巨大芽孢桿菌ω-轉(zhuǎn)氨酶催化合成手性β-氨基醇

楊曉曉, 李 靜, 張朝峰, 常宏宏, 張建棟

巨大芽孢桿菌-轉(zhuǎn)氨酶催化合成手性-氨基醇

楊曉曉, 李 靜, 張朝峰, 常宏宏, 張建棟

(太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 山西 太原 030024)

針對(duì)目前用于合成手性-氨基醇的()-轉(zhuǎn)氨酶稀缺的問題，對(duì)來(lái)自巨大芽孢桿菌(SC6394)的 ()--轉(zhuǎn)氨酶(BMTA)基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，在大腸桿菌中成功表達(dá)，并對(duì)BMTA進(jìn)行純化表征。結(jié)果表明：BMTA對(duì)()--氨基醇具有較高活力，對(duì)()--氨基醇沒有活力；BMTA在pH為7.5、溫度為55 ℃下酶活最高，在pH為6.5～8.0，溫度為4～30 ℃內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。應(yīng)用BMTA對(duì)不同外消旋-氨基醇進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分，底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)50%，對(duì)映體過量值(ee)為50%～99%。應(yīng)用BMTA不對(duì)稱還原胺化不同-羥基酮，產(chǎn)物()--氨基醇轉(zhuǎn)化率高達(dá)58%～96%，ee>99%。

-轉(zhuǎn)氨酶；手性-氨基醇；羥酮；動(dòng)力學(xué)拆分；不對(duì)稱還原胺化

1 前言

手性-氨基醇是一類非常重要的化合物，可以作為手性助劑或手性配體用于不對(duì)稱催化反應(yīng)[1-2]，也可作為手性中間體或砌塊用于合成多種手性藥物[3-4]。化學(xué)法合成手性-氨基醇[5-7]普遍存在合成工藝復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、選擇性不高、催化劑昂貴等缺點(diǎn)。生物法作為一種綠色可持續(xù)方法[8]，已成為國(guó)際研究熱點(diǎn)。目前，生物法合成手性-氨基醇主要包括轉(zhuǎn)氨酶動(dòng)力學(xué)拆分和不對(duì)稱還原胺化[9]、脂肪酶動(dòng)力學(xué)拆分[10]、胺脫氫酶不對(duì)稱還原[11]、酮還原酶不對(duì)稱還原[12]，以及級(jí)聯(lián)生物催化環(huán)氧化物不對(duì)稱開環(huán)等[13]。轉(zhuǎn)氨酶作為一種高效催化劑在手性胺合成方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[14]，但關(guān)于手性-氨基醇尤其是()--氨基醇合成的報(bào)道較少。目前僅有來(lái)自紫色色桿菌()的CVTA被報(bào)道可以還原胺化羥酮合成()--氨基醇，但產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率不到40%[15]。近年來(lái)，對(duì)來(lái)自河弧菌()[16]和魯杰氏菌(TM1040)[17]的轉(zhuǎn)氨酶(vfTA和3FCR)進(jìn)行了定向進(jìn)化，得到的突變酶被用于合成()--氨基醇，但反應(yīng)效率仍有待提高。因此，篩選新的高活力高選擇性轉(zhuǎn)氨酶用于手性-氨基醇的合成具有重要的價(jià)值。

本研究對(duì)來(lái)自巨大芽孢桿菌(SC6394)[18]的一個(gè)()-轉(zhuǎn)氨酶(BMTA)基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，在大腸桿菌(BL21)中進(jìn)行了表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)表征；應(yīng)用BMTA對(duì)外消旋-氨基醇進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)拆分，得到()--氨基醇，同時(shí)考察了BMTA不對(duì)稱還原胺化-羥基酮合成()--氨基醇的效率。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與試劑

菌種與質(zhì)粒：BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化公司，質(zhì)粒pET-28a(+)購(gòu)于安諾倫生物科技有限公司。

