虎奶菇不同栽培方案及其子實(shí)體抗氧化研究

付圣麟　方　亮　蘇廣林　劉　斌

虎奶菇不同栽培方案及其子實(shí)體抗氧化研究

付圣麟1,2方亮1,2蘇廣林1,2劉斌1,2

（1.廣西大學(xué)食用菌研究所廣西南寧530005；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所廣西南寧530005）

文章旨在探究不同木屑搭配菌草后對虎奶菇產(chǎn)量及其子實(shí)體抗氧化的影響。選取苦楝木屑、松木屑和杉木屑3種木屑，共設(shè)置3種不同栽培配方：A.苦楝木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%；B.松木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%；C.杉木屑52%、菌草26%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%。測定不同配方下的菌包產(chǎn)量、子實(shí)體活性物質(zhì)含量及抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果表明：配方B的子實(shí)體產(chǎn)量最高，達(dá)到160.13 g/包；配方B栽培的子實(shí)體的多糖、三萜和多酚含量均最高，分別為21.84 mg/g、14.76 mg/g、4.37 mg/g；配方B栽培的子實(shí)體的醇提物對DPPH的清除能力最強(qiáng)，7 mg/mL醇提物的清除率可達(dá)81.50%；配方A栽培的子實(shí)體的醇提物對ABTS的清除能力最強(qiáng)，1.0 mg/mL醇提物的清除率可達(dá)87.69%。

虎奶菇；木屑；栽培；產(chǎn)量；抗氧化

虎奶菇[(Fr.) Sing]，別名菌核側(cè)耳、茯苓側(cè)耳、虎乳菌，為木腐生真菌，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，具有重要的藥用價(jià)值，其耐高溫，主要種植在熱帶和亞熱帶地區(qū)，一般能在木樁或者土壤內(nèi)的腐木上生長[1]。該菌也是一種子實(shí)體和菌核都能食用的珍稀食藥用菌[2]。

食用菌具有非常高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用保健的藥理功效，食用菌多糖在抗癌方面具有一定的優(yōu)越功效[3]。此外，還能降低某些物質(zhì)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生率，并對多種化療藥物具有增效效應(yīng)[4]。

目前側(cè)耳類食用菌栽培多使用棉籽殼培養(yǎng)基，而貴州省農(nóng)作物品質(zhì)資源研究所開發(fā)的松杉木鋸末發(fā)酵熟料竹蓀脫袋培養(yǎng)基解決了農(nóng)業(yè)廢料的污染問題。研究發(fā)現(xiàn)，利用鋸末的培養(yǎng)基產(chǎn)量與效率較低，且開發(fā)難度大[5]，尤其針對針葉木材廢料在食用菌栽培培養(yǎng)基的開發(fā)較少[6]。其樹脂道中分泌樹脂酸等是針葉樹防御蟲害及其共生微生物入侵的重要途徑[7]，所以目前利用木屑的培養(yǎng)基中幾乎都是闊葉木材[8]。針葉木屑作為許多木材加工廠的副產(chǎn)物，是一種可以利用起來的潛在資源[9]。

本研究以不同針葉木屑為主料設(shè)置栽培配方，對其產(chǎn)量和活性物質(zhì)進(jìn)行了初步研究，篩選出適宜的木屑栽培虎奶菇，以期為木屑的有效利用和虎奶菇的栽培提供參考方向。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與材料

試驗(yàn)所用菌株采自廣西壯族自治區(qū)來賓市經(jīng)分子鑒定與形態(tài)鑒定確定種屬，現(xiàn)保存于廣西大學(xué)微生物研究所。

木屑來源于南寧市木材加工市場，麩皮等發(fā)酵粗料均來自廣西大學(xué)微生物研究所菌種廠；試劑包括硫酸鈣等常用試劑，均購于成都科龍化工有限公司；儀器有SYW-2食用菌自動(dòng)裝袋機(jī)（隨州智宸機(jī)械有限公司）、KQ-300GDV恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山舒美儀器有限公司）等。

1.2 菌種培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基為PDA，即200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 g磷酸二氫鉀、0.5 g硫酸鎂，加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.3 栽培方案設(shè)計(jì)

