促進(jìn)堆肥二次發(fā)酵真菌在堆肥中的應(yīng)用效果

魏啟航，馮瑤，馬倩倩，李艷麗，劉元望，李兆君，任艷芳

促進(jìn)堆肥二次發(fā)酵真菌在堆肥中的應(yīng)用效果

1常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇常州 213164；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

【目的】二次發(fā)酵是實(shí)現(xiàn)雞糞等養(yǎng)殖廢棄物功能價(jià)值提高的關(guān)鍵階段，本研究旨在將前期篩選得到的真菌應(yīng)用于雞糞堆肥的二次發(fā)酵階段，探討其促進(jìn)二次發(fā)酵的效果并對其進(jìn)行鑒定，為今后雞糞的高值化與資源化利用提供理論依據(jù)和支撐。【方法】以雞糞一次發(fā)酵產(chǎn)物為原料，添加實(shí)驗(yàn)室前期篩選的2株真菌（分別為FCM1和FCM3）進(jìn)行二次發(fā)酵試驗(yàn)。共設(shè)置3個(gè)處理，分別為對照CK：原料中加入1%（體積L∶干物質(zhì)量kg）無菌液體培養(yǎng)基；F1：原料中加入1% FCM1菌液；F3：原料中加入1% FCM3菌液。在二次發(fā)酵的不同時(shí)期，分析測定堆體溫度、pH、電導(dǎo)率（EC）、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、種子發(fā)芽指數(shù)以及腐殖酸等指標(biāo)?！窘Y(jié)果】與對照相比，添加真菌主要促進(jìn)了二次發(fā)酵階段快速升溫和腐殖化過程快速進(jìn)行。與未接菌處理相比，真菌FCM3使堆料提前8 d進(jìn)入升溫期，真菌FCM1效果不佳，且在一定程度上延后了雞糞堆肥的二次發(fā)酵。F3處理高溫階段（>50℃）持續(xù)了13 d，堆料的GI比對照處理提前25 d達(dá)到80%，且腐殖化程度較高（PHA=74.58%，PHA：胡敏酸/總腐殖酸）。相關(guān)分析表明，GI與pH、PHA顯著正相關(guān)，與EC顯著負(fù)相關(guān)。經(jīng)形態(tài)和ITS rDNA測序等方法鑒定，F(xiàn)CM3為鏈格孢菌?！窘Y(jié)論】真菌FCM3能夠在一定程度上促進(jìn)雞糞堆肥二次發(fā)酵的進(jìn)行，提高堆料的腐殖化程度。

二次發(fā)酵；真菌；堆肥腐熟；高值化；鏈格孢菌

0 引言

【研究意義】據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，我國畜禽糞便產(chǎn)生量增速放緩，總量逐漸趨于穩(wěn)定[1]，每年產(chǎn)生的養(yǎng)殖廢棄物可達(dá)38億噸，但綜合利用率不到60%[2]。那些未能資源化利用或未經(jīng)過無害化處理的廢棄物不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，而且在一定程度上危害人畜健康[3-4]。為了全面推進(jìn)畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用，國務(wù)院辦公廳印發(fā)的《關(guān)于促進(jìn)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的意見》[5]提出，到2030年全國畜禽糞污綜合利用率達(dá)到85%以上。因此，如何提高畜禽養(yǎng)殖廢棄物的綜合利用率已成為當(dāng)前亟待解決的問題。【前人研究進(jìn)展】好氧堆肥是畜禽廢棄物無害化處理和資源化利用的重要方式[6]，在堆肥過程中微生物將易降解的有機(jī)物分解后吸收轉(zhuǎn)化成自身細(xì)胞物質(zhì)，并將不易降解的有機(jī)物分解為無機(jī)物[7]。整個(gè)堆肥過程由一次發(fā)酵和二次發(fā)酵兩個(gè)階段構(gòu)成，其中一次發(fā)酵主要實(shí)現(xiàn)廢棄物的無害化，二次發(fā)酵則是實(shí)現(xiàn)堆肥產(chǎn)品的功能提升[8]。在生產(chǎn)實(shí)際中，基本實(shí)現(xiàn)了堆肥快速進(jìn)行，但是堆肥產(chǎn)品腐熟不完全，肥效低、功能差[9-10]。大量研究表明，接種特異性外源微生物能夠有效促進(jìn)堆體升溫，加快腐熟進(jìn)程，縮短堆肥周期[11-12]。孫旭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，添加腐熟劑能夠促進(jìn)堆肥升溫，減少堆肥產(chǎn)品的毒性，促進(jìn)堆料腐殖化從而縮短了堆肥時(shí)間。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，接種特定微生物可以提高牛糞堆肥的升溫速率，有利于減少堆肥時(shí)間，促進(jìn)牛糞腐熟。但是，上述研究大多數(shù)只針對堆肥過程的一次發(fā)酵，鮮見有針對堆肥二次發(fā)酵過程的研究報(bào)道，究其原因是堆肥初始階段添加的微生物等腐熟劑，大部分作用于一次發(fā)酵過程，促進(jìn)雞糞等堆料的快速升溫，鮮見有作用于堆肥二次發(fā)酵過程。【本研究切入點(diǎn)】鑒于此，本研究以前期從堆肥二次發(fā)酵階段的堆體中篩選得到的真菌為研究對象，以雞糞一次發(fā)酵產(chǎn)物為原料，進(jìn)行二次發(fā)酵試驗(yàn)，探討其促進(jìn)二次發(fā)酵的效果并對其進(jìn)行鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在將前期通過篩選得到的真菌應(yīng)用于雞糞堆肥的二次發(fā)酵階段，探討其促進(jìn)二次發(fā)酵的效果，以期為今后雞糞的高值化與資源化利用提供理論依據(jù)和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌株FCM1和FCM3是由實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選獲得的真菌。

