外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌中的作用研究進展

萬雪，葉婷，李婧媛，馮佳，謝丹，劉靳波

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗部，四川瀘州 646000

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率在女性癌癥中均位居第一[1]。盡管乳腺癌治療策略不斷更新且靶向藥物不斷開發(fā)，但因具有高度異質性，乳腺癌患者的長期生存率依然較低[1-2]。因此，進一步探討乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制[3]，以及開發(fā)用于早期診斷及預后評估的生物標志物，對早期防治乳腺癌、提高患者生存質量有重要意義。

外泌體是一種直徑為30～150 nm的脂質雙層小泡，由腫瘤細胞、干細胞及其他正常細胞釋放，通常存在于體液中，其內包含多種生物活性物質如蛋白質、代謝產物、DNA、mRNA及非編碼RNA等[4]。外泌體被認為是一種重要的胞間通信介質，它作為“轉運載體”能將內容物從原發(fā)腫瘤細胞轉移至微環(huán)境及遠處器官，促進腫瘤的侵襲及轉移[5-6]。由于外泌體具有自我保護功能，能避免其活性物質在血液運輸過程中被降解，因此，它也是腫瘤的候選生物標志物[5]。近年來研究顯示，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體介導的核酸分子具有重要作用，其中微小RNAs(microRNAs，miRNAs)及長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)是關鍵的影響因子。miRNAs及l(fā)ncRNAs通過外泌體在轉錄、轉錄后及表觀遺傳水平上調節(jié)基因的表達，進而調控細胞生物信號[1]。

外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌領域中的研究涉及腫瘤基因表達、腫瘤微環(huán)境變化、抗腫瘤藥物耐藥及腫瘤生物標志物等方面。本文針對外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，以及其作為乳腺癌生物標志物的研究進展進行綜述。

1 外泌體miRNAs在乳腺癌中的作用

miRNAs是長度為18～24 nt的高度保守的非編碼序列，與RNA誘導沉默復合物結合靶向mRNAs，調控基因的表達[5]。在乳腺癌外泌體研究中，外泌體介導的miRNAs通過靶向相關蛋白、激活信號通路參與乳腺癌細胞侵襲轉移、調控腫瘤微環(huán)境，以及促進乳腺癌細胞耐藥(圖1)。

圖1 外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌中的功能Fig.1 The functions of exosomal miRNAs and lncRNAs in breast cancer

1.1 腫瘤來源外泌體miRNAs在乳腺癌中的作用

1.1.1 在乳腺癌侵襲轉移中的作用 Singh等[7]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-10b在人乳腺癌MDA-MB-231細胞中高表達；將MDA-MB-231細胞與HMLE細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，miR-10b可通過外泌體轉移至HMLE細胞，增強HMLE細胞的侵襲能力，表明乳腺癌細胞外泌體miRNAs能增強正常乳腺細胞的侵襲作用。Ding等[8]發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-222在乳腺癌淋巴結轉移患者中高表達；進一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導miR-222抑制PDZ與LIM結構域蛋白2(PDZ and LIM domain protein 2，PDLIM2)表達，激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，促進乳腺癌細胞的侵襲及轉移。Fong等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-122在乳腺癌細胞外泌體中高度富集，并可通過外泌體轉移至轉移前微環(huán)境細胞(包括肺成纖維細胞、腦星形膠質細胞)，抑制其丙酮酸激酶表達，減少對葡萄糖的消耗，使乳腺癌細胞獲得更多葡萄糖，從而促進乳腺癌細胞轉移，提示腫瘤來源外泌體miRNAs可促進乳腺癌細胞的侵襲及轉移。O‘Brien等[10]報道，miR-134在三陰性乳腺癌組織及血清外泌體中表達降低，MDA-MB-231細胞表達的外泌體miR-134通過調節(jié)STAT5B/HSP90信號通路減少三陰性乳腺癌細胞的侵襲及遷移，提示腫瘤來源外泌體miRNAs也可抑制乳腺癌細胞的侵襲及轉移。因此，腫瘤細胞外泌體miRNAs可作為促癌基因及抑癌基因參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

1.1.2 在微環(huán)境中的作用 腫瘤微環(huán)境由細胞外基質及基質細胞組成，基質細胞包括間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、免疫細胞、內皮細胞及脂肪細胞等。近年來研究表明，腫瘤來源外泌體miRNAs在腫瘤微環(huán)境的建立中起重要作用。

