Ⅳ型膠原與腎臟疾病

汪 卿 綜述 俞曉敏 審校

Ⅳ型膠原是一種基膜中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,相互連接的Ⅳ型膠原是腎小球基膜(GBM)中的主要結(jié)構(gòu)成分,對(duì)維持腎小球?yàn)V過屏障的功能有著重要的作用[1]。Ⅳ型膠原相關(guān)的基因突變會(huì)破壞GBM形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性,進(jìn)而導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展。隨著基因檢測技術(shù)的進(jìn)步,特別是新一代測序技術(shù)(NGS)的廣泛應(yīng)用, 越來越多的研究拓展了Ⅳ型膠原基因的突變以及與其相關(guān)的腎臟疾病譜之間的關(guān)系。本文就Ⅳ型膠原基因突變導(dǎo)致相關(guān)腎臟疾病的研究進(jìn)行綜述,揭示Ⅳ型膠原相關(guān)基因突變的臨床表型圖譜的演變及對(duì)臨床的意義。

Ⅳ型膠原在GBM的結(jié)構(gòu)組成及功能

目前已經(jīng)證實(shí)有6種α鏈(α1-α6)參與組成了Ⅳ型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),編碼α1、α2鏈的COL4A1、COL4A2基因位于染色體13q34上,編碼α3、α4鏈的COL4A3、COL4A4基因位于染色體2q35-37,而編碼α5、α6鏈的COL4A5、COL4A6基因位于X常染色體Xq22[1]。每條α鏈由三部分組成:由甘氨酸-X-Y重復(fù)序列組成的膠原結(jié)構(gòu)域、N端的7S結(jié)構(gòu)域以及C端的非膠原結(jié)構(gòu)域(NC1)[1]。Ⅳ型膠原的形成從α鏈NC1相互纏繞形成三聚體開始并終止于7S結(jié)構(gòu)域的結(jié)合完成。理論上6種α鏈相互纏繞可形成多種三聚體,然而NC1的結(jié)合具有一定的選擇性。根據(jù)序列的相似性,6條α鏈可以分為α1型鏈(α1,α3,α5)和α2型鏈(α2,α4,α6)[2]。目前發(fā)現(xiàn)的α鏈三聚體存在的三種組合形式(α1α1α2,α3α4α5,α5α5α6)均為兩種α1型鏈與一種α2型鏈組成。而由一種α1型鏈與兩種α2型鏈組成的三聚體,因?yàn)榭臻g位阻效應(yīng),蛋白結(jié)構(gòu)不能穩(wěn)定存在。

Ⅳ型膠原三聚體的互相連接對(duì)維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)單元的穩(wěn)定性有著重要的作用(圖1)[3]。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)單元始于NC1的結(jié)合,α1α1α2鏈和α3α4α5鏈均可與同源三聚體連接,而α5α5α6鏈不能和自身相結(jié)合,只能與α1α1α2鏈相結(jié)合。因此目前存在三種NC1的結(jié)合方式,分別為α1α1α2-α1α1α2,α3α4α5-α3α4α5以及α1α1α2-α5α5α6。氯離子在NC1的結(jié)合過程中有重要的作用,有實(shí)驗(yàn)證實(shí)氯離子缺失會(huì)影響NC1結(jié)合和Ⅳ型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成[4]。而NC1主要通過其域內(nèi)的甲硫氨酸殘基和羥賴氨酸殘基結(jié)合形成硫亞胺鍵相互連接[5],硫亞胺鍵生成過程中需要離子溴化物和過氧化物酶的催化。相互結(jié)合的NC1之間可以形成1個(gè)或2個(gè)硫亞胺鍵,因此一個(gè)NC1六聚體最多可以存在6個(gè)硫亞胺鍵。動(dòng)物研究證實(shí)過氧化物酶缺失或缺乏溴化物飲食造成硫亞胺鍵形成障礙會(huì)導(dǎo)致基膜結(jié)構(gòu)異常和相應(yīng)器官發(fā)育障礙[6]。在過氧化物酶敲除硫亞胺鍵減少的小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)腎小管基膜的結(jié)構(gòu)硬度下降[7],提示Ⅳ型膠原內(nèi)硫亞胺鍵對(duì)維持基膜機(jī)械性功能有著重要的作用。每四條α鏈7S端通過賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)的調(diào)節(jié)相互結(jié)合形成十二聚體。7S端富含較多的半胱氨酸及賴氨酸殘基,其十二聚體的穩(wěn)定性主要靠α鏈三聚體內(nèi)部和彼此之間的二硫鍵以及羥基賴氨酸交聯(lián)來維持。α3鏈和α4鏈的7S端中有更多的半胱氨酸[8],因此富含更多二硫鍵的α3α4α5鏈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比α1α1α2鏈更加穩(wěn)固,難以被蛋白酶水解。