培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：質(zhì)量濃度為10.0 g×L-1胰蛋白胨、5.0 g×L-1酵母提取物、10.0 g×L-1氯化鈉(NaCl)，固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量濃度為15.0 g×L-1瓊脂粉。

Terrific Broth培養(yǎng)基(TB培養(yǎng)基)：質(zhì)量濃度為12.0 g×L-1胰蛋白胨、24.0 g×L-1酵母提取物、2.31 g×L-1磷酸二氫鉀、12.54 g×L-1磷酸氫二鉀、體積分?jǐn)?shù)為4 mL×L-1甘油。其中涉及的試劑均為生化試劑級(jí)別，購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。

試劑：外消旋-氨基醇((±)-1)、()-1和()-1購(gòu)于安耐吉化學(xué)有限公司和蘇州愛瑪特科技有限公司，-羥基酮(2)購(gòu)于安耐吉化學(xué)有限公司和百靈威科技有限公司。本研究中所涉及的化學(xué)藥品均為分析純，其他化學(xué)試劑均可從市面上購(gòu)買獲得。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1-轉(zhuǎn)氨酶重組菌的構(gòu)建

-轉(zhuǎn)氨酶BMTA基因來(lái)自巨大芽孢桿菌(SC6394)，對(duì)BMTA基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化并交公司合成(通用生物公司)。將目的基因與表達(dá)載體pET28a連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a-BMTA。將重組質(zhì)粒pET28a-BMTA導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組(BMTA)。

2.2.2 BMTA在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

將(BMTA)接種于質(zhì)量濃度為50 μg×mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r×min-1培養(yǎng)7 h，取1 mL的培養(yǎng)液于50 mL的TB培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度為50 μg×mL-1的卡那霉素)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液在波長(zhǎng)為600 nm的吸光值(OD600)達(dá)到0.5～0.6時(shí)，向培養(yǎng)基中加入濃度為0.5 mmol×L-1的異丙基--D-硫代半乳糖苷(isopropy--D-thiogalactoside，IPTG)，20 ℃、200 r×min-1的條件下繼續(xù)培養(yǎng)12～14 h，離心收集菌體，將菌體用磷酸緩沖液(濃度為100 mmol×L-1，pH=8.0)洗滌2次，最后用磷酸緩沖液將細(xì)胞懸浮，置于冰上，400 W下進(jìn)行超聲破碎10 min(工作時(shí)間4 s，間歇時(shí)間4 s)，將破碎液在溫度為4 ℃、轉(zhuǎn)速為3 000 r×min-1的條件下離心30 min，獲得BMTA的粗酶液，通過鎳柱進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析純化后的蛋白。

2.2.3 BMTA的酶活力檢測(cè)及酶活單位定義

1 mL反應(yīng)液中有濃度為100 mmol×L-1磷酸鈉緩沖液(pH=8.0)、10 mmol×L-1底物、10 mmol×L-1丙酮酸鈉、0.2 mmol×L-15'-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5'-phosphate，PLP)和0.1 mL酶液，30 ℃反應(yīng)10 min后，取樣300 μL，NaCl飽和，加入10 μL氫氧化鈉(濃度為10 mol×L-1)調(diào)節(jié)溶液pH>10.0，加入300 μL乙酸乙酯(含內(nèi)標(biāo)物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有機(jī)相加無(wú)水硫酸鈉干燥后，氣相檢測(cè)生成-羥基酮的量。1 min內(nèi)催化1 μmol產(chǎn)物生成所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)的濃度[19]。

2.2.4 pH和溫度對(duì)BMTA酶活性的影響

在不同pH值的緩沖溶液中(磷酸鈉緩沖液(100 mmol×L-1，pH為6.0～8.0)、Tris×HCl緩沖液(100 mmol×L-1，pH為8.0～9.0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(50 mmol×L-1，pH為9.0～10.0))測(cè)定BMTA對(duì)()-1c酶活。在最佳pH條件下，在不同溫度(25～65 ℃)下檢測(cè)BMTA對(duì)()-1c的酶活(參照2.2.3節(jié))。

