蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY40b抗白粉病的機(jī)理

沙仁和，蘭黎明，王三紅，羅昌國

蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY40b抗白粉病的機(jī)理

沙仁和1，蘭黎明1，王三紅1，羅昌國2

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006

【目的】探究蘋果白粉病相關(guān)基因調(diào)控蘋果抗白粉病的機(jī)理，為蘋果白粉病的抗性育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳蕴O果品種‘嘎拉’葉片為材料提取總RNA，并以cDNA為模板克隆552 bp特異性片段，采用Gateway技術(shù)將該基因片段的正反向序列構(gòu)建入RNAi表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)中，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對蘋果葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，蘋果葉片選用組培苗莖尖處幼嫩葉片；利用RT-qPCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株中、超氧化物歧化酶基因（）過氧化氫酶基因（）、過氧化物酶基因（）以及-1,3-葡聚糖酶基因（）的表達(dá)量進(jìn)行分析；進(jìn)一步以1年生植株為材料，通過白粉病菌（）接種試驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)基因植株對白粉病的抗病性；然后以接種白粉病菌后0、5、10、15、20 d的轉(zhuǎn)基因植株及其對照植株葉片為材料，進(jìn)行氯化硝基四氮唑藍(lán)液（NBT）和二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）染色來分析病菌侵染期間植物材料中超氧陰離子和過氧化氫的積累量，進(jìn)一步對病菌侵染期間植株中SOD、POD、CAT和-1,3-葡聚糖酶等酶活性進(jìn)行測定?！窘Y(jié)果】經(jīng)過PCR檢測，確定獲得3個(gè)基因沉默株系，分別為RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3；RT-qPCR結(jié)果顯示3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系基因沉默效率分別為95.2%、92.2%、79.8%，轉(zhuǎn)基因植株中、的表達(dá)量相較野生型顯著上調(diào)；人工接種白粉病菌后發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的粉狀病斑顯著減少，超氧陰離子和過氧化氫的積累量顯著降低，SOD、CAT、POD等調(diào)節(jié)植物超氧陰離子代謝的抗氧化酶以及抗病相關(guān)的-1,3-葡聚糖酶的活性顯著增強(qiáng)。【結(jié)論】的沉默使得蘋果植株對白粉病的抗病性增強(qiáng)，推測轉(zhuǎn)基因植株中、的上調(diào)表達(dá)提高了蘋果植株對白粉病的基礎(chǔ)抗性，導(dǎo)致植物對超氧陰離子的清除能力增加，維持了植物體在響應(yīng)病菌侵染過程中的低濃度超氧陰離子含量，從而減少高濃度超氧陰離子對植物的損傷。

蘋果；白粉?。?；轉(zhuǎn)基因；活性氧；抗氧化酶

0 引言

【研究意義】蘋果白粉病的病原為白叉絲單囊殼（），屬于子囊菌門叉絲單囊殼屬，是一種專性寄生型真菌[1]。蘋果白粉病主要危害蘋果葉片、嫩枝、花器和幼果，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)造成果樹葉片脫落，新梢枯死，花器受害，幼果脫落等，在中國蘋果栽培區(qū)域均有發(fā)生，嚴(yán)重危害蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。白粉病抗性育種是防治白粉病的有效手段之一，而抗性基因的挖掘則為抗性育種提供重要依據(jù)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了植物對生物、非生物脅迫的響應(yīng)[3]，可作為抗性基因進(jìn)行研究。因此，探究調(diào)控蘋果抗白粉病的機(jī)理，對白粉病抗性育種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子是1994年被發(fā)現(xiàn)并且命名的[4]，保守的WRKY結(jié)構(gòu)域包含約60個(gè)氨基酸殘基[5]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合特定的DNA序列來激活或抑制多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。Eckey等[7]在小麥研究中發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子與小麥白粉病抗性之間存在聯(lián)系；MENG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大麥轉(zhuǎn)錄因子HvWRKY10、HvWRKY19和HvWRKY28調(diào)節(jié)增強(qiáng)大麥對白粉病的免疫和基礎(chǔ)防御。近年來，Wang等在對葡萄抗真菌病害的研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄轉(zhuǎn)錄因子VqWRKY52和VlWRKY48在擬南芥中的異源表達(dá)均提高了其對白粉病的抗病性[9-10]；Wei等[11]研究發(fā)現(xiàn)，二倍體森林草莓中WRKY轉(zhuǎn)錄因子FvWRKY42在擬南芥中的異源表達(dá)同樣增強(qiáng)了擬南芥對白粉病的抗性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大麥、編碼的蛋白通過與編碼的蛋白互作來調(diào)控大麥對白粉病的抗性[12]，值得注意的是，這兩個(gè)大麥基因分別與擬南芥的、基因同源。Pandey等證實(shí)了擬南芥、參與擬南芥對白粉病抗性的調(diào)控[13-14]。在之前的研究中，以蘋果品種‘富士’為材料，克隆了并發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥同源，受白粉病菌侵染的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以蘋果品種‘嘎拉’為材料，利用RNAi技術(shù)沉默，并分析相關(guān)抗病基因的表達(dá)，在接種白粉病菌的條件下，觀察轉(zhuǎn)基因植株的抗病性，檢測轉(zhuǎn)基因植株中活性氧（ROS）的積累量及抗氧化酶活性，探究調(diào)控蘋果抗白粉病的機(jī)理。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年6月至2020年6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