不同栽培方案設(shè)計(jì)如表1。

表1虎奶菇栽培料配方表

配方編號苦楝木屑/%松木屑/%杉木屑/%菌草/%麩皮/%生石灰/%石膏/% ABC52———52———52262626202020111111

1.4 栽培管理

按照上述表1配方，將配料拌勻，控制含水量為60%，攪拌均勻后裝入15 cm×33 cm的聚丙烯袋，每袋裝料重量為500 g（濕重），用棉花塞緊封口，貼好標(biāo)簽，放入高壓滅菌鍋121 ℃滅菌2 h。每個(gè)配方設(shè)置10個(gè)重復(fù)。

將接種好的菌袋放入栽培菇房進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，培養(yǎng)期間溫度設(shè)置為25 ℃～28 ℃，濕度保持在70%～80%。

待菌絲長滿菌袋后，即可開袋放入出菇菇房進(jìn)行出菇，出菇期間保持菇房溫度為28 ℃，濕度為80%，每天間斷日光燈光照3 h～6 h。

1.5 多糖類化合物含量測定

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖1.00 g，加水溶解定容到100 mL，即標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10.0 mg/mL。對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的葡萄糖溶液各2.0 mL。以蒸餾水為對照，各試管加入5%苯酚溶液0.50 mL搖勻。再分別加入2.50 mL濃硫酸，充分搖勻后，室溫下靜置15 min，于490 nm波長處測得其相應(yīng)吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖濃度與吸光度值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程和線性范圍。

1.5.2 虎奶菇子實(shí)體多糖類化合物含量測定

將采摘后的虎奶菇子實(shí)體放入烘箱烘干至恒重后粉碎，稱量1 g子實(shí)體粉末，置于25 mL試管中，加入80%乙醇25 mL，混合均勻后，置于超聲破壁儀中超聲30 min，用苯酚-硫酸法測定多糖含量，測定具體操作方法同1.5.1。

1.6 三萜含量測定

1.6.1 三萜標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的齊墩果酸（對照品）10.0 mg，以色譜級甲醇配制成0.2 mg/mL的溶液。分別精密吸取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL該溶液置于刻度試管中，60 ℃水浴蒸發(fā)干溶劑，加入新配制的0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及1.2 mL高氯酸，70 ℃恒溫水浴15 min后冰水浴冷卻。再加入乙酸乙酯使體系總量為4 mL，搖勻，于550 nm波長處測定吸光度，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 虎奶菇子實(shí)體三萜含量測定

稱量1 g虎奶菇子實(shí)體粉末于錐形瓶中，加入25 mL乙醇，連續(xù)超聲45 min，過濾后將濾液置于100 mL容量瓶中定容待測。參照NY/T 1676—2008，用香草醛-冰醋酸法測定醇提物中的三萜含量[10]。吸取待測樣品溶液1.0 mL置于試管中60 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL及高氯酸1.2 mL后，按齊墩果酸對照品溶液處理方法處理，于550 nm波長下測定吸光度，計(jì)算樣品中三萜類化合物含量。

1.7 多酚含量測定

稱取虎奶菇子實(shí)體粉末0.25 g，加8 mL水超聲60 min，加水定容至10 mL。取2 mL于離心管中，12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)至新離心管中，即虎奶菇供試樣液。具體測定多酚含量操作參照李洋洋等（2017）[10]的方法。

1.8 抗氧化活性測定

1.8.1 清除DPPH自由基能力測定

將上述1.6中醇提物樣品稀釋成不同濃度，樣品組為2 mL不同濃度樣品+2 mLDPPH試劑，對照組用無水乙醇代替DPPH，空白組用無水乙醇代替樣品。測定方法參考范三紅等（2020）[11]的方法并加以改動(dòng)。

1.8.2 清除ABTS自由基能力測定

參照謝惠等（2017）[12]的方法并加以改動(dòng)。樣品組為2 mL不同濃度樣品+2 mLABTS試劑，對照組用蒸餾水代替ABTS，空白組用蒸餾水代替樣品。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018軟件繪圖，并采用Excel和SPSS 25軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出菇產(chǎn)量

待子實(shí)體生長至八分成熟后采收，將每袋子實(shí)體采收后用天平稱量子實(shí)體鮮重，計(jì)算出不同配方的平均產(chǎn)量，結(jié)果如表2。

表2不同配方出菇產(chǎn)量及顯著性差異分析比較

配方編號單包產(chǎn)量/（g/包）顯著性差異（P＜0.05） ABC135.08±3.99160.13±4.6693.10±2.63 bac

由表2可知，供試的不同木屑配方中，配方B的產(chǎn)量和配方A、C的產(chǎn)量均存在顯著性差異。其中，配方B的產(chǎn)量在3種配方中是最高的，其單包產(chǎn)量達(dá)160.13 g；而以杉木屑為主料的配方C產(chǎn)量最低，僅為93.1 g/包，與B相比，其單包產(chǎn)量相差41.98 g。