2.2.5 pH和溫度對(duì)BMTA穩(wěn)定性的影響

將BMTA置于2.2.4節(jié)不同pH的緩沖液中，于4 ℃下保存，不同時(shí)間取樣檢測(cè)該酶的殘余酶活。將BMTA置于磷酸鈉緩沖液(100 mmol×L-1，pH=7.5)中，分別在4～50 ℃的水浴中孵育，不同時(shí)間取樣檢測(cè)該酶的殘余酶活(參照2.2.3節(jié))。

2.2.6 BMTA動(dòng)力學(xué)拆分外消旋-氨基醇

5 mL反應(yīng)體系中有濃度為100 mmol×L-1磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)、5～20 mmol×L-1底物((±)-1a-l)、0.2 mmol×L-1PLP、5～20 mmol×L-1丙酮酸鈉、質(zhì)量濃度為10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的條件下反應(yīng)12～24 h，取樣300 μL，NaCl飽和，加入10 μL NaOH (10 mol×L-1)調(diào)節(jié)溶液pH>10.0，加入300 μL乙酸乙酯(含內(nèi)標(biāo)物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有機(jī)相加無(wú)水硫酸鈉干燥后，氣相檢測(cè)生成-羥基酮的量以及底物的對(duì)映體過量百分?jǐn)?shù)(electrical engineering, ee)，反應(yīng)路線如圖1所示。

圖1 ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA拆分外消旋β-氨基醇

2.2.7 BMTA不對(duì)稱還原胺化-羥基酮

5 mL反應(yīng)體系中有濃度為100 mmol×L-1磷酸鈉緩沖液(pH=7.5)、10～20 mmol×L-1-羥基酮底物(2a-f)、0.2 mmol×L-1PLP、200～400 mmol×L-1L-丙氨酸、質(zhì)量濃度為10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的條件下反應(yīng)10～20 h，取樣300 μL，NaCl飽和，加入10 μL NaOH(10 mol×L-1)調(diào)節(jié)溶液pH>10.0，加入300 μL乙酸乙酯(含內(nèi)標(biāo)物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有機(jī)相加無(wú)水硫酸鈉干燥后，氣相檢測(cè)生成-氨基醇的量以及產(chǎn)物的ee值，反應(yīng)路線如圖2所示。

圖2 ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA催化α-羥基酮不對(duì)稱還原胺化

2.2.8 BMTA動(dòng)力學(xué)拆分(±)-1c制備()-1c

100 mL反應(yīng)體系中有濃度為100 mmol×L-1磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)、20 mmol×L-1底物((±)-1c)、0.2 mmol×L-1PLP、20 mmol×L-1丙酮酸鈉、質(zhì)量濃度為10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的條件下反應(yīng)24 h，反應(yīng)液中加NaCl飽和，加入鹽酸使溶液pH<2，100 mL乙酸乙酯連續(xù)萃取3次去除所提取的-羥基酮。加入NaOH溶液(10 mol×L-1)使溶液pH>10，100 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，有機(jī)相加無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到的產(chǎn)物真空干燥過夜，計(jì)算產(chǎn)物得率。

2.2.9 分析方法

使用氣相色譜分析轉(zhuǎn)化率和ee值，具體方法按照Z(yǔ)hang等的方法進(jìn)行[9]。

3 結(jié)果與討論

3.1 BMTA的表達(dá)、純化和酶活檢測(cè)

如圖3(a)所示，在蛋白質(zhì)相對(duì)分子量r=53 000處出現(xiàn)與BMTA理論大小一致的目的條帶，證明BMTA在大腸桿菌中成功表達(dá)，并且大多為可溶性表達(dá)(如圖3(a)所示，lane 2)，僅產(chǎn)生少量包涵體蛋白(圖3(a)，lane 3)。粗酶液經(jīng)鎳柱純化后，得到單一的目的蛋白條帶(圖3(b)，lanes 7～8)。對(duì)純酶酶活分析發(fā)現(xiàn)，BMTA對(duì)()-1c有較高酶活(1.1 U×mg-1)，對(duì)()-1c無(wú)活性。Nobili等[16]通過對(duì)來(lái)自的轉(zhuǎn)氨酶vfTA進(jìn)行蛋白質(zhì)改造來(lái)提高其催化活力，對(duì)()-苯甘氨醇的催化活力僅為0.53 U×mg-1。BMTA作為一種()-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，可立體選擇性轉(zhuǎn)化()--氨基醇，這一現(xiàn)象可用Cahn-Ingold-Prelog規(guī)則來(lái)解釋[17]。