圖1 Ⅳ型膠原在基膜上的結(jié)構(gòu)與組成[3]

Ⅳ型膠原各亞型間的生化特性和特定細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路導(dǎo)致了不同的生物學(xué)功能。Ⅳ型膠原的NC1端和膠原域通過整合素和非整合素受體與細(xì)胞表面結(jié)合,α1的NC1與整合素α1β1結(jié)合,α2的NC1與整合素αvβ3、αvβ5、α3β1結(jié)合,α3和α6的NC1與整合素αvβ3結(jié)合[8]。α1α1α2膠原域包含整合素α1β1和α2β1的結(jié)合位點(diǎn),借此調(diào)節(jié)與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移。Ⅳ型膠原同樣可以與盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)結(jié)合。通過與特異性受體的結(jié)合,Ⅳ型膠原各種α鏈行使了不完全相同的功能。例如α1鏈和α5鏈均屬于α1型鏈,但在肺癌患者發(fā)現(xiàn)只有α5鏈的缺失會(huì)造成肺癌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中DDR1表達(dá)的下降[9],α5鏈與DDR1的相互作用是激活DDR1及其下游信號(hào)通路的關(guān)鍵,因此可以認(rèn)為DDR1是α5鏈的特異性受體。Ⅳ型膠原每條α鏈中膠原域的甘氨酸-X-Y重復(fù)序列有一定數(shù)目的中斷[8]。這些中斷點(diǎn)不僅保證了Ⅳ型膠原的彈性,還可以作為鏈與鏈、或鏈與細(xì)胞受體之間的結(jié)合點(diǎn)。和α1鏈(21個(gè))相比,α4鏈(26個(gè))和α6(25個(gè))鏈具有較多的膠原區(qū)中斷點(diǎn),因此α3α4α5鏈和α5α5α6鏈擁有比α1α1α2鏈更強(qiáng)的結(jié)合性能。

Ⅳ型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并不是靜態(tài)結(jié)構(gòu),存在動(dòng)態(tài)重塑的生理過程。在GBM中發(fā)現(xiàn)α1α1α2鏈存在于內(nèi)皮下而α3α4α5鏈存在于上皮側(cè),α1α1α2鏈降解并被α3α4α5鏈替換為是腎臟發(fā)育過程中一個(gè)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)變。在缺乏α3鏈或α5鏈的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)α1α1α2鏈在腎臟中未被降解,持續(xù)存在。在正常的腎臟中,有少量的α1α1α2鏈局限存在于GBM內(nèi)皮下,在缺乏Ⅳ型膠原α3鏈的腎組織中α1α1α2鏈廣泛分布于GBM兩側(cè)[10]。雖然α1α1α2鏈能夠替代α3α4α5鏈的不足組成Ⅳ型膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)單元,但由于不同亞型間的結(jié)構(gòu)與功能的差異,α1α1α2鏈不能夠完全代償因α3α4α5鏈缺乏導(dǎo)致的IV膠原在腎臟中的功能缺失,進(jìn)而引發(fā)了一系列腎臟病。