二次發(fā)酵試驗(yàn)于2019年10—12月在唐山市樂亭縣京臺四方（唐山）生物科技有限公司進(jìn)行，以該公司經(jīng)過一次發(fā)酵無害化后的物料（雞糞和食用菌渣混合堆肥10 d后的堆料，一次發(fā)酵最高溫度為60℃，50℃以上高溫持續(xù)5 d）為試驗(yàn)原料，其理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 培養(yǎng)基與菌劑的制備

真菌所用培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，酵母粉2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 6.2—6.6。

表1 堆肥原料理化性質(zhì)

將斜面保存的兩株真菌分別接種至改良馬丁培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，然后將活化后的真菌接種至液體改良馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制成菌液。

1.3 堆肥二次發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理。（1）對照CK：原料中加入1%無菌液體培養(yǎng)基；（2）F1：原料中加入1% FCM1菌液；（3）F3：原料中加入1% FCM3菌液；1%指菌液體積（單位：L）與干物質(zhì)量（單位：kg）之比。所用原料為經(jīng)過一次發(fā)酵后的物料（見1.1），各處理堆料和菌液充分混勻后準(zhǔn)確稱量60 kg裝入泡沫箱中進(jìn)行堆肥二次發(fā)酵試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。堆肥過程中根據(jù)堆體溫度變化每3天翻堆一次。

試驗(yàn)在堆肥的第1、7、14、21、28、35、45、60天結(jié)合翻堆進(jìn)行采樣，采集的樣品分成兩份。其中一份烘干、粉碎過篩后測定腐殖酸、胡敏酸和富里酸含量；另一份置于-20℃保存，用于pH、EC、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮以及種子發(fā)芽指數(shù)的測定。

1.3.2 測定項(xiàng)目及方法 每日9：00用溫度計(jì)測定堆體中間的溫度及環(huán)境溫度；取新鮮樣品按水樣比10∶1（v/m）充分?jǐn)嚢杌靹蚝箪o置0.5 h，采用pH計(jì)和電導(dǎo)儀測定pH和EC值[15]；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用2 mol·L-1KCl浸提，然后分別通過靛酚藍(lán)比色法[16]和紫外分光光度法[17]測定。

種子發(fā)芽指數(shù)[17]的測定方法如下：稱取10 g堆肥樣品置于含有90 mL去離子水的三角瓶中，放置于搖床中振蕩浸提1 h后過濾，吸取該濾液10mL，加到鋪有1張濾紙的培養(yǎng)皿（內(nèi)徑9cm）內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿點(diǎn)播10粒飽滿的小麥種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，取蒸餾水代替浸提液作為空白對照，在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)72h后測量發(fā)芽率和根長，根據(jù)以下公式計(jì)算種子的發(fā)芽指數(shù)：

種子發(fā)芽指數(shù)（GI）=（處理組發(fā)芽率×處理組根長）/（空白組發(fā)芽率×空白組根長）×100%。

總腐殖酸采用堿性焦磷酸鈉浸提-重鉻酸鉀容量法測定[18]；取總腐殖酸浸提液用濃鹽酸酸化至pH=1，靜置過夜后離心得到沉淀物為胡敏酸，用氫氧化鈉溶解-重鉻酸鉀容量法測定其含量；富里酸含量用總腐殖酸含量減去胡敏酸含量[19]。

1.4 菌株的鑒定

將真菌FCM3接種到改良馬丁培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)。由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行ITS rDNA測序分析，通過DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA。PCR擴(kuò)增：正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、反向引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。測序獲得的FCM3序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，然后采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS statistics 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 添加真菌對堆肥二次發(fā)酵階段溫度的影響

圖1顯示了二次發(fā)酵過程中堆體和環(huán)境溫度的變化。由圖可知，二次發(fā)酵原料仍含有未腐熟的物料，因此本試驗(yàn)中各處理都經(jīng)歷了升溫和降溫的過程，最終與環(huán)境溫度變化趨于一致。CK、F1和F3處理分別于堆肥第19、24和11天開始升溫，至堆肥第27、35和17天達(dá)到最高溫度（分別為50、53.7和58.3℃）。其中，F(xiàn)3處理不僅升溫快，而且高溫（>50℃）持續(xù)時(shí)間長（13 d），分別比CK、F1處理多了12和11 d。

圖1 堆肥二次發(fā)酵過程中溫度的變化

2.2 添加真菌對堆肥二次發(fā)酵階段pH和EC的影響

不同處理二次發(fā)酵過程中pH和電導(dǎo)率（EC）的變化如圖2所示。整體上看，各處理的pH和EC變化趨勢大致相同，pH呈上升的趨勢，EC呈現(xiàn)下降的趨勢。由圖2-A可知，發(fā)酵初始階段各處理的pH略有降低，但從第14天開始各處理的pH顯著升高并在第45天達(dá)到最大值，之后緩慢下降直至試驗(yàn)結(jié)束，最終各處理的pH穩(wěn)定在9.0左右。二次發(fā)酵的第21—28天期間，各處理的pH差異顯著，但隨著二次發(fā)酵的進(jìn)行，處理間差異逐漸減小直至堆肥結(jié)束。由圖2-B可知，堆肥二次發(fā)酵過程中各處理的EC不斷降低，但在二次發(fā)酵的第14—21天期間，F(xiàn)3處理的EC迅速降低使其顯著低于其他處理，這可能是因?yàn)镕CM3菌株的添加促進(jìn)了堆體升溫，導(dǎo)致該階段腐殖化過程加快。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各處理的EC在3.1—3.2 mS·cm-1之間。