乳腺癌細胞外泌體miRNAs通過調控CAFs發(fā)揮促癌作用。Yan等[11]發(fā)現(xiàn)，MYC原癌基因蛋白(MYC proto-oncogene protein，MYC)可誘導MDAMB-231細胞分泌外泌體miR-105。CAFs與MDAMB-231細胞來源外泌體共培養(yǎng)后，外泌體miR-105可抑制CAFs中MAX相互作用蛋白1(MAX-interacting protein 1，MXI1)的表達，激活MCY信號，誘導代謝重編程，促進乳腺癌細胞的生長。Baroni等[12]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞通過外泌體將miR-9轉移至成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)，誘導NFs出現(xiàn)CAFs樣表型，促進乳腺癌細胞的侵襲、轉移。外泌體miRNAs也參與對內皮細胞的調節(jié)。Kosaka等[13]將乳腺癌細胞外泌體與內皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)miR-210可通過外泌體轉移到內皮細胞，促進腫瘤血管形成及乳腺癌細胞的轉移。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細胞外泌體miR-105可抑制內皮細胞中緊密連接蛋白-1(ZO-1)的表達，破壞內皮細胞的屏障功能，從而促進乳腺癌細胞轉移。此外，乳腺癌細胞外泌體miR-144及miR-126也可與脂肪細胞相互作用。外泌體miR-144通過調節(jié)MAP3K8/ERK1/2/PPARγ信號途徑促進脂肪細胞向米色/棕色脂肪細胞表型分化，外泌體miR-126通過阻斷脂肪細胞IRS/Glut-4信號通路激活AMPK/自噬通路并誘導低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達，共同促進脂肪細胞的分解代謝，誘導腫瘤生長[15]。由此可見，腫瘤細胞可通過分泌外泌體miRNAs調控腫瘤微環(huán)境，以利于自身的生長、侵襲及轉移，在腫瘤的惡性轉化過程中發(fā)揮重要作用。

1.1.3 參與乳腺癌細胞對藥物的耐藥性 盡管化療藥物被廣泛應用于乳腺癌的治療，但持續(xù)接觸化療藥物不可避免地會導致獲得性耐藥。外泌體作為核酸的載體，參與核酸的傳遞，在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。Wei等[4]首次發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs可參與癌細胞耐藥性的傳播。耐他莫昔芬MCF7細胞外泌體進入他莫昔芬敏感的MCF7細胞中，能釋放miR-221/222，抑制p27及雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)的表達，促進MCF7細胞對他莫昔芬耐藥[4]。Santos等[16]從乳腺癌阿霉素耐藥株及紫杉醇耐藥株中分離出富含miR-155的外泌體，這些外泌體與敏感乳腺癌細胞共培養(yǎng)后，可增強后者對這些化療藥的耐藥性。此外，Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，將耐順氯氨鉑MDA-MB-231細胞的外泌體miR-423-5p轉移到其他乳腺癌細胞中，能改變其他乳腺癌細胞對順氯氨鉑的敏感性。總之，耐藥腫瘤細胞可介導外泌體傳遞miRNAs至敏感細胞中，引起敏感細胞耐藥，從而導致治療失效。

1.2 腫瘤微環(huán)境來源外泌體miRNAs在乳腺癌中的作用 外泌體作為細胞間信息傳遞的媒介，在腫瘤細胞及微環(huán)境調節(jié)中具有雙向作用。不僅腫瘤細胞外泌體miRNAs作用于微環(huán)境細胞，腫瘤微環(huán)境細胞外泌體miRNAs也可作用于乳腺癌細胞。

MSCs與腫瘤血管形成有關。MSCs外泌體miR-100轉移到乳腺癌細胞后，可調節(jié)mTOR/HIF-1α信號通路，減少血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，從而抑制腫瘤血管的生成[18]。CAFs主要源于NFs，參與乳腺癌的發(fā)生、血管形成及上皮-間質轉化[19]。外泌體miR-21、miR-378e及miR-143在CAFs中高表達，乳腺癌細胞攝取CAFs外泌體miRNAs后，可促進乳腺癌細胞的上皮-間質轉化及腫瘤干細胞特性[19]。Kim等[20]發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-4516在浸潤性導管癌的CAFs中低表達。乳腺癌細胞過表達外泌體miR-4516后，可通過下調FOS樣抗原1(FOS like antigen 1，F(xiàn)OSL1)抑制乳腺癌細胞增殖。TAMs是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫相關細胞[21]。將TAMs與乳腺癌細胞共培養(yǎng)后，可檢測到乳腺癌細胞存在TAMs外泌體特異性miR-223，后者可通過激活Mef2c/β-catenin信號通路促進乳腺癌細胞的侵襲[21]。上述研究均說明，乳腺癌細胞可通過攝取微環(huán)境細胞外泌體miRNAs調控靶基因或激活相關信號通路，從而參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

