BC02 復(fù)合佐劑成分協(xié)同增強(qiáng)機(jī)體固有免疫應(yīng)答的分析

李軍麗，付麗麗，楊陽(yáng)，王國(guó)治，趙愛(ài)華

中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室，北京 102629

非活性抗原，尤其是純化的重組亞單位蛋白抗原，通常免疫原性較差，需要額外的組分來(lái)幫助其刺激機(jī)體形成基于抗體或效應(yīng)T 細(xì)胞功能的保護(hù)性免疫，而正是這些被稱為佐劑（adjuvant）的附加組分提供了增強(qiáng)疫苗抗原免疫原性所需的幫助。人們將佐劑加入疫苗有兩種不同的原因：首先，基于抗體效價(jià)或預(yù)防病原體感染的能力，如增加疫苗適應(yīng)性范圍［1-2］，降低抗原使用劑量并減少免疫針次等［3］；其次，引導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的類型，實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答定性改變，產(chǎn)生針對(duì)特定病原體最有效的免疫形式。如加強(qiáng)記憶T 細(xì)胞的形成［4-6］，增加免疫應(yīng)答啟動(dòng)階段的速度［7-9］，改變抗感染反應(yīng)的廣度、特異性或親和力等［9-10］。

目前，常用的佐劑包括傳統(tǒng)的弗氏佐劑、鋁鹽佐劑、MF59 佐劑、AS03 佐劑以及針對(duì)模式識(shí)別受體開發(fā)的新型佐劑CpG-DNA、Poly I：C 及單磷酰脂質(zhì)A等。隨著免疫佐劑研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用某一種佐劑，對(duì)改善抗原的反應(yīng)強(qiáng)度、免疫力維持時(shí)間、免疫耐受等作用有限，而使用復(fù)合佐劑的疫苗比使用單一佐劑的疫苗可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此，將不同類型佐劑配伍研制復(fù)合佐劑成為佐劑發(fā)展的新趨勢(shì)。然而，在人類或動(dòng)物中廣泛使用的單一或復(fù)合佐劑，大部分為經(jīng)驗(yàn)性開發(fā)，對(duì)其體內(nèi)外作用的分子機(jī)制尚不完全清楚。有研究數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)佐劑先通過(guò)接合固有免疫系統(tǒng)的組分來(lái)增強(qiáng)特異性T 和B 細(xì)胞應(yīng)答，而并非直接作用于淋巴細(xì)胞［11-13］。因此，以固有免疫應(yīng)答為切入點(diǎn)著手研究佐劑作用機(jī)制具有重要意義。

本室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合佐劑BC02（BCG CpG DNA combination adjuvant system 02）集組成成分Al（OH）3無(wú)機(jī)鹽佐劑和BC01 生物佐劑的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體形成Th1 和Th2 型免疫應(yīng)答［14-15］。此外，復(fù)合佐劑BC02 組成成分在激活小鼠巨噬細(xì)胞參與固有免疫應(yīng)答中具有協(xié)同增強(qiáng)作用［16］。本研究在前期體外細(xì)胞試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討B(tài)C02復(fù)合佐劑組成成分在誘導(dǎo)機(jī)體固有免疫應(yīng)答上的協(xié)同增強(qiáng)作用，通過(guò)對(duì)其在體內(nèi)作用的相關(guān)分子機(jī)制的深入研究以加快推進(jìn)該系列佐劑的臨床轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) C57BL ／ 6 小鼠，雌性，6 ~ 8周齡，體重18 ~ 20 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0013。本研究中涉及的所有動(dòng)物操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南，并得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1. 2 主要試劑及儀器 A（lOH）3佐劑Alhydrogel?購(gòu)自美國(guó)Invivogen 公司；BC01 生物佐劑和BC02 復(fù)合佐劑由中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗和過(guò)敏原產(chǎn)品室保存及配制；RNAlater 購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；TransScript One-Step gDNA Removal、cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒和 TransTap High Fidelity（Hifi）PCR SuperMixⅠ試劑盒購(gòu)自北京 TransGen Biotech 公司；Mouse Transcriptome Assay 2. 0基因芯片購(gòu)自美國(guó)Affymetrix 公司。