圖3 ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳圖

3.2 pH對(duì)BMTA活性及穩(wěn)定性的影響

如圖4(a)所示，BMTA的最合適pH=7.5，當(dāng)pH=6.5～8.0時(shí)，BMTA相對(duì)酶活穩(wěn)定在80% 以上，當(dāng)pH>8.5或者pH<6.5時(shí)，酶活迅速下降。如圖4(b)所示，BMTA在pH=7.0的條件下較穩(wěn)定，該條件下孵育24 h，殘余酶活仍保持在74% 以上；在pH=7.5的條件下孵育24 h，殘余酶活保持在65% 以上。當(dāng)pH>8.5或pH<6.5時(shí)，BMTA酶活損失較大。BMTA在pH=7.0～8.0較穩(wěn)定，而多數(shù)已報(bào)道的轉(zhuǎn)氨酶的最適pH偏高，如Shin等[20]報(bào)道的來(lái)自JS17的轉(zhuǎn)氨酶vfTA的最適pH=9.2，當(dāng)pH>9.0時(shí)，酶穩(wěn)定性迅速下降。

圖4 pH對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA活性及穩(wěn)定性的影響

3.3 溫度對(duì)BMTA活性及穩(wěn)定性的影響

如圖5(a)所示，BMTA的最合適反應(yīng)溫度為55 ℃，高于60 ℃或低于50 ℃條件下，酶活迅速下降。BMTA溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖5(b)所示，BMTA在溫度為30 ℃下孵育24 h，殘余酶活仍保持在50% 以上。在50 ℃下孵育9 h后酶活基本喪失，顯示該酶在低于40 ℃溫度下具有較好的穩(wěn)定性。該結(jié)果與已報(bào)道的大多數(shù)轉(zhuǎn)氨酶相似，如來(lái)自結(jié)核分枝桿菌()的()-轉(zhuǎn)氨酶MVTA[9]，當(dāng)溫度高于40 ℃后，該酶酶活迅速下降。

圖5 溫度對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶BMTA活性及穩(wěn)定性的影響

3.4 BMTA的底物特異性

BMTA對(duì)不同-氨基醇的酶活如表1所示，對(duì)鏈狀-氨基醇()-1a的活性較低(0.152 U×mg-1)，而對(duì)含支鏈的鏈狀-氨基醇()-1b活性較高(1.083 U×mg-1)；BMTA對(duì)含苯環(huán)-氨基醇()-1c的活性最高(1.107 U×mg-1)，對(duì)苯環(huán)對(duì)位含有鹵素取代基的底物(()-1d-f)的活性呈下降趨勢(shì)，為0.658～0.353 U×mg-1；BMTA對(duì)苯環(huán)對(duì)位含─CF3取代基的底物(()-1h)有較高活性(0.624 U×mg-1)；當(dāng)?shù)孜锏谋江h(huán)間位被鹵素取代后(()-1j-k)，BMTA的活性也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，為0.758～0.346 U×mg-1。BMTA對(duì)所有()-底物(1a-l)沒有活性，可見BMTA對(duì)-氨基醇具有極高的立體選擇性。

表1 BMTA對(duì)不同底物的酶活性

3.5 BMTA動(dòng)力學(xué)拆分外消旋β-氨基醇

如表2所示，BMTA對(duì)底物(±)-1a活性較低，反應(yīng)24 h后，底物轉(zhuǎn)化率僅有31.5%，ee值為50.1%；對(duì)其他底物(±)-1b-l，BMTA的活性較高，反應(yīng)12～24 h，底物完全被拆分，底物轉(zhuǎn)化率為50%左右，ee>98%。