2.3 添加真菌對堆肥二次發(fā)酵階段NH4+-N含量、NO3--N含量的影響

由圖3-A可知，各處理的NH4+-N含量呈現(xiàn)先下降后升高的變化趨勢，CK、F1和F3處理的NH4+-N含量分別在發(fā)酵21、28和14 d達(dá)到最低值，與各處理的升溫時(shí)間（19、24和11 d）基本對應(yīng)，說明NH4+-N含量變化與溫度密切相關(guān)，隨著溫度的升高而增加。第21天后，F(xiàn)3處理的NH4+-N含量顯著高于其他處理，與pH的變化趨勢基本一致。由圖3-B可知，各處理的NO3--N含量前期變化波動較大，而后期變化趨勢大致相同。CK和F1處理的NO3--N含量在28 d達(dá)到最高值，而F3處理則在14 d達(dá)到最高值。二次發(fā)酵第21天后，F(xiàn)3處理的NO3--N含量低于其他處理，與NH4+-N含量的結(jié)果相反。

圖2 堆肥二次發(fā)酵過程中pH和EC的變化

圖3 堆肥二次發(fā)酵過程中NH4+-N與NO3--N含量的變化

2.4 添加真菌對堆肥二次發(fā)酵階段種子發(fā)芽指數(shù)的影響

種子發(fā)芽指數(shù)（GI）可以直接體現(xiàn)出堆料的植物毒性，所以通常用來判斷堆肥的腐熟程度。一般認(rèn)為，當(dāng)GI值大于80%時(shí)，堆料完全腐熟并且無植物毒性[20]。如圖4所示，隨著二次發(fā)酵時(shí)間的推移，各處理的GI呈現(xiàn)先下降而后升高的變化趨勢。F3處理的GI則顯著高于CK和F1處理，在35 d時(shí)達(dá)到87.5%，表明該處理已達(dá)到完全腐熟，分別比CK、F1處理提前了25和10 d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CK、F1和F3處理的GI分別為86.3%、92.9%和108.0%。

圖4 堆肥二次發(fā)酵過程中種子發(fā)芽指數(shù)（GI）的變化

2.5 添加真菌對堆肥二次發(fā)酵階段總腐殖酸、胡敏酸以及富里酸的影響

各處理的總腐殖酸、胡敏酸和富里酸含量變化如圖5所示。由圖5-A可知，CK和F1處理的總腐殖酸含量在初始階段先升高，至第7天時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢；而F3處理的腐殖酸含量在發(fā)酵過程中持續(xù)降低且低于其他處理，這可能是由于添加的真菌FCM3促進(jìn)堆體升溫，提高微生物活性從而迅速降解堆料中易降解的腐殖酸。然而，當(dāng)堆肥結(jié)束時(shí)，各處理的總腐殖酸含量都保持在180 g·kg-1左右。

圖5 堆肥二次發(fā)酵過程中總腐殖酸、胡敏酸、富里酸含量及PHA的變化

由圖5-B可知，CK和F1處理的胡敏酸含量在第7天時(shí)分別達(dá)到最大值148.0 g·kg-1和144.6 g·kg-1，但隨著二次發(fā)酵的進(jìn)行，胡敏酸含量不斷降低；而F3處理的胡敏酸含量變化較為穩(wěn)定，雖然前期低于其他處理，但當(dāng)堆肥結(jié)束時(shí)卻高于CK和F1處理，這可能是由于真菌FCM3促進(jìn)了堆肥腐殖化作用，在高溫期將難降解的有機(jī)質(zhì)分解成小分子物質(zhì)后又形成穩(wěn)定的胡敏酸。與初始階段相比，堆肥結(jié)束時(shí)CK處理的胡敏酸含量降低了13.6 g·kg-1，而F1和F3處理分別升高了4.0和7.7 g·kg-1，這表明添加真菌后有利于胡敏酸的生成，且真菌FCM3效果顯著。

發(fā)酵過程中，富里酸含量的變化與腐殖酸含量的變化相似（圖5-C）?？傮w上富里酸含量呈下降趨勢，當(dāng)堆肥結(jié)束時(shí)，CK、F1和F3處理的富里酸含量分別為65.6、58.8和45.2 g·kg-1，F(xiàn)3處理的富里酸含量顯著低于其他處理。

PHA（胡敏酸/總腐殖酸）是用于評價(jià)堆肥腐殖化程度的重要參數(shù)[21]。由圖5-D可知，隨著堆肥發(fā)酵的進(jìn)行，各處理的PHA大致呈上升趨勢。與CK和F1處理相比，F(xiàn)3處理的PHA在14—21 d迅速升高，且21 d后高于其他處理。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CK、F1和F3處理的PHA增幅分別為7.8%、13.4%和19.1%，以F3處理增幅最大，更有利于提高堆肥品質(zhì)。