1. 3 小鼠免疫及解剖 將C57BL ／ 6 小鼠隨機(jī)分為4 組：實(shí)驗(yàn)組分別肌肉注射100 μL A（lOH）3佐劑、BC01 佐劑和BC02 復(fù)合佐劑，對(duì)照組肌肉注射等量PBS 溶液。免疫后6 h，將各組部分小鼠安樂(lè)死，解剖取腹股溝淋巴結(jié)，于-20 ℃預(yù)冷的RNAlater 溶液中保存，待分離總RNA。各組剩余小鼠分別于免疫后24、48 和72 和96 h 安樂(lè)死，解剖取右后肢內(nèi)側(cè)注射部位肌肉組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，進(jìn)行組織HE 染色和免疫熒光染色分析。

1. 4 總RNA 提取及cDNA 合成 腹股溝淋巴結(jié)經(jīng)PBS 洗滌2 次后，用 1 mL Trizol 裂解淋巴結(jié)，將裂解物與200 μL 氯仿混勻，室溫靜置3 min；4 ℃，12 000 × g 離心10 min，分離水相與有機(jī)相；吸取水相至新離心管中，將異丙醇按1 ∶1 比例加至水相中，顛倒混勻后置-20 ℃ 2 h；4 ℃，12 000 × g 離心10 min，獲得總RNA 沉淀；每管加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀 2 次，4 ℃，7 500 × g 離心 5 min；棄上清，沉淀室溫放置干燥5 ~ 10 min；溶于無(wú)RNase 水。采用 Nanodrop 分別計(jì)算 A260／280和 A260／230值，并分析純化后總RNA 的數(shù)量和質(zhì)量。cDNA 合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1. 5 基因芯片操作及數(shù)據(jù)分析 生物素標(biāo)記片段化的cDNA，用 GeneChip?Hybriding Oven 645 將標(biāo)記的cDNA 與基因芯片45 ℃雜交16 h；雜交結(jié)束后，芯片經(jīng)GeneChip?Fluidics Station 450 進(jìn)行 Streptavidinphycoerythrin 洗染，采用 GeneChip?Scanner 3000 7G和Affymetrix Command Console 軟件掃描獲取圖像?；蛐酒瑪?shù)據(jù)經(jīng)Robust Multi-Array Average（RMA）算法歸一化后，采用Partek?GenomicsSuite?對(duì)每組4 個(gè)獨(dú)立樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著差異表達(dá)基因（significantly differentially expressed gene，SDEG）使用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）軟件進(jìn)行GO 分析和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)分析。

1. 6 信號(hào)通路中富集的SDEG 的檢測(cè) 采用qPCR法。無(wú)RNase 水調(diào)平反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 模板濃度。反應(yīng)體系 20 μL：10 μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix，6. 5 μL 去離子水，3 μL 10 倍稀釋的 cDNA 模板，0. 5 μL 引物。利用Premier 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 次循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。以β-actin 為內(nèi)參基因。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 巨噬細(xì)胞吞噬功能相關(guān)基因qPCR 引物序列Tab. 1 The qPCR primer sequences for genes related to phagocytic function of macrophages

1. 7 組織病理學(xué)檢測(cè) 不同佐劑免疫小鼠解剖后，注射部位肌肉組織修塊、脫水、石蠟包埋并切成5 μm 厚度切片，經(jīng)HE 染色和免疫熒光染色后掃描載玻片保存為NanoZoomer 數(shù)字病理圖像，不同視野下拍照并分別評(píng)估注射部位炎性細(xì)胞的招募情況及細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子表達(dá)水平。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同實(shí)驗(yàn)組間差異比較采用單因素方差分析，以P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱形圖采用GraphPad Prism 8 軟件（美國(guó)GraphPad Software 公司）繪制。

2 結(jié) 果

2. 1 不同佐劑免疫后小鼠全基因組轉(zhuǎn)錄譜整體分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示，PC1、PC2 和 PC3 在 X 軸、Y 軸和 Z 軸方差的可重復(fù)性分別為28. 6%、17. 9%和8. 9%，各佐劑免疫小鼠組間數(shù)據(jù)集聚類彼此不同，組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)樣本數(shù)據(jù)集聚類緊密（圖1A）。進(jìn)一步比較不同佐劑免疫后小鼠轉(zhuǎn)錄譜總體變化，在調(diào)整原始背景信號(hào)參數(shù)后，通過(guò)One-way ANOVA 分析各微陣列中38 535 個(gè)探針的表達(dá)值并制作火山圖（圖1B、C、D）。以上下調(diào)倍數(shù)≥2 或P < 0. 05 作為閾值，分別鑒定出 542、1 154 和 1 185 個(gè) SDEG。這些 SDEG 中，相較于PBS 對(duì)照組，Al（OH）3佐劑、BC01 佐劑和BC02復(fù)合佐劑組中各有約 1. 10%（422 ／ 38 535）、2. 79%（1 077 ／ 38 535）和 2. 97%（1 143 ／ 38 535）的基因表達(dá)被上調(diào)，而有約0.31%（120／38 535）、0.20%（77／38 535）和0.11%（44／38 535）的基因表達(dá)被下調(diào)。

