRNA衣殼化和復(fù)制復(fù)合物的組裝，從而抑制HBV 的復(fù)制過(guò)程［21］。SB9200 臨床結(jié)果顯示，在單藥 12 周給藥周內(nèi)，HBV DNA 和RNA 的抑制呈顯著的劑量依賴(lài)性關(guān)系。在低劑量組SB9200 單藥治療12 周結(jié)束時(shí)，8名患者出現(xiàn)了強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)，HBV DNA水平至少減少了1 log10，HBV RNA 水平至少減少了3 log10［22］。但該藥物在Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中造成了3 名患者的嚴(yán)重副反應(yīng)［23］，因此，仍需進(jìn)一步深入研究RLRs 的抗病毒作用機(jī)制。

病毒感染過(guò)程中產(chǎn)生的5′ppp-dsRNA 是RIG-Ⅰ的特異性配體。因此，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄方法獲得的病毒來(lái)源的5′ppp-dsRNA 可特異性活化RIG-Ⅰ。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)，分別來(lái)源于水泡性口炎病毒和柯薩奇病毒B 組3 型的5′ppp-dsRNA 可有效抑制水泡性口炎病毒、VSV 在肺上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞中的復(fù)制；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5′ppp-dsRNA 可保護(hù)小鼠免受H1N1 流感病毒的致死劑量攻擊，減少小鼠肺內(nèi)的病毒滴度；與未治療組相比，25 μg 的 5′ppp-dsRNA在24 ～48 h 可顯著抑制病毒在肺部的復(fù)制，72 h后治療組的病毒滴度降低了10 倍［24-25］。且5′pppdsRNA 的序列、長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)對(duì)誘導(dǎo)RIG-Ⅰ的抗病毒活性有一定影響?；谒菪钥谘撞《镜幕蚪M序列設(shè)計(jì)的5′ppp-dsRNA，經(jīng)修飾后獲得了長(zhǎng)99 bp、富含尿苷的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列（M8），該序列通過(guò)特異性激活RIG-Ⅰ，誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFNβ 的表達(dá)量為polyI ∶C的2 倍，表明M8 可誘導(dǎo)更強(qiáng)的干擾素反應(yīng)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)5 μg M8 治療后，流感病毒感染動(dòng)物的生存率提升至 80%［26］。BEDARD 等［27］和 PATTABHI等［28］采用高通量篩選的方法篩選出的靶向RIG-Ⅰ的小分子化合物為異黃酮類(lèi)化合物，主要有KIN101、KIN1408 等。這些小分子化合物通過(guò)MVAS-IRF3的途徑誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，可有效抑制丙型肝炎病毒、流感病毒以及登革病毒的感染［29-30］。

3. 2 抗腫瘤藥物 固有免疫的核酸識(shí)別和傳感機(jī)制是引起適應(yīng)性免疫的重要介質(zhì)，cGAS、STING 和RIG-Ⅰ激動(dòng)劑已被證實(shí)是癌癥治療中的免疫腫瘤藥物［31］。其中，RIG-Ⅰ可通過(guò)多種方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［32］。

在黑色素瘤的治療研究中，將5′端三磷酸化的siRNA 作為RIG-Ⅰ激動(dòng)劑，一方面沉默抗凋亡基因Bcl2 的表達(dá)，另一方面誘導(dǎo)干擾素表達(dá)和NK 細(xì)胞活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［33］；在RIG-Ⅰ配體治療胰腺癌的小鼠模型中，RIG-Ⅰ配體通過(guò)活化DC 和CD8+T 細(xì)胞后，腫瘤體積縮小了近2 倍［34］，該過(guò)程中鈣網(wǎng)蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜外，CXCL10 分泌增加，胰腺癌細(xì)胞表面CD95 和MHC-I 的表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了CD95L 和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡作用，采用納米顆粒遞送系統(tǒng)后，可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的促炎癥因子釋放，使CD8+T 細(xì)胞的比例增加2 倍［35］。另外，RIG-Ⅰ活化引起的細(xì)胞凋亡還可通過(guò)MAVS 誘導(dǎo)促凋亡蛋白Noxa 的表達(dá)發(fā)揮作用［36］。前文提到的RIG-Ⅰ激動(dòng)劑M8 可誘導(dǎo)多種瘤細(xì)胞上的抗原表達(dá)，并引起DC 活化，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［37］。在協(xié)同免疫檢查點(diǎn)抑制劑方面，5′ppp-RNA 通過(guò)RIG-Ⅰ誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的交叉啟動(dòng)及抗腫瘤免疫依賴(lài)于宿主轉(zhuǎn)接器蛋白MAVS 和Ⅰ型干擾素（IFNⅠ）信號(hào)，協(xié)同CTLA-4 抗體阻斷誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T 細(xì)胞的擴(kuò)增和活化增強(qiáng)抗腫瘤免疫［38-39］。這些研究說(shuō)明，RIG-Ⅰ在腫瘤免疫治療中具有較大潛力的應(yīng)用前景。

