4個雞品種胚胎發(fā)育后期肌纖維組織學(xué)特性比較分析

谷 爽，文超良，李俊英，吳桂琴，李光奇，韓文朋，閆奕源，孫從佼，楊 寧*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；2.北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206）

雞肉品質(zhì)主要表現(xiàn)為外在表觀品質(zhì)和內(nèi)在食用品質(zhì)，內(nèi)在食用品質(zhì)由肌纖維物理和生化特性決定。肌纖維組織學(xué)特性包括肌纖維總數(shù)、肌纖維直徑、肌纖維面積和肌纖維密度等指標(biāo)[1]。目前普遍認(rèn)為骨骼肌肌纖維總數(shù)在胚胎期已固定，出雛后數(shù)量無變化[1]，而出雛后肌肉生長較大程度上由胚胎期形成的肌纖維總數(shù)決定[2]。因此，胚胎期肌纖維發(fā)育狀態(tài)對肌肉產(chǎn)量與質(zhì)量至關(guān)重要，研究胚胎期肌纖維發(fā)育對于改善雞肌肉品質(zhì)意義重大。Miraglia和Yalcin等研究發(fā)現(xiàn)，與慢速生長型雞相比，快速生長型雞擁有更多肌纖維數(shù)量、更大肌纖維面積和更小肌纖維密度[3-4]。對生長性狀高強度持續(xù)選育可能導(dǎo)致快速生長型雞在胚胎期形成更多肌纖維，出雛后通過肌纖維增生和肥大得到相對更大的肌纖維總面積，加速肌肉生長。

我國擁有極豐富雞種質(zhì)資源，主要分為：蛋雞、肉雞和兼用地方品種雞等。蛋雞品種產(chǎn)蛋性能優(yōu)良，但早期生長速度緩慢，常見高產(chǎn)蛋雞包括白來航雞和洛島紅雞。肉雞品種生長速度快，尤其是快大型白羽肉雞，其活重在6周齡可達到2.5 kg。地方品種雞大多為肉蛋兼用型，肉質(zhì)鮮美，長速介于蛋雞和肉雞之間，如北京油雞、茶花雞等。本研究從胚齡、組織、品種和性別4個因素出發(fā)，探究蛋雞、地方雞種和肉雞在胚胎后期肌纖維組織學(xué)發(fā)育差異，以期深入理解不同生長速度雞種在胚胎后期肌纖維發(fā)育特性，為提高雞肉產(chǎn)量與質(zhì)量探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

試驗所用白來航雞和北京油雞合格種蛋來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院家禽遺傳資源與育種試驗基地；白洛克雞和科尼什雞種蛋由北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司提供。白來航雞生長速度緩慢，為常見高產(chǎn)蛋雞；北京油雞遺傳性能穩(wěn)定，是我國珍貴地方雞種；科尼什雞和白洛克雞分別為快大型白羽肉雞父系和母系，生長速度快，6周齡體重均可達2.5 kg以上。

種蛋入孵前，用新潔爾滅消毒液清潔和消毒種蛋。種蛋孵化期間，溫度保持（37.8±0.1）℃，相對濕度60%，翻蛋時長60 s，翻蛋間隔90 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞種蛋孵化至ED15、ED17及出雛時，分別選擇雞胚重量相近公母雞胚各2只，采集左側(cè)完整胸大肌和腿肌，保存在裝有4%多聚甲醛的10 mL離心管中，用于后續(xù)石蠟切片制作。同時，采集雞胚皮膚組織暫存于-20℃冰箱用于后續(xù)性別鑒定。

1.2.2 雞胚性別鑒定

取出暫存于-20℃冰箱的雞胚皮膚組織，按照TransDirect Animal Tissue PCR Kit（AD201-01,北京全式金生物技術(shù)有限公司）操作步驟利用CHD1基因作PCR擴增鑒定性別，擴增反應(yīng)體系：AD1Buffer、AD2 Buffer、AD3 Buffer混合液2μL，上游引物（10μmol·L-1）0.2μL，下游引物（10μmol·L-1）0.2μL，2×TransDirect PCR SuperMix 5μL，Nuclearfree water 2.6μL，總體積10μL。待反應(yīng)結(jié)束后取9μL擴增產(chǎn)物點樣于1%瓊脂糖凝膠，140 V條件下跑膠10 min，最后使用凝膠成像系統(tǒng)（SmartGel 140，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）檢測結(jié)果。如圖1所示，1個條帶個體為公胚，2個條帶個體為母胚[5]。

圖1 電泳檢測Fig.1 Electrophoresis results

1.2.3 石蠟切片制作和染色

將采集的肌肉組織樣品置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，垂直肌纖維方向修整肌肉獲得橫截面，依次經(jīng)20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%各級乙醇溶液脫水，隨后包埋石蠟、切片、撈片、烤片，最后采用蘇木素-伊紅染色（HE染色）。

