豬源牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

梁 洪 ， 王懷禹 ， 粟元文 ， 魏 玲

(南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 四川 南充 637000)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)在分類學(xué)上均屬于黃病毒科瘟病毒屬，二者的核苷酸序列同源性達(dá)60%以上，且二者存在抗原交叉性和免疫學(xué)交叉反應(yīng)性[1]。CSFV僅感染豬，我國(guó)自2007年開始采取豬瘟強(qiáng)制免疫政策，有效防止了豬瘟的大規(guī)模流行。自2017年開始，我國(guó)取消了豬瘟強(qiáng)制免疫政策，改為對(duì)符合條件的養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)行“先打后補(bǔ)”的財(cái)政補(bǔ)助政策，表明我國(guó)豬瘟防控工作取得了階段性成果，但非典型性豬瘟的感染仍時(shí)有發(fā)生，豬瘟的綜合防控仍任重道遠(yuǎn)[2-4]。BVDV主要感染牛，但其還可以感染豬、羊、鹿以及野生動(dòng)物，BVDV感染豬后可引起母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎等繁殖障礙以及仔豬消瘦、生長(zhǎng)緩慢等類似非典型性豬瘟的臨床癥狀和病理變化[5-6]。近年來(lái)，我國(guó)豬群中BVDV感染的報(bào)道不斷增多[7-9]，豬源BVDV的流行不但直接給養(yǎng)豬業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)損失，也增加了豬瘟防控工作的困難。加強(qiáng)豬源BVDV和CSFV的鑒別診斷，對(duì)豬病的整體防控至關(guān)重要，鑒于此，本試驗(yàn)根據(jù)豬源BVDV與CSFV的保守區(qū)序列分別設(shè)計(jì)特異性鑒別檢測(cè)引物，經(jīng)一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了鑒別檢測(cè)豬源BVDV與CSFV的一步法雙重RT-PCR方法，以期為豬群中這2種致病原的臨床鑒別診斷提供一種方便、快速的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，為豬源BVDV與CSFV的綜合防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 病毒 豬源牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，均由四川省南充市畜禽疫病防控與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與試劑盒 病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒，購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 分別根據(jù)豬源BVDV、CSFV基因組5′UTR序列設(shè)計(jì)2對(duì)分別擴(kuò)增豬源BVDV和CSFV的引物(引物信息見表1)，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 核酸提取 利用病毒基因組RNA/DNA共同提取試劑盒分別提取豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV(豬源BVDV和CSFV混合毒，即將豬源BVDV和CSFV等量混合)、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、PEDV、JEV、TGEV的病毒基因組RNA或DNA。

1.5 豬源BVDV一步法RT-PCR反應(yīng)條件的確定 采用設(shè)計(jì)合成的豬源BVDV檢測(cè)引物，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，對(duì)提取的豬源BVDV RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)退火溫度、模板含量、引物含量等主要參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，確定豬源BVDV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.6 CSFV一步法RT-PCR反應(yīng)條件的確定 采用設(shè)計(jì)合成的CSFV檢測(cè)引物，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，對(duì)提取的CSFV RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)退火溫度、模板含量、引物含量等主要參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，確定CSFV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.7 豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件的確定 將豬源BVDV檢測(cè)引物和CSFV檢測(cè)引物等量混合。采用混合引物，利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，對(duì)豬源BVDV/CSFV混合RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)退火溫度、模板含量、引物含量等主要參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，確定豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