2.6 添加FCM3后堆肥二次發(fā)酵階段堆料的變化

由圖6可以看出，堆體表層出現(xiàn)少量白色真菌（7 d），而CK處理無明顯變化，可以推測此白色真菌為FCM3。隨著FCM3的生長，堆體表層遍布白色菌絲（14 d），而此時(shí)堆體的溫度不斷升高，這表明FCM3的生長有效促進(jìn)了堆體升溫。然而，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)FCM3大量休眠或死亡（21 d）。第28 d時(shí)，堆體表層還有少量白色菌絲，此時(shí)堆料接近腐熟（GI=77.1%）；直至35 d時(shí)，白色菌絲消失，堆體溫度不斷降低并趨于環(huán)境溫度，堆料完全腐熟。最終，45 d時(shí)堆料中塊狀物減少且顏色呈現(xiàn)黑褐色。

圖6 堆肥二次發(fā)酵過程中F3處理堆料的變化

2.7 堆肥二次發(fā)酵階段F3處理各指標(biāo)之間相關(guān)性

GI是評價(jià)堆肥腐熟程度最常用的指標(biāo)[17,20,22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3處理的GI顯著高于其他處理，二次發(fā)酵腐熟程度最高，為研究該處理發(fā)酵過程中與GI相關(guān)的影響因素，該部分分析了F3處理中GI與pH、EC、NH4+-N、NO3--N和PHA的Pearson相關(guān)性（表2）。結(jié)果顯示F3處理的GI與pH、EC、NH4+-N以及PHA極顯著相關(guān)（|r|>0.85）。此外，由表2還可以發(fā)現(xiàn)pH、NH4+-N和PHA兩兩之間存在顯著正相關(guān)性，EC與這3個(gè)指標(biāo)之間則存在顯著負(fù)相關(guān)性，而NO3--N與其他指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性。

表2 F3處理各指標(biāo)Pearson相關(guān)性分析

*表示在0.05水平上顯著相關(guān)；**表示在0.01水平上顯著相關(guān)

*Indicate significant correlation at 0.05 level;**Indicates significant correlation at 0.01 level

2.8 FCM3鑒定結(jié)果

真菌FCM3在改良馬丁培養(yǎng)基平板上25℃恒溫培養(yǎng)7 d，其形態(tài)如圖7所示。菌落初期為白色、絮狀，背面呈淺褐色；老后變暗，背面呈黑褐色；7 d后菌落直徑可達(dá)70 mm。提取FCM3菌株進(jìn)行ITS rDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，真菌FCM3與sp（MN856387.1）基因序列同源性最高，達(dá)到99.81%，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖8所示。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定，可以確定其為鏈格孢菌。

圖7 FCM3菌落形態(tài)

圖8 FCM3系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 鏈格孢菌應(yīng)用于堆肥二次發(fā)酵的可行性

好氧堆肥是畜禽廢棄物資源化、無害化處理的重要途徑[6]。目前，在商業(yè)化生產(chǎn)中，由于堆肥周期過長、場地有限以及發(fā)酵不充分等問題，嚴(yán)重限制了有機(jī)肥生產(chǎn)效率和堆肥品質(zhì)。通過接種特異性外源微生物可以有效縮短堆肥周期，提高好氧堆肥的效率[12-14]。因此，用于堆肥的菌株篩選已成為研究熱點(diǎn)[9-11]。目前絕大多數(shù)菌劑主要作用于堆肥一次發(fā)酵階段，然而越來越多的研究表明，添加菌劑雖然有效促進(jìn)了堆肥升溫、提高了堆肥效率，但是最終堆料卻難以完全腐熟。王玉等[23]在研究豬糞和秸稈堆肥時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種極端嗜熱功能菌劑的處理最終GI為72.1%。王信等[24]為了篩選高效促進(jìn)牛糞發(fā)酵的菌劑，將4株菌根據(jù)不同比例配制成7種菌劑。結(jié)果表明，堆肥結(jié)束時(shí)各處理的GI均低于80%。因此，為了進(jìn)一步提高堆肥品質(zhì)及其功能，在二次發(fā)酵前添加菌劑不僅具有一定的理論意義，同時(shí)也具有較高的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。目前，常用于堆肥發(fā)酵的菌株主要有不動桿菌、芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉[9,13-14,25]等，而鏈格孢菌往往被作為植物致病菌研究其危害[26]。然而，并非所有的鏈格孢菌均會對植物產(chǎn)生危害[27]。研究表明，從交鏈孢菌中分離得到的極細(xì)鏈格孢激活蛋白不僅可以提高植物免疫力，還能夠促進(jìn)植物生長并提高葉綠素含量[28]。YANG等[29]研究鏈格孢菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的毒素可以提高玫瑰的免疫力，對玫瑰蚜蟲具有良好的防治作用。本研究發(fā)現(xiàn)，添加鏈格孢菌后堆料的種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他處理，并未危害種子的生長。此外，F(xiàn)3處理的高溫期持續(xù)了13 d，實(shí)現(xiàn)了畜禽糞便的無害化處理[30]。