1.3 肌纖維組織學(xué)特性測定

利用全自動數(shù)字病理切片掃描儀掃描切片，掃描完成后隨機選取至少8個部位放大至40×后輸出圖像。利用Image-J和Image-Pro Plus（6.0）軟件統(tǒng)計肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比和肌纖維密度共4個指標(biāo)。

測定各輸出圖像中單個肌纖維直徑和肌纖維面積，將單個樣本8個部位圖像的平均值代表個體肌纖維直徑和肌纖維面積；視野內(nèi)肌纖維總面積與輸出圖像總面積比值平均值為肌纖維面積占比；視野內(nèi)肌纖維根數(shù)與該輸出圖像總面積比值平均值為肌纖維密度。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

將上述測定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用一般線性模型（General linear model,GLM）對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比、肌纖維密度在品種、性別、組織、胚齡間作最小二乘分析；利用單因素方差分析（ANOVA）不同維度作差異分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種、胚齡、性別、組織部位對肌纖維組織特性的效應(yīng)分析

對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比和肌纖維密度在品種、性別、組織、胚齡間作最小二乘分析，4個因素主效應(yīng)及交互效應(yīng)如表1所示。

表1 各因素主效應(yīng)及交互效應(yīng)分析Table 1 Analysisof main effects and interaction effects of four factors

由性別為主效應(yīng)及性別與其他因素交互效應(yīng)分析可知，肌纖維直徑、面積、面積占比、密度均不受性別影響。品種、組織和胚齡3個因素對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維密度主效應(yīng)影響極顯著（P＜0.01），兩兩之間交互效應(yīng)對肌纖維面積和肌纖維面積占比影響顯著（P＜0.05），3個因素交互效應(yīng)對肌纖維組織學(xué)特性4個指標(biāo)影響顯著（P＜0.05）。

2.2 胚胎后期肌纖維組織學(xué)形態(tài)比較分析

4個品種雞在胚胎后期肌纖維發(fā)育規(guī)律一致，以科尼什雞胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維組織學(xué)形態(tài)為例（見圖2），ED15時胸肌和腿肌肌纖維輪廓尚不清晰，ED17時肌纖維輪廓較為清晰，肌纖維初步形成。ED17至出雛這一時期，單根肌纖維開始增大，D1時肌纖維清晰可見。

ED17為肌纖維發(fā)育分界點，雞胚在此之前完成單核成肌細胞融合，形成多核肌纖維，此后開始肌纖維增大。由圖2B～C和E～F的肌纖維形態(tài)學(xué)圖可見，胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維發(fā)育速度略不同，相同放大倍數(shù)下，雞胚從ED17發(fā)育至D1，胸肌肌纖維面積變化較小。

圖2 科尼什雞ED15、ED17和D1胸肌和腿肌肌纖維橫切面圖（40×）Fig.2 Cross-sectional view of the pectoralis and leg musclefibersof Cornish in ED15,ED17 and D1（40×）

2.3 胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維發(fā)育差異

圖3（A～D）分別為白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞在胚胎后期胸肌和腿肌肌纖維組織學(xué)特性差異分析結(jié)果。從發(fā)育階段看，白來航雞、北京油雞和白洛克雞胸肌自ED17發(fā)育至D1，其肌纖維直徑和肌纖維面積未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），而科尼什雞（見圖3D）胸肌肌纖維組織特性在ED17和D1兩個時間點表現(xiàn)顯著差異?？颇崾搽u胸肌肌纖維直徑和面積在D1顯著大于ED17（P＜0.05），肌纖維面積占比和肌纖維密度在ED17極顯著大于D1（P＜0.01）。4個品種雞腿肌肌纖維組織學(xué)特性在ED17和D1時表現(xiàn)一致，肌纖維直徑、面積和密度在兩個時間點均差異極顯著（P＜0.01），而肌纖維面積占比差異不顯著（P＞0.05）。

從組織部位看，雞胚發(fā)育至ED17時，白來航雞（見圖3A）與北京油雞（見圖3B）胸肌和腿肌的肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維密度均未出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），而兩個肉雞品種雞（見圖3C～D）胸肌和腿肌已出現(xiàn)差異，表現(xiàn)為腿肌肌纖維極顯著大于胸肌（P＜0.01），胸肌肌纖維密度極顯著高于腿?。≒＜0.01）。此后腿肌肌纖維比胸肌發(fā)育快，D1時4個品種雞胸肌和腿肌肌纖維組織學(xué)特性均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），胸肌肌纖維密度仍極顯著高于腿?。≒＜0.01）。