3. 3 佐劑 很多靶向PRRs 的激動(dòng)劑均可作為疫苗佐劑。目前，進(jìn)入臨床階段的佐劑有 CpG、poly（I ∶C）等，已上市的佐劑有 AS01、AS04、MF59 等［40］。RLRs作為識(shí)別病毒RNA 的PRRs，活化后即可誘導(dǎo)抗病毒作用的固有免疫反應(yīng)，也可調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［41］，其配體也具有作為佐劑的應(yīng)用前景。

KIN148 可通過(guò)RIG-Ⅰ誘導(dǎo)IRF3 活化的小分子化合物，PROBST 等［42］將其與 H1N1 流感病毒制成裂解疫苗后免疫小鼠，研究KIN148 的佐劑活性。結(jié)果顯示，加入KIN148 的疫苗可保護(hù)小鼠免受致死劑量病毒的攻擊，在小鼠肺和肺淋巴結(jié)中的T 細(xì)胞可分泌大量IL-10，引起TH2 細(xì)胞應(yīng)答，小鼠的存活率提升至80%。

HOCHHEISER 等［43］比較了佐劑 CpG ODN1668、poly（I ∶C）和 5′ppp-RNA 引起細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞反應(yīng)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，5′ppp-RNA 可通過(guò)Ⅰ型干擾素信號(hào)途徑誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)，且5′ppp-RNA 比 CpG 抑制病毒感染效果更強(qiáng)。LUKE 等［44］構(gòu)建了共表達(dá) 5′ppp-RNA 和 CpG 的流感 DNA 疫苗，該疫苗進(jìn)入細(xì)胞后，可在RNA 聚合酶Ⅲ的作用下表達(dá)5′ppp-RNA，進(jìn)而活化RIG-Ⅰ，從而促進(jìn)疫苗抗原誘導(dǎo)抗HA 的中和抗體水平和免疫細(xì)胞活化程度。MARTíNEZ-GIL L 等［45］對(duì)來(lái)源于 VSV 的短鏈5′ppp-RNA（M8）的佐劑活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，將M8與流感病毒的VLP 配伍后免疫動(dòng)物。結(jié)果顯示，M8與VLP 聯(lián)合應(yīng)用可提高流感病毒感染小鼠的存活率，且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的HAI IgG 抗體滴度分別為鋁佐劑、addavax 和 poly（I ∶C）佐劑的 2 倍，且 M8 免疫小鼠后可產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)；在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫方面，M8 主要活化 TH1 細(xì)胞，鋁佐劑和addavax 活化TH2 細(xì)胞，M8 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子 IFNγ、IL-2 和 TNF-α表達(dá)水平更高；體外合成的dsRNA（仙臺(tái)病毒來(lái)源）與滅活的H1NI 流感病毒經(jīng)鼻腔或肌肉聯(lián)合免疫后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的血凝素特異性IgG 的滴度 > 1 000，為對(duì)照組的10 倍，可保護(hù)小鼠免受甲型流感病毒致死量攻擊［46］。

4 展 望

新發(fā)突發(fā)病毒性傳染病嚴(yán)重威脅公眾健康，迫切需要有效藥物和疫苗。RIG-Ⅰ激動(dòng)劑作為新的抗病毒藥物，可作為疫苗佐劑與疫苗抗原聯(lián)合使用，可提高新型疫苗的有效性。但RIG-Ⅰ激動(dòng)劑作為抗病毒藥物和疫苗佐劑在機(jī)理、制備平臺(tái)、遞送方式、安全性和有效性等方面尚存在問(wèn)題，因此，加強(qiáng)RLRs 相關(guān)研究將促進(jìn)抗病毒藥物、腫瘤治療藥物和疫苗佐劑的研發(fā)。