3.2 接種菌劑對堆肥二次發(fā)酵過程的影響

堆肥二次發(fā)酵過程中各項(xiàng)指標(biāo)均有較大變化。溫度和pH能夠直接體現(xiàn)堆肥發(fā)酵的過程，本研究結(jié)果表明，與對照相比，添加真菌FCM3的處理不僅升溫快，且高溫（>50℃）持續(xù)時(shí)間也最長（13 d），比CK處理多了12 d。與LIU等[14]的菌劑相比，本研究所得到的菌株FCM3促進(jìn)升溫效果更加顯著。而pH的變化是堆肥過程中含碳有機(jī)物所產(chǎn)生的有機(jī)酸和含氮有機(jī)物所產(chǎn)生的氨共同作用的結(jié)果[31]。試驗(yàn)以一次發(fā)酵后的物料為原料進(jìn)行二次發(fā)酵試驗(yàn)，微生物分解含碳有機(jī)物產(chǎn)生的小分子有機(jī)酸含量較高，導(dǎo)致二次發(fā)酵初期各處理的pH較低，但是當(dāng)各處理進(jìn)入升溫期后可能其中的氨化細(xì)菌反應(yīng)劇烈，且小分子有機(jī)酸也進(jìn)一步被腐殖化，使得堆體pH持續(xù)升高[32]；45 d后各處理的pH呈現(xiàn)略微下降趨勢（圖3-A），可能是由于硝化作用逐漸增強(qiáng)，堆體中銨態(tài)氮不斷被轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[33]。HUANG等[34]研究豬糞和木屑堆肥時(shí)發(fā)現(xiàn)，堆肥期間各處理EC呈先升高后降低趨勢，其降低的過程正好處于堆肥二次發(fā)酵階段。本試驗(yàn)結(jié)果與之相同，堆肥二次發(fā)酵過程中各處理的EC不斷降低，這可能是由于可溶性鹽與其他有機(jī)小分子物質(zhì)參與了腐殖化過程而導(dǎo)致其沉淀或固定[35]。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各處理的EC均低于4 mS·cm-1，不會對植物生長造成危害[36]。本試驗(yàn)對二次發(fā)酵過程中NH4+-N含量和NO3--N含量也進(jìn)行了測定，結(jié)果表明二次發(fā)酵過程中F3處理的NH4+-N含量較高，NO3--N含量卻低于其他處理，這可能是由于其更長的高溫期使堆體中有機(jī)物分解產(chǎn)生更多的NH3，其中一部分NH3溶于水形成NH4+-N，導(dǎo)致F3處理的NH4+-N含量和pH偏高；而另一部分NH3則散于空氣造成氮損失，導(dǎo)致硝化作用產(chǎn)生的NO3--N含量低于其他處理[37]。研究表明，堆肥腐熟時(shí)NH4+-N含量應(yīng)低于400 mg·kg-1，NH4+-N/NO3--N的值應(yīng)小于0.16[30,38]。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CK、F1和F3處理的NH4+-N含量分別為194.9、188.6和201.1 mg·kg-1，NH4+-N/NO3--N的值分別為0.031、0.028和0.038，兩項(xiàng)指標(biāo)均表明堆料已經(jīng)腐熟。很多研究表明，當(dāng)GI＞80%時(shí)堆料完全腐熟[39]。本研究發(fā)現(xiàn)F3處理的GI顯著高于其他處理，并在35 d達(dá)到完全腐熟，分別比CK、F1處理提前25和10 d，這表明真菌FCM3可以有效促進(jìn)堆肥腐熟、使堆料無害化。此外，以往的研究表明，堆料中NH4+-N含量的增加會提高植物毒性[40-41]。本研究卻發(fā)現(xiàn)F3處理的GI與NH4+-N之間存在顯著正相關(guān)性，這是由于NH4+-N含量雖呈升高趨勢但總量變化較小，僅增加了0.05 g·kg-1，故不會對GI造成明顯影響。綜上分析，真菌FCM3有效促進(jìn)了二次發(fā)酵過程中堆料的腐熟，提高二次發(fā)酵效率。

3.3 接種菌劑對堆肥二次發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響

堆肥過程中，總腐殖酸的含量是由礦化作用和腐殖化作用共同決定的，是評價(jià)堆肥腐熟程度和肥料農(nóng)用效果的重要指標(biāo)[19,42]。本研究二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)各處理的腐殖酸含量都有所降低，這與李恕艷等[19]研究結(jié)果一致。然而，李恕艷等[19]和許修宏等[43]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥結(jié)束時(shí)接種菌劑處理的腐殖酸、胡敏酸和富里酸含量均高于未接菌的處理。而本研究結(jié)果卻不同，堆肥結(jié)束時(shí)雖然添加真菌處理的胡敏酸含量高于CK處理，但總腐殖酸與富里酸的含量卻略低于CK處理。這主要是由于一方面富里酸分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，易被微生物降解[44]；另一方面，可能是由于添加FCM3的處理溫度高于CK處理，微生物活性較強(qiáng)從而迅速降解堆料中易降解的腐殖酸成分。胡敏酸是腐殖酸中分子量大、穩(wěn)定性高的物質(zhì)，且含有多種功能基，如羧基、酚羥基等，也是最有利于土壤修復(fù)的物質(zhì)[45]。PHA為胡敏酸與總腐殖酸比值，其值越高則堆肥氧化程度及芳構(gòu)化程度越高，較高PHA的堆肥產(chǎn)物用于土壤后不僅促進(jìn)植物根部的生長，還可以增強(qiáng)植物呼吸作用和光合作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)F3處理的胡敏酸含量高于其他處理，其PHA也高達(dá)74.6%，比未接菌處理高了11%，這些均表明真菌FCM3提高了雞糞二次發(fā)酵的堆肥品質(zhì)。因此，接種FCM3提高了二次發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，有利于促進(jìn)雞糞的高值化利用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，添加真菌FCM3可以促進(jìn)堆肥二次發(fā)酵階段快速升溫和腐殖化過程快速進(jìn)行。與未接菌處理相比，真菌FCM3使堆料提前8 d進(jìn)入升溫期，真菌FCM1效果不佳，且在一定程度上延后了雞糞堆肥的二次發(fā)酵。F3處理高溫階段（>50℃）持續(xù)了13 d，堆料的GI比對照處理提前25 d達(dá)到80%，且腐殖化程度較高。因此，真菌FCM3能夠在一定程度上促進(jìn)雞糞堆肥二次發(fā)酵的進(jìn)行，提高堆料的品質(zhì)。

[1] 牛新勝, 巨曉棠. 我國有機(jī)肥料資源及利用. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2017, 23(6): 1462-1479.