圖3 4個雞品種胚胎后期胸肌和腿肌肌纖維組織特性Fig.3 Histological characteristics of the musclefibers of the pectoralis and leg muscles during the late embryonic period among four breeds of chickens

2.4 不同品種在胚胎后期肌纖維發(fā)育差異

胸肌肌纖維由ED17發(fā)育至D1，其形態(tài)學(xué)差異較小，因此本研究將ED17時胸肌肌纖維組織形態(tài)學(xué)在4個品種間差異作對比分析。由表2可知，白來航雞和北京油雞肌纖維直徑和面積比白洛克雞和科尼什雞大，但肌纖維直徑差異不顯著（P＞0.05），肌纖維面積差異顯著（P＜0.05），而白來航雞和北京油雞肌纖維密度顯著低于白洛克雞和科尼什雞（P＜0.05）；白來航雞和北京油雞肌纖維面積和肌纖維密度差異不顯著（P＞0.05），白洛克雞和科尼什雞肌纖維面積和肌纖維密度差異不顯著（P＞0.05）。

腿肌肌纖維在胚胎后期增加較快，本研究將D1時腿肌肌纖維形態(tài)學(xué)在4個品種間差異作對比分析。由表2可知，D1時腿肌肌纖維密度，白洛克雞和科尼什雞顯著高于白來航雞和北京油雞（P＜0.05），且白來航雞和北京油雞之間、白洛克雞和科尼什雞之間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 4個雞品種胚胎后期肌纖維組織特性統(tǒng)計Table 2 Statistical of the tissue characteristics of muscle fibers in the late embryonic period of four chicken breeds

圖4 4個雞品種肌肉橫切面圖（40×）Fig.4 Cross-sectional view of the muscle fibers of the four chicken breeds（40×）

3 討論

肌纖維是骨骼肌基本組成單位，占肌肉質(zhì)量75%～90%，在胚胎期由單核成肌細胞融合形成[6]。陳寬維等分析蛋雞、肉雞、地方雞和藥用雞肌纖維組織特性，發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景雞肌纖維特性存在較大差異，說明肌纖維組織學(xué)特性與雞類型有一定關(guān)聯(lián)[7]。Tejeda等利用快速生長型肉雞和慢速生長型肉雞研究品種、性別和肌肉部位對肌纖維組織學(xué)特性影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種和性別對肌纖維面積影響較小，肌肉部位對肌纖維面積影響較大[8]，與本研究結(jié)果一致，即兩種肉雞在同一胚胎時期肌纖維面積差異較小，性別對肌纖維組織學(xué)特性影響不顯著（P＞0.05），而不同肌肉部位肌纖維面積差異顯著（P＜0.05）。趙衍銅等對不同品種肉雞在110日齡時肌纖維組織特性開展研究，得出品種間肌纖維直徑和面積差異顯著[9]。因隨著年齡增加，肌纖維直徑逐漸增大，密度逐漸減小[10]，肉雞肌纖維增大速度可能產(chǎn)生一定差異。成年后公雞通過分泌睪酮促進肌肉生長，減少肌內(nèi)脂質(zhì)沉淀[11]。李娟和譚麗勤等在1日齡、60和90日齡分別分析不同性別雞肌纖維直徑和密度，同一日齡時，公雞肌纖維密度高于母雞，肌纖維直徑低于母雞[12-13]。本研究結(jié)果顯示性別對肌纖維組織特性影響較小，可能由于胚胎期性腺處于發(fā)育初始階段，激素作用尚未體現(xiàn)，因此胚胎期公母雞之間肌纖維直徑和面積未表現(xiàn)出差異。