2.2 不同配方下虎奶菇子實(shí)體活性成分含量比較分析

（1）活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

圖1　苯酚-硫酸法葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　香草醛-冰醋酸法三萜含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到如圖1苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線=0.067 5－0.066 3，2=0.999，以及圖2香草醛-冰醋酸法三萜含量標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線=2.561 1－0.026 5，2=0.999，以此作為后續(xù)測定值的計(jì)算依據(jù)。

（2）子實(shí)體活性成分含量比較分析。

圖3　不同配方虎奶菇子實(shí)體活性成分含量

由圖3可知，3種不同木屑對虎奶菇子實(shí)體內(nèi)的多糖、三萜以及多酚等活性成分含量均有一定的影響。其中，在多糖含量方面，配方B的子實(shí)體多糖含量最高，為21.84 mg/g，配方C的多糖含量最低，其含量與配方B相差1.09 mg/g。

三萜含量方面，以松木屑為主料的配方B栽培的虎奶菇子實(shí)體內(nèi)三萜含量最高，達(dá)到14.76 mg/g，其次是以苦楝木屑為主料的配方A，而以杉木屑為主料的配方C栽培的子實(shí)體三萜含量最低，為12.77 mg/g，與配方B相差1.99 mg/g。

在多酚含量方面，也是以松木屑為主的配方B栽培的子實(shí)體含量最高，為4.37 mg/g，其次為配方C，配方A的含量最低，為3.9 mg/g。因此，綜合分析，配方B栽培的虎奶菇子實(shí)體的多糖、三萜、多酚這些活性物質(zhì)含量均為最高。

2.3 不同配方虎奶菇子實(shí)體醇提物的抗氧化活性分析

圖4　不同配方下虎奶菇子實(shí)體醇提物對DPPH的清除率

圖5　不同配方下虎奶菇子實(shí)體醇提物對ABTS的清除率

如圖4，隨著濃度的增大，不同木屑栽培的子實(shí)體醇提物對DPPH自由基的清除率都呈穩(wěn)定上升趨勢。當(dāng)醇提物濃度為1 mg/mL～5 mg/mL時(shí)，3種配方下的子實(shí)體醇提物對DPPH自由基的清除率均呈快速上升趨勢，且配方A的子實(shí)體醇提物對DPPH的清除率較高于配方B、C；當(dāng)醇提物濃度大于5 mg/mL時(shí)，清除率的上升趨勢逐漸緩慢趨平，但配方B的子實(shí)體醇提物對DPPH的清除率相較于配方A和C增長迅速；當(dāng)醇提物濃度達(dá)到7 mg/mL時(shí)，不同配方下的子實(shí)體醇提物的DPPH自由基清除率均達(dá)到最大值，分別為80.78%（A）、81.50%（B）、77.64%（C），即B＞A＞C。

如圖5，隨著濃度的增大，不同木屑栽培的子實(shí)體醇提物對ABTS自由基的清除率也呈上升趨勢[10]。當(dāng)醇提物濃度為0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，配方A的子實(shí)體醇提物對ABTS的清除率均高于配方B、C；當(dāng)醇提物濃度為0.6 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，配方C的子實(shí)體醇提物的清除率高于配方B；當(dāng)醇提物濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，配方A的子實(shí)體醇提物的ABTS清除率最高，為87.69%，此時(shí)配方C的子實(shí)體醇提物的清除率接近配方A，為84.00%，而配方B為78.53%，即A＞C＞B。

3 討論

通過使用不同木屑對虎奶菇進(jìn)行栽培，對比其產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)苦楝木屑、松木屑和杉木屑中，松木屑對虎奶菇栽培產(chǎn)量提高效果顯著。之后對虎奶菇活性物質(zhì)進(jìn)行測定分析，發(fā)現(xiàn)松木屑栽培的虎奶菇子實(shí)體中多糖、三萜及多酚這些活性物質(zhì)含量也是最高的。因此，從這3種木屑中可篩選出松木屑和菌草搭配更適宜栽培虎奶菇，希望本實(shí)驗(yàn)?zāi)転槟拘假Y源的有效利用提供參考。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2021.12.07

S646

A

2095-1205(2021)12-18-03

劉斌