NIU X S, JU X T. Organic fertilizer resources and utilization in China. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2017, 23(6): 1462-1479. (in Chinese)

[2] 中國物資再生協(xié)會. 《關(guān)于推進(jìn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用試點(diǎn)的方案》解讀. 中國資源綜合利用, 2016, 34(10): 15-16.

China National Resources Recycling Association. Interpretation of the plan for promoting the pilot of agricultural waste recycling. China Resources Comprehensive Utilization, 2016, 34(10): 15-16. (in Chinese)

[3] BLUEMLING B, WANG F. An institutional approach to manure recycling: Conduit brokerage in Sichuan Province, China. Resources, Conservation & Recycling, 2018, 139: 396-406.

[4] DOMINGO J, ROVIRA J, VILAVERT L, NADAL M, FIGUERAS M J, SCHUHMACHER M. Health risks for the population living in the vicinity of an integrated waste management facility: Screening environmental pollutants. Science of the Total Environment, 2015, 518/519: 363-370.

[5] 中華人民共和國國務(wù)院辦公廳. 關(guān)于加快推進(jìn)畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用的意見. 北京: 中華人民共和國國務(wù)院辦公廳, 2020.

General Office of the State Council of the People's Republic of China. Opinions on accelerating resource utilization of livestock and poultry waste. Beijing: General Office of the State Council of the People's Republic of China, 2020. (in Chinese)

[6] CHAURASIA A, MEENA B R, TRIPATHI A N, PANDEY K K, RAI A B, SINGH B. Actinomycetes: an unexplored microorganisms for plant growth promotion and biocontrol in vegetable crops. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2018, 9(34):132.

[7] 曹文勝, 曹軍, 王陽, 劉永德. 微生物接種應(yīng)用于好氧堆肥的研究進(jìn)展. 綠色科技, 2016(24): 18-19, 21.

CAO W S, CAO J, WANG Y, LIU Y D. Application of microbial inoculation in aerobic composting: A review. Journal of Green Science and Technology, 2016(24): 18-19, 21. (in Chinese)

[8] 田偉. 牛糞高溫堆肥過程中的物質(zhì)變化、微生物多樣性以及腐熟度評價(jià)研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

TIAN W. Study of substance change, microbial diversity and maturity assessment during thermophilic composting of dairy manure[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012. (in Chinese)

[9] LI C N, LI H Y, YAO T, SU M, RAN F,HAN B, LI J H, LAN X J, ZHANG Y C, YANG X M, GUN S B. Microbial inoculation influences bacterial community succession and physicochemical characteristics during pig manure composting with corn straw. Bioresource Technology, 2019, 289: 121653.

[10] WANG J Q, LIU Z P, XIA J S, CHEN Y P. Effect of microbial inoculation on physicochemical properties and bacterial community structure of citrus peel composting. Bioresource Technology, 2019, 291: 121843.

[11] XIE X Y, ZHAO Y, SUN Q H, WANG X Q, CUI H Y, ZHANG X, LI Y J, WEI Z M. A novel method for contributing to composting start-up at low temperature by inoculating cold-adapted microbial consortium. Bioresource Technology, 2017, 238: 39-47.

[12] 尹靜, 劉悅秋, 于峰, 蔡建超, 劉天月. 一株木質(zhì)素降解菌的篩選鑒定及其在堆肥中的應(yīng)用. 中國土壤與肥料, 2019(3): 179-185.

YIN J, LIU Y Q, YU F, CAI J C, LIU T Y. Screening and identi6cation of a lignin-degrading bacterium and its application in composting. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2019(3): 179-185. (in Chinese)

[13] 孫旭, 汝超杰, 蘇良湖, 陳玉東, 趙克強(qiáng), 張龍江, 蔡金傍. 3種秸稈腐熟劑微生物組成及其腐熟效果. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(3): 212-215.

SUN X, RU C J, SU L H, CHEN Y D, ZHAO K Q, ZHANG L J, CAI J B. Microbial composition and maturity effect of three straw decomposition agents. Jiangsu Agricultural Sciences, 2018, 46(3): 212-215. (in Chinese)

[14] LIU J, XU X H, LI H T, XU Y. Effect of microbiological inocula on chemical and physical properties and microbial community of cow manure compost. Biomass and Bioenergy, 2011, 35(8): 3433-3439.

[15] RAI R, SUTHAR S. Composting of toxic weed Parthenium hysterophorus: Nutrient changes, the fate of faecal coliforms, and biopesticide property assessment. Bioresource Technology, 2020, 311: 123523.

[16] 王桂珍, 李兆君, 張樹清, 馬曉彤, 梁永超. 碳氮比對雞糞堆肥中土霉素降解和堆肥參數(shù)的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(7): 1399-1407.

WANG G Z, LI Z J, ZHANG S Q, MA X T, LIANG Y C. Influence of C/N ratio on degradation of oxytetracycline and composting parameters during chicken manure composting. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(7): 1399-1407. (in Chinese)

[17] LIU Y W, FENG Y, CHENG D M, XUE J M, WAKELIN S A, HU H Y, LI Z J. Gentamicin degradation and changes in fungal diversity and physicochemical properties during composting of gentamicin production residue. Bioresource Technology, 2017, 244(Part1): 905-912.

[18] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.