Ⅳ型膠原基因突變相關(guān)疾病

Alport綜合征Alport綜合征是一種臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿和腎功能不全并常常伴有高頻聽力的喪失以及眼部病變的進(jìn)展性遺傳性疾病[11]。Ⅳ型膠原COL4A3/4/5基因突變?cè)斐搔?α4α5鏈的結(jié)構(gòu)功能異常是Alport綜合征的主要病因。電鏡下GBM的厚薄不一、斷裂分層是此病的典型特征性病理改變。既往根據(jù)遺傳方式的不同,Alport綜合征主要分為三類:COL4A5基因突變引起的X染色體連鎖遺傳(XLAS),COL4A3/4基因突變引起的常染色體隱性遺傳(ARAS)和常染色體顯性遺傳(ADAS)[12]。XLAS男性患者臨床癥狀較重,COL4A5基因型與XLAS男性患者進(jìn)展至終末期腎病(ESRD)的年齡相關(guān)聯(lián),無義突變和造成蛋白截短的剪接突變比攜帶錯(cuò)義突變的患者病情更重,進(jìn)展至ESRD的時(shí)間更早[13]。對(duì)XLAS女性患者大樣本臨床觀察研究表明,XLAS女性患者臨床表型復(fù)雜多變,并且未發(fā)現(xiàn)明顯的基因型-表型關(guān)聯(lián),可能多種不同的機(jī)制共同決定了XLAS女性患者疾病嚴(yán)重程度[14]。與XLAS男性患者相似,ARAS患者表型嚴(yán)重,進(jìn)入ESRD的年紀(jì)較小(20歲左右),基因型-表型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)攜帶非錯(cuò)義突變的患者比攜帶錯(cuò)義突變的患者預(yù)后更差[15]。攜帶COL4A3/4基因雜合突變的ADAS患者較為少見,表型較輕,進(jìn)展至ESRD的速度慢,病變可以局限于腎臟,缺乏其他臨床表現(xiàn)。

既往研究認(rèn)為近85%的Alport綜合征為XLAS,ARAS占Alport綜合征全部的15%左右,ADAS僅僅占1%左右。隨著近年來基因測序技術(shù)在臨床診斷中的廣泛應(yīng)用,研究表明,實(shí)際由COL4A3/4基因突變導(dǎo)致的Alport綜合征比例更多,特別是ADAS患者的比例達(dá)到了接近30%[16-17]。因此仍需要較大樣本的研究來證實(shí)三類Alport綜合征的比例。另外Mencarelli等[18]報(bào)道了COL4A3/4/5雙基因致病的病例,提示Alport綜合征中存在雙基因致病的遺傳模式。家系共分離分析提示雙基因遺傳的Alport主要分為三種:(1)常染色體基因(COL4A3/4)上分別來自于父母的兩個(gè)突變,臨床表型與ARAS相似;(2)常染色體基因(COL4A3/4)來自于父親或母親的兩個(gè)突變,臨床表型與ADAS相似;(3)分別來自于父母的常染色體基因(COL4A3/4)和X染色體基因(COL4A5)上的突變,臨床表型不明。目前雙基因致病案例報(bào)道較少,無法歸納此類患者的特點(diǎn),有待進(jìn)一步的觀察和研究。因此,根據(jù)近年來的研究進(jìn)展，Alport綜合征被重新分為X連鎖型、常染色體型以及雙基因型三類(表1)[19]。

表1 Alport綜合征的分型[19]

Alport綜合征尚無特效治療手段,首要治療目標(biāo)仍然為延緩疾病的進(jìn)展。Alport綜合征的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)可以降低蛋白尿的水平,延長患者進(jìn)展至ESRD的時(shí)間,延緩腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)展[20]。在錯(cuò)義突變的Alport綜合征患者中,ACEI/ARB延緩患者進(jìn)展至ESRD的時(shí)間長達(dá)20年以上[13]。甚至在尚未出現(xiàn)明顯蛋白尿的Alport兒童中,ACEI/ARB也可延緩疾病進(jìn)展,并未出現(xiàn)明顯的藥物不良反應(yīng)[21]。以上研究提示,通過基因測序等無創(chuàng)手段盡早明確Alport患者的診斷,及時(shí)運(yùn)用藥物干預(yù),對(duì)臨床上Alport綜合征的管理有重要的指導(dǎo)作用。短期FK506治療也能夠能改善Alport綜合征患者的蛋白尿及低白蛋白血癥,兒童患者療效可能優(yōu)于成年患者,且成年患者發(fā)生不良反應(yīng)的概率也可能較高[22]。Wang等[23]已經(jīng)成功構(gòu)建攜帶患者相同突變的Alport綜合征類器官模型,為進(jìn)一步的疾病機(jī)制和藥物篩選研究提供了有力的工具。目前也已經(jīng)開展了基因治療的相關(guān)研究,應(yīng)用外顯子跳躍技術(shù)可以在攜帶截短突變的嚴(yán)重表型XLAS小鼠中恢復(fù)腎臟基膜區(qū)域α5鏈的表達(dá),重新組成了Ⅳ型膠原三聚體,明顯緩解了病變小鼠的臨床病理癥狀[24]。

