氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及AKT/eNOS/NO通路的影響

馮梅 張娟 佘春燕 張青松

人視網(wǎng)膜微血管病變是多種代謝性疾病和心血管疾病的并發(fā)癥，如糖尿病、高血壓、白血病等都可引起視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病變。以機(jī)體內(nèi)大分子物質(zhì)為原料，通過(guò)非酶促反應(yīng)生成的穩(wěn)定共價(jià)鍵產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是損傷視網(wǎng)膜微血管的重要因素之一。AGEs能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能發(fā)生障礙[1，2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是重要的舒血管因子，當(dāng)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到一系列損傷時(shí)，其NO釋放量會(huì)減少，血管平衡穩(wěn)態(tài)被打破[3]。蛋白激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(protein kinase/endothelial nitric oxide synthase, AKT/eNOS)通路的活化可以促進(jìn)NO的釋放，從而降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡[4，5]研究報(bào)道，氫氣(hydrogen,H2)在機(jī)體中具有一定的生理作用，可作為抗氧化劑降低機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。多個(gè)研究表明，大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ臀霘錃夂笸ㄟ^(guò)抗氧化作用可以減輕再灌注損傷和炎性病變[7，8]。目前關(guān)于氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及AKT/eNOS通路的影響并不十分清晰，我們圍繞此課題展開(kāi)研究，揭示了氫氣在抗視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的部分機(jī)制。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)研究。人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,hRMECs)購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；AGE-BSA購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素和青霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；0.2%胰蛋白酶溶液購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒和蛋白提取試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AKT抗體、eNOS抗體、p-AKT抗體和p-eNOS抗體均購(gòu)自TaKaRa公司。

超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；高速低溫離心機(jī)購(gòu)自SIGMA公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；電泳儀、凝膠成像儀、分光光度儀均購(gòu)自Bio-Rad公司。

二、方法

1.HRM制備及實(shí)驗(yàn)分組：將H2在0.4 MPa高氣壓下溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中，現(xiàn)配現(xiàn)用并過(guò)濾消毒，富氫培養(yǎng)基的有效濃度為0.06 mmol[9]。

將hRMECs隨機(jī)分為4組，每組各設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照：(1)正常組：正常培養(yǎng)hRMECs 24 h，不加干預(yù)；(2)AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA[10]，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；(3)HRM組：用HRM培養(yǎng)基培養(yǎng)hRMECs 24 h，不另加干預(yù)；(4)HRM+AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA和HRM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.MTT法檢測(cè)hRMECs活力：將hRMECs以1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照hRMECs的分組進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，避光并用振蕩器混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞的570 nm吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=(A1～4組-A空白組)/(A1組-A空白組)×100%，空白組為150 μl的細(xì)胞培養(yǎng)基，用以排除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基本底吸光值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hRMECs凋亡：配制密度為1×106個(gè)/ml的hRMECs單細(xì)胞懸液，2 ml/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)后，棄去上層培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，加入新的培養(yǎng)基終止消化后，4 ℃、1500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細(xì)胞2次，隨后用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液將細(xì)胞重懸，再次調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。取各組100 μl重懸后的細(xì)胞分別加入流式管中，做好分組標(biāo)記，再向流式管中加入5 μl Annexin V-FITC抗體和5μl Annexin V-PI抗體，快速混合均勻后避光孵育15 min，加入400 μl緩沖液混勻后上樣流式細(xì)胞儀，分析細(xì)胞凋亡情況，全程冰上操作。

4.比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性：將hRMECs以1×106個(gè)/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按照hRMECs的分組進(jìn)行處理和培養(yǎng)。加入胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，1500 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗滌1次，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液作用15 min，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取離心后上清液進(jìn)行Caspase-3和Caspase-9活性測(cè)定，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm吸光度(A)值。

5.檢測(cè)hRMECs的NO含量：將hRMECs以1×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其形成單細(xì)胞層。按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)，棄去舊培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后離心，無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞再加入細(xì)胞裂解液，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取離心后上清液進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定各組540 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組NO的含量。

6.蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot, WB)檢測(cè)hRMECs的AKT、eNOS、p-AKT及p-eNOS蛋白水平：hRMECs接種同比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性測(cè)定，再按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化，1500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞2次，1500 r/min、10 min再次離心并棄上清，加入細(xì)胞裂解液，低溫10000 r/min離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，小心取出凝膠并使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1h，加入稀釋(1:1000)后的對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1:2000)后的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差齊性采用one way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用one way ANOVA中Welch修正值，組間兩兩比較采用tamhane's T2值，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs活力的影響