BAO S D. Soil and Agricultural Chemistry Analysis. Beijing: China Agriculture Press, 2000. (in Chinese)

[19] 李恕艷, 李吉進(jìn), 張邦喜, 李國學(xué), 李揚(yáng)陽, 李丹陽. 菌劑對雞糞堆肥腐殖質(zhì)含量品質(zhì)的影響. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(S2): 268-274.

LI S Y, LI J J, ZHANG B X, LI G X, LI Y Y, LI D Y. Influence of inoculants on content and quality of humus during chicken manure composting. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2016, 32(S2): 268-274. (in Chinese)

[20] WANG G Y, KONG Y L, LIU Y, LI D Y, ZHANG X H, YUAN J, LI G X. Evolution of phytotoxicity during the active phase of co-composting of chicken manure, tobacco powder and mushroom substrate. Waste Management, 2020, 114: 25-32.

[21] 尹瑞, 張鶴, 邱慧珍, 楊慧珍, 李孟嬋, 張春紅, 王友玲. 不同碳氮比牛糞玉米秸稈堆肥的碳素轉(zhuǎn)化規(guī)律. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(5): 68-78.

YIN R, ZHANG H, QIU H Z, YANG H Z, LI M C, ZHANG C H, WANG Y L. Study on carbon conversion of cow dung/corn straw composting with different C/N ratios. Journal of Gansu Agricultural University, 2019, 54(5): 68-78. (in Chinese)

[22] LIU H J, HUANG Y, DUAN W D, QIAO C C, SHEN Q R, LI R. Microbial community composition turnover and function in the mesophilic phase predetermine chicken manure composting efficiency. Bioresource Technology, 2020, 313: 123658.

[23] 王玉, 張晶, 曹云, 吳華山, 黃紅英, 劉愛民. 極端嗜熱功能菌篩選及其促進(jìn)堆肥腐熟效果研究. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 39(7): 1633-1642.

WANG Y, ZHANG J, CAO Y, WU H S, HUANG H Y, LIU A M. Screening of functional extreme thermophiles and their effects on improving the maturation of composting. Journal of Agro- Environment Science, 2020, 39(7): 1633-1642. (in Chinese)

[24] 王信, 蔡曉劍, 王亞藝, 徐仲陽, 高旭升, 李松齡. 牛糞高溫好氧堆肥中發(fā)酵菌劑篩選研究. 青海大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 37(5): 20-25.

WANG X, CAI X J, WANG Y Y, XU Z Y, GAO X S, LI S L. Screening of fermentation agents in cow manure during its aerobic composting. Journal of Qinghai University, 2019, 37(5): 20-25. (in Chinese)

[25] 戴美玲, 江濤, 譚美, 盧盛杰, 何偉豪, 張振宇, 向鐵軍. 微生物菌劑對菜粕堆肥的影響及堆肥腐熟度評價(jià). 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020(2): 29-32, 36.

DAI M L, JIANG T, TAN M, LU S J, HE W H, ZHANG Z Y, XIANG T J. Effect ?of ?microbial? agents ?on? rapeseed ?meal? composting ?and evaluation ?of?? compost ?maturity. Hunan Agricultural Sciences, 2020(2): 29-32, 36. (in Chinese)

[26] 高芬, 吳元華. 鏈格孢屬（Alternaria）真菌病害的生物防治研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2008(3): 1-6.

GAO F, WU Y H. Progresses in the biocontrol of plant diseases caused by Alternaria. Plant Protection, 2008(3): 1-6. (in Chinese)

[27] 李朋華. 部分鏈格孢屬真菌的形態(tài)學(xué)及多基因鑒定. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

LI P H. Identifiation of partial Alternaria by morphology and multiple-gene analysis. Henan Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[28] 李宏光, 易圖永, 肖艷松, 巢進(jìn), 方明. 7%井岡霉素·極細(xì)鏈格孢激活蛋白可濕性粉劑對煙草病毒病的防效研究. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2014(24): 126, 131.

LI H G, YI T Y, XIAO Y S, CHAO J, FANG M.Study on the Control Effect of 7 % Jinggangmycin·Alternaria activator protein wettable powder on tobacco virus disease. Modern Agricultural Science and Technology, 2014(24): 126, 131. (in Chinese)

[29] YANG F Z, YANG B, LI B B, XIAO C. Alternaria toxin-induced resistance in rose plants against rose aphid (): effect of tenuaonic acid. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B(Biomedicine & Biotechnology), 2015, 16(4): 264-274.

[30] XU Y L, LI X Y, CONG C, GONG G L, XU Y P, CHE J, HOU F Q, CHEN H L, WANG L L. Use of resistantstrains to control wheat sharp eyespot using organically developed pig manure fertilizer. Science of the Total Environment, 2020, 726: 138568.

[31] LI H H, ZHANG T, TSANG D C W, LI G X. Effects of external additives: Biochar, bentonite, phosphate, on co-composting for swine manure and corn straw. Chemosphere, 2020, 248: 125927.

[32] AWASTHI M K, DUAN Y M, AWASTHI S K, LIU T, ZHANG Z Q, KIM S H, PANDEY A. Effect of biochar on emission, maturity and bacterial dynamics during sheep manure compositing. Renewable Energy, 2020, 152: 421-429.

[33] AWASTHI M K, PANDEY A K, BUNDELA P S, WONG J W C, LI R H, ZHANG Z Q. Co-composting of gelatin industry sludge combined with organic fraction of municipal solid waste and poultry waste employing zeolite mixed with enriched nitrifying bacterial consortium. Bioresource Technology, 2016, 213: 181-189.