薄基膜腎病(TBMN)攜帶COL4A3/4/5基因突變的一部分患者腎組織活檢電鏡下僅可見到GBM變薄(成人GBM厚度<250 nm,2～17歲兒童<180 nm),無明顯斷裂分層,故而根據(jù)其病理改變被稱為TBMN。COL4A3/4基因雜合突變是導(dǎo)致TBMN的一個(gè)重要原因[25]。典型的TBMN大多數(shù)無明顯進(jìn)展性病變,僅僅表現(xiàn)為孤立性血尿。然而Alport綜合征的患者在疾病早期時(shí)也可以表現(xiàn)為TBMN樣病變。此外,在診斷為TBMN攜帶COL4A3/4突變的患者中,長期隨訪的結(jié)果表明會(huì)出現(xiàn)蛋白尿以及其他類似Alport綜合征的臨床表現(xiàn)。一項(xiàng)針對(duì)COL4A3/4基因突變的META分析結(jié)果顯示,攜帶COL4A3/4基因雜合突變的患者中,15.1%的患者在平均52.8歲時(shí)進(jìn)展至ESRD[26],由此可見不能簡單認(rèn)為TBMN是一種良性病變。但與Alport綜合征相比,攜帶COL4A3/4基因雜合突變的腎外臨床癥狀表現(xiàn)較少,如明顯的聽力下降等。攜帶COL4A3/4雜合突變的父母,子女出生攜帶純合突變的概率為25%,可以表現(xiàn)為典型的Alport綜合征。攜帶COL4A5突變的母親也同樣有50%的幾率孕育表型更為嚴(yán)重的男性XLAS患者。即使在同一個(gè)家系中,TBMN和Alport均可能同時(shí)存在,因此TBMN與Alport綜合征不能完全割裂成兩個(gè)不同的疾病。相較于傳統(tǒng)的臨床病理診斷,分子診斷可以幫助明確TBMN患者的病因,排查家系中是否存在尚未出現(xiàn)臨床表型的突變攜帶者,指導(dǎo)早期防治。

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)FSGS是以部分腎小球節(jié)段硬化為特征的病理形態(tài)學(xué)診斷,電鏡下可以看到廣泛的足突融合。FSGS患者的臨床表現(xiàn)并不完全相同,一部分患者癥狀較重治療效果較差,傳統(tǒng)的激素治療對(duì)其無效,也被稱為激素抵抗型腎病綜合征(SRNS)。FSGS是不同病因?qū)е碌耐环N病理改變,并不是單一疾病。各種原因?qū)е碌淖慵?xì)胞損傷被認(rèn)為是造成典型FSGS樣改變的原因[27]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與足細(xì)胞功能密切相關(guān)的多種基因突變可以導(dǎo)致FSGS[26]。多項(xiàng)關(guān)于FSGS的遺傳學(xué)研究也證實(shí)Ⅳ型膠原相關(guān)COL4A3/4/5基因突變是成人發(fā)病的家族性FSGS常見的致病基因。Gast等[28]在英國76個(gè)原發(fā)性FSGS的家系中,發(fā)現(xiàn)22%有家族史的患者和10%無家族史的患者攜帶致病突變,COL4A3/4/5基因突變占到了所有突變的56%。Gribouval等[29]在一項(xiàng)包含135例成年散發(fā)FSGS/SRNS法國患者的隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)43.7%的突變基因?yàn)镃OL4A3/4/5。Yao等[30]在加拿大的一項(xiàng)多種族成人發(fā)病FSGS研究發(fā)現(xiàn),11%的患者攜帶明確的致病突變,其中55%是COL4A3/4/5基因突變,另有9%的患者攜帶了可疑致病突變,其中37%是COL4A3/4/5基因突變。以上研究中表明,相比于兒童發(fā)病的FSGS/SRNS,成人遲發(fā)性的FSGS/SRNS中發(fā)現(xiàn)COL4A3/4/5基因突變比例相對(duì)較高。COL4A3/4/5基因突變可以單獨(dú)導(dǎo)致FSGS樣病變,也可以和足細(xì)胞相關(guān)基因一起參與FSGS的發(fā)生及影響疾病的嚴(yán)重程度。