表2 BMTA拆分外消旋β-氨基醇

3.6 BMTA不對(duì)稱還原胺化α-羥基酮

如表3所示，BMTA對(duì)6種-羥基酮進(jìn)行不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)。反應(yīng)10 h，底物2b-2d的轉(zhuǎn)化率可達(dá)93% 以上，而底物2e轉(zhuǎn)化率可達(dá)85.3%，產(chǎn)物ee>99%。進(jìn)一步提高底物2c濃度至20 mmol×L-1，反應(yīng)20 h，底物轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)95.2%。BMTA對(duì)2a和2f活力較低，反應(yīng)10 h，轉(zhuǎn)化率分別為58% 和60%。與BMTA相比，目前已報(bào)道轉(zhuǎn)氨酶催化-羥基酮還原胺化活力普遍較低，如Nobili等[16]通過對(duì)來(lái)自的轉(zhuǎn)氨酶vfTA進(jìn)行蛋白質(zhì)改造來(lái)提高其催化活力，但產(chǎn)物()-苯甘氨醇得率僅有60%。

表3 BMTA不對(duì)稱還原胺化α-羥基酮

3.7 BMTA動(dòng)力學(xué)拆分(±)-1c制備(S)-1c

在100 mL的反應(yīng)體系中對(duì)20 mmol×L-1(±)-1c (275 mg)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分，反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%。經(jīng)純化后獲得110.4 mg ()-1c，得率為40.2%，純度>98%，ee>99%。

4 結(jié)論

對(duì)來(lái)自巨大芽孢桿菌(SC6394)的一個(gè)()-選擇性-轉(zhuǎn)氨酶BMTA基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，并成功在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，對(duì)酶進(jìn)行了純化和表征。研究發(fā)現(xiàn)，在溫度為30 ℃、pH=7.5的條件下，且在PLP和丙酮酸鈉存在時(shí)，BMTA可以拆分外消旋-氨基醇合成()--氨基醇；在30 ℃、pH=7.5的條件下，且在PLP和L-丙氨酸存在時(shí)，BMTA可不對(duì)稱還原胺化-羥基酮合成()--氨基醇。此外，在100 mL的反應(yīng)體系中對(duì)外消旋苯甘氨醇進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)拆分，成功制備了()-1c，得率高達(dá)40.2%，ee>99%。本研究證明了BMTA對(duì)-氨基醇類化合物具有較高的活力和極好的立體選擇性，對(duì)手性β-氨基醇類藥物中間體工業(yè)化生產(chǎn)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Synthesis of chiral-amino alcohols by-transaminases from

YANG Xiao-xiao, LI Jing, ZHANG Chao-feng, CHANG Hong-hong, ZHANG Jian-dong

(College of Biomedical Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China)

()-transaminases available for chiral-amino alcohol synthesis are limited. A ()--transaminase (BMTA) gene (fromSC6394) codons was optimized and overexpressed in, and it was purified and characterized. The results show that the BMTA had high activity toward ()--amino alcohols, but no activity toward ()--amino alcohols. The maximum activity of BMTA was detected at pH 7.5 and 55 ℃, and it had good stability at pHs from 6.5 to 8.0 and temperatures from 4 ℃ to 30 ℃. Kinetic resolution of a set of racemic-amino alcohols by BMTA resulted in 50% conversion of substrates with 50%-99% ee of ()--amino alcohols. Asymmetric reductive amination of several-hydroxy ketones by BMTA resulted in 58%-96% conversions and >99% ee of ()--amino alcohols.

-transaminase; chiral-amino alcohols;-hydroxy ketones; kinetic resolution; asymmetric reduction amination

1003-9015(2021)06-1035-06

Q555.2

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.06.011

2020-10-16；

2020-12-29。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21772141)；山西省青年基金 (201701D221042)。

楊曉曉(1996-)，女，山西臨汾人，太原理工大學(xué)碩士生。

張建棟，E-mail：zhangjiandong@tyut.edu.cn