[34] HUANG G F, WONG J W C, WU Q T, NAGAR B B. Effect of C/N on composting of pig manure with sawdust. Waste Management, 2004, 24: 805-813.

[35] PAN J T, LI R H, ZHANG Z Q, MA J Y, LIU H B. Influence of palygorskite addition on biosolids composting process enhancement. Journal of Cleaner Production, 2019, 217: 371-379.

[36] LIU T, AWASTHI M K, AWASTHI S K, REN X N, LIU X Y, ZHANG Z Q. Influence of fine coal gasification slag on greenhouse gases emission and volatile fatty acids during pig manure composting. Bioresource Technology, 2020, 316: 123915.

[37] 魏啟航, 任艷芳, 何俊瑜, 李兆君. 畜禽養(yǎng)殖廢棄物堆肥過程中微生物除臭研究進(jìn)展. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 53(15): 3134-3145.

WEI Q H, REN Y F, HE J Y, LI Z J. Research progress of microbial deodorization in livestock and poultry wastes composting. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(15): 3134-3145. (in Chinese)

[38] BERNAL M P, PAREDES C, SáNCHEZ-MONEDERO M A, CEGARRA J. Maturity and stability parameters of composts prepared with a wide range of organic wastes. Bioresource Technology, 1998, 63(1): 91-99.

[39] WANG G Y, KONG Y L, LIU Y, LI D Y, ZHANG X H, YUAN J, LI G X. Evolution of phytotoxicity during the active phase of co-composting of chicken manure, tobacco powder and mushroom substrate. Waste Management, 2020, 114: 25-32.

[40] ESTEBAN Q, ARIZ I, CRUZ C, MORAN J F. Review Mechanisms of ammonium toxicity and the quest for tolerance. Plant Science, 2016, 248: 92-101.

[41] ZHANG B X, XU Z C, JIANG T, HUDA N, LI G X, LUO W H. Gaseous emission and maturity in composting of livestock manure and tobacco wastes: Effects of aeration intensities and mitigation by physiochemical additives. Environment Technology & Innovation, 2020, 19: 100899.

[42] ZHAO X L, LI B Q, NI J P, XIE D T. Effect of four crop straws on transformation of organic matter during sewage sludge composting. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(1): 232-240.

[43] 許修宏, 馬懷良. 接種菌劑對雞糞堆肥腐殖酸的影響. 中國土壤與肥料, 2010(1): 54-56.

XU X H, MA H L.Influence of microbial inoculants on humic acids in compost of chicken manure. Soil and Fertilizer Sciences in China, 2010(1): 54-56. (in Chinese)

[44] 陳迪, 趙洪顏, 葛長明, 李金雪, 李雪, 樸仁哲. 中藥渣堆肥化過程中腐殖酸的動態(tài)變化研究. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(4): 292-295.

CHEN D, ZHAO H Y, GE C M, LI J X, LI X, PIAO R Z. Dynamics of humic acid during composting of Chinese Herbal Medicine. Journal of Agricultural Science Yanbian University, 2015, 37(4): 292-295. (in Chinese)

[45] SHAN Y N, CHEN J H, WANG L, LI F, FU X H, LE Y Q. Influences of adding easily degradable organic waste on the minimization and humification of organic matter during straw composting. Journal of Environmental Science and Health, 2013, 48(5): 384-392.

Application Effect of Fungi Promoting Secondary Fermentation in Composting

1School of Environmental and Safety Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, Jiangsu;2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081

【Objective】Secondary fermentation is indispensable to improve the functional value of chicken manure or other breeding wastes. This study applied the screened fungi in the secondary fermentation stage of chicken manure composting to explore the effect of the fungi on promoting the secondary fermentation, and the fungi were identified, so as to provide the theoretical basis and support for the high value and resource utilization of chicken manure.【Method】The products of chicken manure after primary fermentation were used as raw materials, and two strains of fungi ( FCM1 and FCM3 ) were previously screened in the laboratory and were added before secondary fermentation. Three treatments were set up, including raw materials mixed with 1% (V:W，L·kg-1) sterile liquid medium (CK), raw materials mixed with 1% liquid medium containing FCM1 (F1), and raw materials mixed with 1% liquid medium containing FCM3 (F3), and some indexes were detected, including temperature, pH, electroconductibility (EC), ammonium nitrogen, nitrate nitrogen, GI and humic acid in different secondary fermentation stages.【Result】Compared with CK, the addition of fungi could promote the temperature rise and humification process during the secondary fermentation stage. Compared with the CK, F3 treatment reached the mesophilic period 8 days earlier, but F1 treatment delayed the second fermentation of chicken manure composting. As for F3 treatment, the thermophilic stage (>50℃) lasted 13 days, GI reached 80% at 25 days earlier than that under CK, and the humification degree was relatively higher (PHA=74.58%, PHA: the ratio of humin and total humus). The correlation analysis showed that GI had significant positive correlation with pH and PHA, and negative correlation with EC. In addition, FCM3 was identified assp. by morphology and ITS rDNA sequencing.【Conclusion】A strain of fungus FCM3 could promote the secondary fermentation of chicken manure composting, and improve the humification of composting materials, which was of great significance to promote the high value utilization of chicken manure.

secondary fermentation; fungi; composting maturity; high value utilization;

2020-12-11；

2021-03-22

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0500206）、常州大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目（201709、201710）

魏啟航，Tel：15996166142；E-mail：15996166142@163.com。通信作者李兆君，E-mail：lizhaojun@caas.cn。通信作者任艷芳，E-mail：yanfangren@126.com

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