1.8 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化確定的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件分別對(duì)豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、PEDV、JEV、TGEV的基因組RNA或DNA進(jìn)行檢測(cè)，確定一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn) 利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV混合RNA分別進(jìn)行濃度測(cè)定，然后利用滅菌水將3個(gè)RNA依次進(jìn)行10倍系列倍比稀釋。利用優(yōu)化確定的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件依次對(duì)不同稀釋倍數(shù)的豬源BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV混合RNA進(jìn)行檢測(cè)，確定一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 利用優(yōu)化確定的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件分別對(duì)BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV、3份豬源BVDV感染病料、3份CSFV感染病料、3份豬源BVDV和CSFV均陰性病料、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、PEDV、JEV、TGEV進(jìn)行檢測(cè)，在3個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)3次，確定一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.11 臨床應(yīng)用 采集南充及周邊地區(qū)疑似豬瘟病毒感染病料樣品94份，分別利用優(yōu)化確定的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件、優(yōu)化確定的豬源BVDV一步法RT-PCR反應(yīng)條件、優(yōu)化確定的CSFV一步法RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析南充及周邊地區(qū)豬源BVDV和CSFV的陽(yáng)性感染率，并比較分析豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法分別相對(duì)于豬源BVDV一步法RT-PCR檢測(cè)方法、CSFV一步法RT-PCR檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 豬源BVDV一步法RT-PCR反應(yīng)條件的確定 通過(guò)優(yōu)化確定最適退火溫度為51 ℃，一步法RT-PCR反應(yīng)體系最適模板含量為3 μL，最適引物含量為0.5 μL，進(jìn)而確定豬源BVDV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 12.5 μL、Step Enzyme Mix 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 5 μL、H2O 8 μL。豬源BVDV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.2 CSFV一步法RT-PCR反應(yīng)條件的確定 通過(guò)優(yōu)化確定最適退火溫度為52 ℃，一步法RT-PCR反應(yīng)體系最適模板含量為3 μL，最適引物含量為0.5 μL， 進(jìn)而確定CSFV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 12.5 μL、Step Enzyme Mix 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 5 μL、H2O 8 μL。 CSFV一步法RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.3 豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件的確定 通過(guò)優(yōu)化確定最適退火溫度為51 ℃， 最適模板含量為5 μL，最適引物含量為0.5 μL，進(jìn)而確定豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 12.5 μL、Step Enzyme Mix 0.5 μL、BVDV和CSFV上下游引物各0.5 μL、混合RNA 5 μL、H2O 5 μL。豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR的反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.4 特異性試驗(yàn) 如圖1所示，建立的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法對(duì)豬源BVDV可擴(kuò)增出1條185 bp的特異性條帶，對(duì)CSFV可擴(kuò)增出1條342 bp的特異性條帶，對(duì)豬源BVDV/CSFV可同時(shí)擴(kuò)增出185 bp和342 bp的2條特異性條帶，對(duì)PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、PEDV、JEV、TGEV均無(wú)任何擴(kuò)增條帶，均與試驗(yàn)理論預(yù)期結(jié)果相符，表明該豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法具有良好特異性。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Result of specific testM: DL-2 000 marker； 1: 豬源BVDV(BVDV from pig)； 2: CSFV； 3: BVDV/CSFV； 4: PRRSV； 5: PRV； 6: PPV； 7: PCV-2； 8: PEDV； 9: JEV； 10: TGEV

2.5 敏感性試驗(yàn) 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定豬源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV混合RNA的濃度分別為1.9 μg/μL、1.7 μg/μL、1.6 μg/μL。如圖2、圖3、圖4所示，當(dāng)豬源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV混合RNA分別稀釋至10-4、10-4、10-3倍時(shí)仍可見特異性擴(kuò)增條帶，即該一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法對(duì)豬源BVDV、CSFV、BVDV/CSFV混合RNA的檢測(cè)靈敏度分別為0.95 ng、0.85 ng、8.0 ng，表明該豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法具有良好的敏感性。

圖2 豬源BVDV敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of sensitivity test of BVDV from pigM: DL-2 000 marker； 1: RNA 10-1倍稀釋； 2: RNA 10-2倍稀釋； 3: RNA 10-3倍稀釋； 4: RNA 10-4倍稀釋； 5: RNA 10-5倍稀釋M: DL-2 000 marker； 1: RNA 10-1 dilution； 2: RNA 10-2 dilution； 3: RNA 10-3 dilution； 4: RNA 10-4 dilution； 5: RNA 10-5 dilution

圖3 CSFV敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result of sensitivity test of CSFVM: DL-2 000 marker； 1: RNA 10-1倍稀釋； 2: RNA 10-2倍稀釋； 3: RNA 10-3倍稀釋； 4: RNA 10-4倍稀釋； 5: RNA 10-5倍稀釋M: DL-2 000 marker； 1: RNA 10-1 dilution； 2: RNA 10-2 dilution； 3: RNA 10-3 dilution； 4: RNA 10-4 dilution； 5: RNA 10-5 dilution

圖4 BVDV/CSFV敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of sensitivity test of BVDV/CSFVM: DL-2 000 marker； 1. RNA 10-1倍稀釋； 2: RNA 10-2倍稀釋； 3: RNA 10-3倍稀釋； 4: RNA 10-4倍稀釋； 5: RNA 10-5倍稀釋M: DL-2 000 marker； 1: RNA 10-1 dilution； 2: RNA 10-2 dilution； 3: RNA 10-3 dilution； 4. RNA 10-4 dilution； 5: RNA 10-5 dilution

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 該方法分別在3個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)BVDV、CSFV、豬源BVDV/CSFV、3份豬源BVDV感染病料、3份CSFV感染病料、3份豬源BVDV和CSFV均陰性病料、PRRSV、PRV、PPV、PCV-2、PEDV、JEV、TGEV 3次，3次檢測(cè)結(jié)果均完全一致，表明該豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床應(yīng)用 利用豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法檢測(cè)采集于南充及周邊地區(qū)的94份疑似豬瘟病毒感染病料樣品，共檢測(cè)出豬源BVDV陽(yáng)性樣品14份，陽(yáng)性感染率為14.89%，CSFV陽(yáng)性樣品23份，陽(yáng)性感染率為24.47%，豬源BVDV/CSFV混合感染樣品5份，混合感染率為5.32%。該豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法與豬源BVDV一步法RT-PCR檢測(cè)方法、CSFV一步法RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，符合率均為100%。表明該豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法具有良好的臨床適用性。