圖1 不同佐劑免疫后小鼠全基因組轉(zhuǎn)錄譜整體分析Fig. 1 Whole genome transcription profile of mice immunized with different adjuvants

2. 2 佐劑成分對(duì)免疫細(xì)胞活化網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用 佐劑免疫后6 h，小鼠免疫細(xì)胞活化網(wǎng)絡(luò)被明顯激活。該網(wǎng)絡(luò)中的27 個(gè)基因被富集，其中Al（OH）3佐劑顯著上調(diào)CHI3L1 和mir-15 基因表達(dá)，下調(diào)GSTP1、CCNB2、NLK、EBF1、TP53、let-7 和 mir-15 基因表達(dá)（圖 2A）。BC01 佐劑顯著上調(diào) CD14、FOS、IL1A和 Saa-3 基因表達(dá)，下調(diào) GSTP1、CCNB2、NLK、TP53、ARRB2、let-7、CD69 和 mir-15 基因表達(dá)（圖 2B）。BC02復(fù)合佐劑則在Al（OH）3佐劑和BC01 佐劑上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因的集合上，顯著上調(diào)MSR1、Ccl9、CCL2、FCER1G 和 MT-ND6 基因，并顯著下調(diào) QKI、ATM、MKI67、CRADD、PHKA2 和 ULBP1 基因（圖 2C）。

圖2 BC02 復(fù)合佐劑成分對(duì)免疫細(xì)胞活化網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用Fig. 2 BC02 compound adjuvant components synergistically enhance activation of immune cell activation network

2.3 佐劑成分對(duì)免疫細(xì)胞招募信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用 不同佐劑免疫后，免疫細(xì)胞招募信號(hào)網(wǎng)絡(luò)被顯著激活（圖3A）。BC02 復(fù)合佐劑免疫后6 h，參與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及髓樣細(xì)胞等招募相關(guān)基因 C5RA1、CCL2、CcI9、CD14、FOS、CHI3L1、CcI7、HCK、IL1A 和CD5L 被顯著上調(diào)。且與單一佐劑Al（OH）3和 BC01 相比，BC02 復(fù)合佐劑成分協(xié)同顯著增強(qiáng) CCL2、CcI9 及 HCK 基因的表達(dá)（圖 3B）。注射部位肌肉組織切片HE 染色分析及浸潤(rùn)細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子特異性熒光標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，BC02 復(fù)合佐劑注射后24 h，注射部位肌肉組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量和MHC-Ⅱ分子熒光信號(hào)強(qiáng)度高于相同時(shí)間點(diǎn)單一佐劑Al（OH）3、BC01 及PBS 對(duì)照組。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，BC02 復(fù)合佐劑組浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞數(shù)量和MHC-Ⅱ分子熒光信號(hào)強(qiáng)度均有所增加（圖4A、B）。

圖3 BC02 復(fù)合佐劑成分對(duì)免疫細(xì)胞招募信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用Fig. 3 BC02 compound adjuvant components synergistically enhance activation of immune cell recruitment signaling network

圖4 不同佐劑免疫小鼠后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)注射部位免疫細(xì)胞招募情況分析Fig. 4 Analysis of recruitment of immune cells in injection sites with different adjuvants

2. 4 佐劑成分對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的協(xié)同增強(qiáng)作用BC02 復(fù)合佐劑免疫后6 h，巨噬細(xì)胞吞噬功能信號(hào)網(wǎng)絡(luò)被顯著激活（圖5A）。與單一Al（OH）3佐劑相比，其吞噬功能相關(guān)基因CD14、CLEC6A、FCER1G、HCK、MARCO、MSR1 和 SPIC 被顯著上調(diào)，MYO5A 和SH3KBP1 基因被下調(diào)。而與BC01 佐劑相比，F(xiàn)CERIG、HCK 和 MSR1 基因被顯著上調(diào)，mir-142、mir-30 和SH3KBP1 基因被下調(diào)（圖5B），表明BC02 復(fù)合佐劑組成成分間具有協(xié)同增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能的作用。qPCR 法進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞吞噬功能相關(guān)SDEG 發(fā)現(xiàn)，BC02 復(fù)合佐劑與Al（OH）3單一佐劑比較，CD14、CLEC6A、FCER1G、HCK、MARCO、MSR1和SPIC 基因被顯著上調(diào)，且變化比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 分別為 13. 032、9. 273、17. 901、7. 791、23. 128、11. 083 和 15. 066，P 均 ＜ 0. 05）；同時(shí)，BC02 復(fù)合佐劑與Al（OH）3單一佐劑比較，MYO5A 和SH3KBP1基因被顯著下調(diào)，且變化比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為 19.157 和 21.381，P 均 ＜ 0.05）。見(jiàn)圖 6。