從結(jié)果中可以看出，相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；相較于AGEs組，HRM+AGEs組的細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，各組細(xì)胞活性數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs活力的影響

二、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡的影響

結(jié)果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞凋亡率相比于正常組和HRM組顯著升高(P<0.05)；HRM+AGEs組的細(xì)胞凋亡率相比于AGEs組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡的影響

圖1 各組hRMECs細(xì)胞凋亡情況

三、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

由結(jié)果可知，與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯升高(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯降低(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的Caspase-3和Caspase-9活性的影響

四、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的NO含量的影響

結(jié)果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞NO含量相比于正常組和HRM組明顯降低(P<0.05)；HRM+AGEs組的細(xì)胞NO含量相比于AGEs組明顯升高(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的NO含量的影響

五、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

從結(jié)果中可以看出，與正常組相比，HRM組、AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞AKT和eNOS蛋白水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；但各組磷酸化信號(hào)蛋白p-eNOS和p-AKT水平明顯改變：與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表5、圖2。

圖2 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

表5 各組hRMECs中p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平

討 論

視網(wǎng)膜病變可由多種代謝性疾病引發(fā)，以糖尿病為例：患者體內(nèi)的胰島素代謝異常致使血液成分發(fā)生改變，高血糖的環(huán)境會(huì)使AGEs不斷產(chǎn)生并積累，引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常，隨著病情的發(fā)展，表現(xiàn)為糖尿病性視網(wǎng)膜病變[11，12]。視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病變會(huì)導(dǎo)致視力下降、眼底出血，甚至視網(wǎng)膜脫離造成失明[13]。因此，探究AGEs誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制對(duì)于防治血管病變具有重要的臨床意義。

目前，研究者們對(duì)氫氣在多種疾病治療中發(fā)揮的抗氧化能力、抗炎癥能力和抗凋亡能力等方面進(jìn)行了研究。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠模型吸入氫氣后，可通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)和抗氧化失衡來(lái)減輕氣道炎癥和改善肺功能。除了氫氣吸入治療，富含氫的溶液也具有抗氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞的作用[15]。王衛(wèi)娜等[16]研究顯示，富含氫的培養(yǎng)基能顯著抵抗脂多糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究構(gòu)建人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞AGEs損傷模型并設(shè)置富氫培養(yǎng)基干預(yù)組，結(jié)果顯示相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9活性升高；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率下降，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9活性降低。表明H2在人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)AGEs導(dǎo)致的凋亡具有抑制作用。

多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，不同藥物在對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制過(guò)程中涉及到AKT/eNOS信號(hào)通路的激活，細(xì)胞內(nèi)活化的AKT與eNOS結(jié)合定位于細(xì)胞膜，并使eNOS磷酸化，活化的eNOS催化產(chǎn)生NO，用于保護(hù)細(xì)胞[17-19]。NO是維持血管正常張力所不可缺少的，它可與血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體結(jié)合，引起血管平滑肌松弛，使血管擴(kuò)張[20]。在糖尿病患者體內(nèi)，血糖持續(xù)升高會(huì)使eNOS活性降低，NO的產(chǎn)生也隨之減少，使得血管舒張功能紊亂，造成血液局部流速降低，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為探究H2在AGEs導(dǎo)致的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮抑制作用是否與AKT/eNOS信號(hào)通路相關(guān)，本研究檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的NO含量以及AKT、eNOS、p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示AGEs組和HRM+AGEs組與正常組和HRM組相比，細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著降低，NO含量降低；HRM+AGEs組與AGEs組相比，細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著升高，NO含量升高。該結(jié)果表明，H2可激活A(yù)KT/eNOS信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)AKT和eNOS磷酸化，上調(diào)NO的釋放量，從而抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，該作用可能通過(guò)激活A(yù)KT/eNOS/NO通路得以發(fā)揮。本研究初步探討了氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制，為防治血管病變相關(guān)研究提供一定方向和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其中涉及的具體機(jī)制以及應(yīng)用氫氣的臨床安全性還有待于更深一步的研究和更多的臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。