3 討論

鑒于豬源BVDV與CSFV的抗原交叉性、免疫學(xué)交叉反應(yīng)性、引起臨床特征的高度相似性以及豬瘟對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害的嚴(yán)重性，加強(qiáng)豬源BVDV與CSFV的鑒別診斷對(duì)我國(guó)當(dāng)前豬病的整體防控尤為必要。PCR技術(shù)能夠檢測(cè)到病原體特定的核苷酸序列，且具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前動(dòng)物疫病臨床診斷和流行病學(xué)應(yīng)用最為廣泛的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，鄧宇等[10]和劉梅芬等[11]均已經(jīng)分別建立了檢測(cè)豬源BVDV、CSFV的PCR方法，但常規(guī)PCR方法只能檢測(cè)1種致病原，無(wú)法滿足豬源BVDV、CSFV的鑒別診斷。雙重PCR方法是在常規(guī)PCR方法中利用2種不同的特異性檢測(cè)引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠同時(shí)快速、準(zhǔn)確的鑒別檢測(cè)出2種致病原，且沒(méi)有改變檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)工作量的前提條件下將檢測(cè)成本減少一半，其特別適合于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。同時(shí)，由于豬源BVDV和CSFV均為RNA病毒，其在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前要將病毒核酸RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作繁瑣，增加了檢測(cè)時(shí)間，而一步法RT-PCR將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程和PCR擴(kuò)增過(guò)程在同一個(gè)體系中通過(guò)一步反應(yīng)即可完成，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和工作量。鑒于此，本試驗(yàn)將雙重PCR技術(shù)、一步法RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)引入到豬源BVDV和CSFV的鑒別檢測(cè)中，經(jīng)一步法雙重RT-PCR反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，建立了鑒別檢測(cè)豬源BVDV和CSFV的一步法雙重RT-PCR方法。該豬源BVDV和CSFV的一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法使用商品化的一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，雖然增加了檢測(cè)成本，但也大大節(jié)省了時(shí)間，減少了操作步驟，在拿到臨床樣品后3 h內(nèi)即可鑒別檢測(cè)出豬源BVDV和CSFV。

由于豬源BVDV和CSFV的核苷酸同源性非常高，增加了豬源BVDV和CSFV鑒別檢測(cè)引物設(shè)計(jì)的難度，5′UTR基因是瘟病毒中最保守的基因，成為了豬源BVDV和CSFV檢測(cè)引物設(shè)計(jì)的首選基因，故本試驗(yàn)選擇豬源BVDV和CSFV的5′UTR序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。而鑒別檢測(cè)引物要求有很好的特異性，本試驗(yàn)在分析多株豬源BVDV和CSFV 5′UTR保守區(qū)序列后，選擇二者差異序列分別設(shè)計(jì)特異性鑒別檢測(cè)引物，經(jīng)一步法RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，在分別建立豬源BVDV一步法RT-PCR方法和CSFV一步法RT-PCR方法的基礎(chǔ)上，將2種引物等量混合，通過(guò)雙重一步法RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了鑒別檢測(cè)豬源BVDV與CSFV的一步法雙重RT-PCR方法，根據(jù)擴(kuò)增片段大小的不同實(shí)現(xiàn)了豬源BVDV和CSFV的鑒別檢測(cè)。后期試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該鑒別檢測(cè)方法具有非常高的特異性，其擴(kuò)增豬源BVDV僅出現(xiàn)1條185 bp的特異性條帶，擴(kuò)增CSFV僅出現(xiàn)1條342 bp的特異性條帶，而同時(shí)擴(kuò)增豬源BVDV和CSFV可同時(shí)出現(xiàn)185 bp和342 bp的2條特異性條帶。

應(yīng)用豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法對(duì)采集于南充及周邊地區(qū)的94份疑似豬瘟病毒感染病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，豬源BVDV陽(yáng)性感染率為14.89%，CSFV陽(yáng)性感染率為24.47%，豬源BVDV/CSFV混合感染率為5.32%，表明南充及周邊地區(qū)豬群中存在豬源BVDV與CSFV的感染與流行，且同時(shí)存在豬源BVDV與CSFV的混合感染，應(yīng)引起重視。

綜上，本試驗(yàn)建立的豬源BVDV和CSFV一步法雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法可用于臨床病料樣品中豬源BVDV和CSFV的快速鑒別檢測(cè)，非常適用于一般實(shí)驗(yàn)室鑒別檢測(cè)豬源BVDV和CSFV，為基層獸醫(yī)工作者開展豬源BVDV和CSFV的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、有效的分子生物學(xué)鑒別檢測(cè)方法，為我國(guó)豬源BVDV和CSFV的有效防控提供了技術(shù)支持。