圖5 BC02 復(fù)合佐劑成分對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的協(xié)同增強(qiáng)作用Fig. 5 BC02 compound adjuvant components synergistically enhance phagocytic function of macrophages

圖6 巨噬細(xì)胞吞噬功能基因的的qPCR 分析Fig.6 Analysis of phagocytic function of macrophages by qPCR

2. 5 佐劑成分對(duì)腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用 不同佐劑免疫后，TNF-α 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)被激活（圖7A）。在富集到TNF-α 信號(hào)通路作用網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的42 個(gè)基因中，A（lOH）3佐劑免疫后上調(diào)其中1 個(gè)基因，下調(diào)13 個(gè)基因，BC01 佐劑免疫后上調(diào)8 個(gè)基因，下調(diào)12個(gè)基因，而復(fù)合佐劑BC02 免疫后上調(diào)20 個(gè)基因，下調(diào)22 個(gè)基因。且BC02 復(fù)合佐劑組成成分協(xié)同上調(diào)CCL2、CcI9、FCER1G、HCK、IL1RN、LIPG、MAFF、MEFV、MYL6B、RPS12 和 SLC15A3 基因表達(dá)（圖 7B）。

圖7 BC02 復(fù)合佐劑成分對(duì)TNF-α 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用Fig. 7 BC02 compound adjuvant components synergistically enhance activation of TNF-alpha signaling network

2. 6 佐劑成分對(duì)CCL2 相互作用網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用 不同佐劑免疫后，趨化因子CC 亞家族成員CCL2［單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）］相互作用網(wǎng)絡(luò)被激活（圖 8A）。在富集到CCL2 相互作用網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的49 個(gè)基因中，A（lOH）3佐劑免疫后上調(diào)其中1 個(gè)基因，下調(diào)13 個(gè)基因；BC01 佐劑免疫后上調(diào)9 個(gè)基因，下調(diào)13個(gè)基因；而復(fù)合佐劑BC02 免疫后上調(diào)24 個(gè)基因，下調(diào)25 個(gè)基因。且BC02 復(fù)合佐劑組成成分協(xié)同上調(diào)CCL2、FCER1G、FGL2、HCK、IL1RN、LIPG、MAFF、MSR1、RPL35A、RPS12、RPS14、SLC15A3、TGM1 和ZNF575 基因表達(dá)（圖 8B）。

圖8 BC02 復(fù)合佐劑成分對(duì)CCL2 相互作用網(wǎng)絡(luò)激活的協(xié)同增強(qiáng)作用Fig. 8 BC02 compound adjuvant components synergistically enhance activation of CCL2-interaction network

3 討 論

多數(shù)臨床或?qū)嶒?yàn)用途的佐劑長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答過(guò)程中充當(dāng)免疫刺激劑、抗原貯庫(kù)或被動(dòng)媒介物的角色。盡管有些佐劑本身就是固有免疫應(yīng)答的刺激成分（如細(xì)胞因子佐劑等）或繞過(guò)固有免疫應(yīng)答受體的介導(dǎo)而直接激活信號(hào)途徑（如毒素等），但大多數(shù)免疫佐劑往往均是充當(dāng)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）的配體，首先參與固有免疫應(yīng)答的激活。目前，人們對(duì)復(fù)合佐劑的研究越來(lái)越多，但在免疫增強(qiáng)效應(yīng)方面，不同復(fù)合佐劑的免疫刺激效果不同，同一復(fù)合佐劑也因佐劑成分的配比不同而在免疫效果上具有顯著差異。這一方面為復(fù)合佐劑提供了巨大的研究空間，另一方面也提醒研究者，復(fù)合佐劑成分是否存在協(xié)同增強(qiáng)作用是復(fù)合佐劑研究能否不斷深入的關(guān)鍵。