Ⅳ型膠原相關(guān)基因突變導(dǎo)致FSGS的機(jī)制尚不完全明確,有假說認(rèn)為COL4A3/4/5基因突變對(duì)腎臟GBM的改變導(dǎo)致了足細(xì)胞脫落進(jìn)而表現(xiàn)為FSGS,也有觀點(diǎn)認(rèn)為COL4A3/4/5基因突變導(dǎo)致異常的α3α4α5鏈不能有效的組裝成Ⅳ型膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),游離的Ⅳ型膠原基因相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集會(huì)造成足細(xì)胞的損傷和凋亡[31]。而且在Alport綜合征或TBMN的疾病進(jìn)展過程中,FSGS也可以繼發(fā)于GBM的損傷[32]。COL4A3/4/5基因的突變?cè)贔SGS/SRNS中的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,深入研究有助于為FSGS的診治提供新思路。

小管間質(zhì)病變除了GBM,Ⅳ型膠原也是組成腎小管基膜(TBM)的主要成分,Alport綜合征患者腎組織Ⅳ型膠原染色也發(fā)現(xiàn)腎小管部位的表達(dá)缺失。雖然有部分的α3α4α5鏈,但TBM的主要Ⅳ型膠原成分為α1α1α2鏈[33]。目前,COL4A1/2基因突變主要認(rèn)為可導(dǎo)致小血管的病變。小鼠COL4A1 基因的突變抑制了突變型和正常型Ⅳ型膠原蛋白的分泌,導(dǎo)致血管基膜的異常組裝,從而引起小血管畸形,在部分小鼠內(nèi)表現(xiàn)為腦內(nèi)小血管脆性增加、視網(wǎng)膜動(dòng)脈迂曲、蛋白尿等[34]。COL4A1基因突變引起的腎臟病變報(bào)道較少,僅在一種常染色體顯性遺傳的遺傳性血管病、腎病、動(dòng)脈瘤和肌肉痙攣(HANAC)綜合征中被發(fā)現(xiàn),主要表現(xiàn)為腦白質(zhì)病變、動(dòng)脈瘤、視網(wǎng)膜動(dòng)脈病變、血尿、多囊腎、肌肉痙攣等。在HANAC綜合征患者發(fā)現(xiàn)其GBM和TBM區(qū)域內(nèi)有類似Alport綜合征患者的經(jīng)典GBM斷裂分層樣改變[35]。然而在一項(xiàng)COL4A1基因突變的動(dòng)物模型研究中僅在GBM和包囊觀察到基膜的結(jié)構(gòu)缺陷,TBM結(jié)構(gòu)無明顯變化,COL4A1基因突變的小鼠腎小管功能異常主要是因?yàn)槁詢?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成的腎髓質(zhì)萎縮[36]。因此,關(guān)于Ⅳ型膠原相關(guān)突變?nèi)绾螌?dǎo)致了TBM的結(jié)構(gòu)功能異常尚未完全清晰,病變是否局限于腎小管內(nèi)還是全身系統(tǒng)性疾病的一部分,基因突變和表觀因素是否共同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展,均需進(jìn)一步的研究和分析。

綜上所述,隨著基因組醫(yī)學(xué)的發(fā)展,尤其是基因測序技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用,我們有可能從基因?qū)用嬷匦抡J(rèn)識(shí)疾病,諸如Alport綜合征、TBMN及FSGS等以臨床表現(xiàn)和病理特征為診斷依據(jù)的疾病,究其病因都是由于Ⅳ型膠原相關(guān)基因突變導(dǎo)致。目前有作者建議將其統(tǒng)一命名為Ⅳ型膠原腎病。因此,系統(tǒng)開展中國人群Ⅳ型膠原基因相關(guān)突變與腎臟疾病之間的大樣本隊(duì)列研究,對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)由Ⅳ型膠原基因突變導(dǎo)致的腎臟疾病,提高診斷水平,指導(dǎo)用藥和隨訪管理有著重要的臨床研究價(jià)值和科學(xué)研究意義。