2 外泌體lncRNAs在乳腺癌中的作用

LncRNAs是一種長度超過200 nt的RNAs，通常充當競爭性內源RNAs或RNA海綿，參與各種生理及病理過程[1]。外泌體lncRNAs在乳腺癌細胞的轉移、增殖、凋亡、調控腫瘤微環(huán)境及促進乳腺癌細胞耐藥方面發(fā)揮了重要作用(圖1)。

2.1 腫瘤來源外泌體lncRNAs在乳腺癌中的作用

2.1.1 在乳腺癌轉移、增殖及凋亡中的作用 有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNA GS1-600G8.5在腦轉移乳腺癌細胞中高表達，并可通過下調ZO-1表達破壞血腦屏障，促進乳腺癌細胞的腦轉移[22]。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在乳腺癌中高表達，并可通過外泌體包裹傳遞給乳腺癌細胞，促進乳腺癌細胞的增殖。Koldemir等[24]的研究表明，外泌體lncRNA GAS5是誘導凋亡的標志物，用紫杉醇及博來霉素處理乳腺癌細胞后，能誘導乳腺癌細胞高表達外泌體GAS5，促進乳腺癌細胞凋亡。因此，乳腺癌細胞可通過外泌體lncRNAs發(fā)揮促癌及抑癌作用。

2.1.2 在微環(huán)境中的作用 腫瘤來源外泌體lncRNAs與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞有關。乳腺癌細胞外泌體lncRNA BCRT1與巨噬細胞共培養(yǎng)后，可促進巨噬細胞M2型極化，增強乳腺癌細胞的遷移及血管生成能力[25]。γδ T細胞是腫瘤浸潤淋巴細胞的主要成分，與乳腺癌的病理學特征及預后不良密切相關[26]。γδ1 T細胞攝取乳腺癌細胞外泌體lncRNA SNHG16后，可通過與miR-16-5p相互作用激活TGF-β1/SMAD5通路，誘導γδ1 T細胞表達CD73，使其轉變成CD73+γδ1 T細胞，從而抑制機體免疫功能，促進腫瘤生長[26]。由此可見，腫瘤細胞外泌體lncRNAs可作為免疫細胞的誘導劑促進乳腺癌的生長與轉移。

2.1.3 參與乳腺癌細胞對藥物的耐藥性 在耐曲妥珠單抗乳腺癌細胞株中，lncRNA SNHG14通過Bcl-2/Bax信號通路促進曲妥珠單抗耐藥，然后SNHG14經耐藥細胞株分泌的外泌體包裹，轉移至敏感細胞中，促使敏感細胞耐藥[27]。Han等[28]也發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA AFAP1-AS1參與了乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1通過AU結合因子1(AU-binding factor 1，AUF1)啟動ERBB2 mRNA翻譯，促進人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)表達，誘導敏感株對曲妥珠單抗耐藥。類似研究還包括，lncRNA UCA1[29]及l(fā)ncRNA H19[30]通過外泌體參與乳腺癌細胞對他莫昔芬及阿霉素的耐藥?？傊?，耐藥腫瘤細胞可利用外泌體將lncRNAs傳遞給敏感的乳腺癌細胞，誘導其對化療產生耐受。

2.2 腫瘤微環(huán)境細胞來源外泌體lncRNAs在乳腺癌中的作用 近來有研究表明，腫瘤微環(huán)境細胞來源外泌體lncRNAs也可以影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。研究人員發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞可攝取CAFs分泌的外泌體lncRNA SNHG3，而SNHG3能充當miR-330-5p的內源性競爭RNA，增加乳腺癌細胞丙酮酸激酶的表達，抑制線粒體氧化磷酸化，增強糖酵解過程，從而促進乳腺癌細胞的增殖[31]，提示腫瘤細胞外泌體攝取微環(huán)境細胞外泌體lncRNAs后，可將后者作為內源性RNA發(fā)揮其生物作用，參與乳腺癌細胞的增殖。

3 外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs作為乳腺癌的生物標志物

由于外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs具有高度穩(wěn)定性及富集性，而且外泌體的脂質雙分子層結構能保護miRNAs及l(fā)ncRNAs在血液循環(huán)中不被核糖核酸酶降解，因此外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs可作為疾病的候選生物標志物。近來研究表明，外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs可作為乳腺癌診斷及預后評估的生物標志物，對臨床早期治療、減少復發(fā)、改善預后具有重要意義(圖2)。