臨床批準(zhǔn)的傳統(tǒng)Al（OH）3佐劑主要通過(guò)形成抗原的長(zhǎng)效存儲(chǔ)庫(kù)或通過(guò)促進(jìn)APC 對(duì)抗原的攝取來(lái)起作用，但事實(shí)上更多的研究表明，固有免疫應(yīng)答中NLRP3 炎性體的激活以及引發(fā)細(xì)胞壞死性凋亡和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)尿酸的釋放，在Al（OH）3佐劑活性中起更主要的作用［17-19］。Al（OH）3佐劑主要誘導(dǎo)高度極化的Th2 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，幾乎所有的蛋白質(zhì)抗原均形成Th2 型細(xì)胞依賴性抗體同型反應(yīng)，但其并不依賴TLR 的存在來(lái)增強(qiáng)機(jī)體抗體的產(chǎn)生［20］。BC01 生物佐劑則是一種從減毒牛型結(jié)核分枝桿菌中提取的富含未甲基化CpG 基序的天然CpG-DNA［21］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，其通過(guò)TLR-9 受體的介導(dǎo)激活固有免疫應(yīng)答中NF-κB 和MAPKs 信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α 和MCP-1 的產(chǎn)生及增強(qiáng)細(xì)胞表面分子 MHC-Ⅱ、CD40、CD80 和 CD86 的表達(dá)［22］。此外，BC01 佐劑同Al（OH）3佐劑一起使用能夠明顯逆轉(zhuǎn)鋁佐劑誘導(dǎo)的Th2 型免疫反應(yīng)［23］，且體外細(xì)胞試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同增強(qiáng)巨噬細(xì)胞參與固有免疫應(yīng)答的作用［16］。

本研究采用全基因表達(dá)譜方法比較復(fù)合佐劑BC02 及其組成成分Al（OH）3佐劑和BC01 佐劑在免疫6 h 后對(duì)機(jī)體固有免疫應(yīng)答激活的作用，通過(guò)GO 富集和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)，BC02 復(fù)合佐劑組成成分具有協(xié)同增強(qiáng)免疫細(xì)胞活化網(wǎng)絡(luò)激活及免疫細(xì)胞招募信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活作用。含佐劑類疫苗注射后，注射部位形成局部炎癥反應(yīng)，在多種細(xì)胞因子和趨化因子的作用下，各類免疫細(xì)胞開始向注射部位浸潤(rùn)，激活抗原提呈細(xì)胞（antigen presen-ting cell，APC）并加速抗原攝取和提呈。注射部位中性粒細(xì)胞、嗜酸 ／ 堿性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)是固有免疫應(yīng)答啟動(dòng)的第一步，被招募的炎性細(xì)胞在外源物質(zhì)誘導(dǎo)下上調(diào)MHC-Ⅱ分子的表達(dá)，加速抗原片段提呈給CD4+T 細(xì)胞，從而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。病理切片分析可見(jiàn)，BC02 復(fù)合佐劑注射部位肌肉組織HE 染色和免疫組化結(jié)果均表明其對(duì)炎性細(xì)胞的招募能力顯著高于單一佐劑Al（OH）3和BC01，且該結(jié)果與上述小鼠表達(dá)譜芯片中免疫細(xì)胞活化及招募信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活相一致。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)除具有直接吞噬和殺傷病原體的功能，還具有參與抗原加工、遞呈免疫調(diào)節(jié)的重要作用，吞噬功能的變化對(duì)于判斷佐劑免疫后機(jī)體單核巨噬細(xì)胞的功能，了解機(jī)體非特性免疫狀態(tài)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，BC02 復(fù)合佐劑免疫后巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著增強(qiáng)，且效果優(yōu)于單一佐劑。此外，TNF-α 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)激活和CCL2 相互作用網(wǎng)絡(luò)激活，與前期體外細(xì)胞試驗(yàn)中BC02 復(fù)合佐劑成分協(xié)同增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活化，促進(jìn)高水平TNF-α 和MCP-1 細(xì)胞因子產(chǎn)生的結(jié)果相一致［16］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，構(gòu)成復(fù)合佐劑BC02的Al（OH）3無(wú)機(jī)鹽佐劑與BC01 生物佐劑在激活機(jī)體固有免疫應(yīng)答上具有協(xié)同加強(qiáng)作用。這些結(jié)果不僅進(jìn)一步驗(yàn)證了前期的體外細(xì)胞試驗(yàn)，而且更好地從體內(nèi)水平了解復(fù)合佐劑BC02 的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于加速該系列佐劑的臨床應(yīng)用起到重要支撐作用。