雞胚生長過程中所需營養(yǎng)、能量均由卵黃提供，雞胚發(fā)育至后期需更多能量促進機體生長以保證正常出雛及出雛后的活動。此時卵黃中營養(yǎng)已無法滿足雞胚能量需求，因此胚胎后期供能方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，脂類代謝減少，糖酵解代謝增多，肝臟糖異生作用加強，進而動員雞胚胸肌中蛋白質(zhì)，為機體提供能量[14]。根據(jù)肌球蛋白ATP酶在不同pH下活性差異，可將骨骼肌分為I、IIa、IIb 3種類型。其中IIb型肌纖維內(nèi)含線粒體較少，表現(xiàn)糖酵解特性，而雞胸肌中有90%～100%肌纖維屬于IIb型肌纖維，可為胚胎后期糖酵解活動提供材料[15-16]。胸肌發(fā)生動員后，肌纖維中蛋白質(zhì)減少，胚胎后期胸肌重量降低，肌纖維直徑和面積減小，骨骼肌衛(wèi)星細胞活性降低、數(shù)量減少。陳偉研究發(fā)現(xiàn)，鴨胚從ED22至出雛當(dāng)天，其胸肌肌纖維直徑減少55%，從組織形態(tài)學(xué)上證明該階段肌纖維發(fā)生萎縮[17]。對于白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞胚胎發(fā)育后期胸肌，其肌纖維在ED17和D1時形態(tài)差異?。≒＞0.05），進一步證明該時期胸肌發(fā)生大量糖酵解活動為機體發(fā)育供能。家禽胸肌與腿肌肌肉構(gòu)造不同，其發(fā)育機制也存在差異。王珍研究發(fā)現(xiàn)AA肉雞發(fā)育至D1時，腿肌比胸肌發(fā)育快，表現(xiàn)為肌纖維直徑更大，肌纖維密度更小[18]。蔣明雅等研究發(fā)現(xiàn)我國地方肉雞在相同胚齡時，腿肌發(fā)育快于胸肌，具體表現(xiàn)為肌纖維直徑差異[19]。本研究與以上研究結(jié)果一致，即相同發(fā)育時期，腿肌發(fā)育比胸肌快，如科尼什雞在D1時胸肌肌纖維直徑為3.98μm，腿肌肌纖維直徑為7.64μm，二者差異極顯著（P＜0.01）。這與胚胎后期胸肌中蛋白質(zhì)大量降解有關(guān)，也可能是雞胚出雛后腿肌需迅速支持體重和維持運動，因此胚胎后期腿肌發(fā)育較快。鴨胚發(fā)育至后期，其胸肌和腿肌發(fā)育程度表現(xiàn)同樣差異，且在出雛后同樣存在[20]。對于不同品種雞之間腿肌發(fā)育差異，鄧宇翔研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中后期，肉雞肌纖維密度少于地方雞，胚胎發(fā)育末期則高于地方雞，可能是由于這一時期肉雞腿肌中以直徑較小的慢速型肌纖維為主[21]。彭瓊等研究白羽肉雞、羅曼粉蛋雞和地方選育肉雞品種的肌纖維組織特性，比較3個品種在胚胎期骨骼肌發(fā)育特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎期肉雞腿肌重大于蛋雞，且腿肌分化時間早于胸肌[22]。D1時肉雞腿肌肌纖維密度顯著高于白來航雞和北京油雞（P＜0.05），說明胚胎發(fā)育后期不同品種雞腿肌發(fā)育速度不同，肉雞發(fā)育快于蛋雞和地方雞。

骨骼肌由肌纖維組成，肌肉品質(zhì)與肌纖維特性直接相關(guān)，其中肌纖維數(shù)量和肌纖維面積是影響肌肉質(zhì)量和產(chǎn)量主要因素[11,23]。胚胎期成肌細胞融合形成骨骼肌，肌纖維數(shù)量出雛后無變化，因此胚胎期形成的肌纖維數(shù)量對出雛后肌肉發(fā)育至關(guān)重要。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉雞白洛克雞在D1時肌纖維面積為13.95μm2，與王紅楊研究結(jié)果一致[24]；但北京油雞在D1時肌纖維面積為15.88μm2，雖略高于白洛克雞，但并未達顯著水平，但王紅楊研究結(jié)果顯示北京油雞D1肌纖維面積極顯著高于科寶肉雞（P＜0.01），達到36.58μm2[24]。這可能因試驗所選肌肉視野不同，導(dǎo)致統(tǒng)計情況存在差異。廖菁研究發(fā)現(xiàn)，快速生長型雞肌纖維數(shù)量較慢速生長型雞多[25]。此外，隨著日齡增加，快速生長型雞肌肉中巨型肌纖維更多，肌纖維更粗，其日增重也越快[26]。胚胎期肌纖維數(shù)量與肌纖維面積呈負相關(guān)，與肌肉質(zhì)量呈正相關(guān)[27]，本研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實該點。對于快大型肉雞，其胚胎期肌纖維密度較慢速生長型蛋雞大，其肌纖維面積較慢速生長雞小，說明快大型肉雞在胚胎期成肌細胞可更多融合為肌纖維，因此出雛后快大型肉雞生長更快。肌纖維影響肌纖維束大小，快大型肉雞出雛后生長過快會導(dǎo)致肌肉橫切面相對粗糙，肉質(zhì)下降[28]。

4 結(jié) 論

本研究從4個維度分析雞在胚胎后期肌纖維組織學(xué)形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)性別對雞胚胎后期肌纖維組織特性影響小，而品種、胚齡、組織部位對其影響較大。組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肉雞在胚胎期間形成單位面積內(nèi)更多數(shù)量肌纖維；ED17為肌纖維形成關(guān)鍵時期；腿肌在胚胎期發(fā)育速度較胸肌快。