圖2 可作為乳腺癌診斷及預后評估標志物的外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAsFig.2 Exosomal miRNAs and lncRNAs used as biomarkers for diagnosis and prognosis of breast cancer

3.1 外泌體miRNAs 乳腺癌患者血液中外泌體miRNAs作為潛在的生物標志物已被廣泛研究。Hannafon等[32]比較了16例乳腺癌患者與16例健康對照的血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-1246及miR-21在乳腺癌患者血漿外泌體中顯著升高，兩者聯(lián)合測定診斷乳腺癌的受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.73，提示其可能是輔助乳腺癌診斷的指標。Li等[33]分析了32例乳腺癌患者與32例健康對照的血漿、血清外泌體中來自miR-106a-363簇的12個miRNAs，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血漿外泌體中miR-106a-3p、miR-106a-5p、miR-20b-5p、miR-92a-2-5p及血清外泌體中miR-106a-5p、miR-19b-3p、miR-20b-5p、miR-92b-3p均明顯高于對照組，提示這些血漿及血清外泌體miRNAs可能成為乳腺癌診斷的新型標志物。Eichelser等[34]通過研究50例乳腺癌患者與12例健康對照者發(fā)現(xiàn)，miR-101、miR-372及miR-373在血清外泌體中的表達量高于血清中的表達量，乳腺癌患者血清外泌體中miR-101及miR-372的表達量明顯高于對照組，兩組miR-373表達量無明顯差異，對乳腺癌分子亞型進一步分析發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌患者外泌體miR-373高于Luminal A、B型乳腺癌患者及對照組。該研究提示外泌體miR-101及miR-372可能是乳腺癌診斷的生物標志物，外泌體miR-373可能是三陰性乳腺癌診斷的生物標志物。有Meta分析發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-340-5p、miR-17-5p、miR-130a-3p、miR-93-5p與乳腺癌的復發(fā)及遠處器官轉移相關，提示這些外泌體miRNAs對乳腺癌患者的預后判斷具有良好的參考價值[35]。

3.2 外泌體lncRNAs 相關研究發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNAs也可作為理想的乳腺癌診斷及預后評估生物標志物。Zhong等[36]比較了乳腺癌患者、乳腺良性疾病患者與健康對照者外泌體的lncRNA H19表達情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在乳腺癌患者中高表達，其AUC為0.870，高于CA153及CEA的AUC(分別為0.822、0.811)，lncRNA H19、CA153與CEA三者聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的AUC更高(0.845)，提示外泌體lncRNA H19可能是診斷乳腺癌的新型標志物。Tang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體lncRNA HOTAIR在乳腺癌患者血清中呈高表達，其AUC為0.918，明顯高于CA153的AUC(0.738)；此外，lncRNA HOTAIR高表達與乳腺癌患者生存率低及行新輔助化療對他莫昔芬反應不佳有關。Wang等[38]也發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體HOTAIR的表達與HER2陽性呈正相關，HER2能促進HOTAIR表達，增加外泌體HOTAIR的數量，提示外泌體HOTAIR可能是診斷HER2陽性乳腺癌的敏感生物標志物，也可能是評估乳腺癌患者化療效果的指標。

4 總結與展望

外泌體作為重要的細胞信息傳遞媒介，其內容物miRNAs及l(fā)ncRNAs在調控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥等過程起關鍵作用。外泌體不僅在體液中含量豐富，而且可保護自身攜帶的miRNAs及l(fā)ncRNAs不被降解，使外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs可作為腫瘤標志物用于乳腺癌的診斷及預后評估。此外，由于miRNAs及l(fā)ncRNAs可通過外泌體在癌細胞與正常細胞、癌細胞與癌細胞、癌細胞與微環(huán)境細胞之間進行轉移，針對這些外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs開發(fā)新型抗癌靶向藥物可能是乳腺癌治療的新方向。

雖然國內外研究對外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌中所表現(xiàn)的功能及生物特性日趨明確，但外泌體的分離、純化、鑒定方法復雜、費時、價高，使外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在臨床上的應用受到了限制。因此，探索簡便、經濟、快速的方法技術勢在必行。盡管血液外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs在乳腺癌中的臨床意義得到了初步探索，但大多數處于基礎研究階段，且規(guī)模較小，缺乏大樣本及多中心研究驗證?？傊鞔_外泌體miRNAs及l(fā)ncRNAs參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機制，有助于尋找新型生物標志物并研究出帶有保護性miRNAs及l(fā)ncRNAs的外泌體，為乳腺癌的診斷及治療提供新方向。