‘嘎拉’組培苗由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)張志宏教授惠贈(zèng)，現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室。白粉病菌新鮮孢子采自本實(shí)驗(yàn)室蘋果溫室中感病蘋果葉片。

克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司；pENTR/ D-TOPO入門載體購自Invitrogen公司；植物表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)由國家大豆改良中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；DH5大腸桿菌感受態(tài)及EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及載體構(gòu)建 取‘嘎拉’葉片，參照RNAprep Pure Plant Plus Kit說明書（TIANGEN）方法提取RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）說明書方法反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性克隆引物（表1），利用Gateway技術(shù)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pB7GWIWG2(II)。對構(gòu)建完成的植物表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶dⅢ和Ⅰ雙酶切鑒定和測序鑒定，測序所用引物為LOCUS1和LOCUS2（表1）。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植株檢測 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并利用葉盤法使轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌侵染‘嘎拉’組培苗葉片，通過培養(yǎng)使其再生成苗[16]。采用CTAB法[17]提取轉(zhuǎn)基因植株和對照植株DNA。PCR檢測引物根據(jù)載體上的基因設(shè)計(jì)（表1）。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因蘋果植株對白粉病的抗性鑒定 對轉(zhuǎn)基因株系以及對照植株采用壓片法進(jìn)行白粉病菌接種試驗(yàn)，并在接菌后25 d觀察白粉病發(fā)病情況。利用photoshop軟件進(jìn)行病斑面積統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 超氧陰離子和過氧化氫（H2O2）含量及抗氧化酶活性測定 取接種白粉病菌后0、5、10、15、20 d的葉片分別置于氯化硝基四氮唑藍(lán)液（NBT）和二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）溶液（1 mg·mL-1）中進(jìn)行組織化學(xué)染色，溶液完全淹沒葉片，抽真空（1.2 psi）90 min。取出葉片分別光照30 min和6 h后，置于75%的酒精中水?。?0℃）脫色至葉綠素完全消失，拍照留存。

超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）抗氧化酶活性的測定參考何斐[18]的方法。-1,3-葡聚糖酶活性的測定使用-1,3-葡聚糖酶試劑盒，購于Solarbio生物公司。

1.2.5 基因表達(dá)量分析 RT-qPCR參照SYBRTMII試劑盒（TaKaRa）說明書，選擇作為內(nèi)參基因[19]。抗病相關(guān)基因表達(dá)分析所用引物見表2。目的基因沉默效率計(jì)算方法：沉默效率（%）=（Exp未轉(zhuǎn)基因- Exp轉(zhuǎn)基因）/Exp未轉(zhuǎn)基因×100[20]。

表1 MdWRKY40b克隆及表達(dá)載體構(gòu)建引物序列

表2 RT-qPCR所用引物

2 結(jié)果

2.1 MdWRKY40b克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

從蘋果品種‘嘎拉’中克隆得到552 bp的特異性片段（圖1-A）。構(gòu)建RNAi表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)::（圖1-B），Ⅰ、d Ⅲ雙酶切檢測（圖1-C），隨后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，并進(jìn)行菌液PCR檢測（圖1-D），結(jié)果顯示表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定及目的基因表達(dá)量分析

利用PCR技術(shù)，對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行DNA水平鑒定。擴(kuò)增引物以表達(dá)載體中的序列為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），產(chǎn)物長度為1 393 bp。結(jié)果顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（泳道6—8）擴(kuò)增出一條1 393 bp大小的片段（圖2-A），說明外源表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)::整合到‘嘎拉’基因組中。對3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與野生植株相比，轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量顯著降低，3個(gè)株系沉默效率分別為95.2%、92.2%、79.8%（圖2-B）。

A：基因克隆Gene cloning。M：DL 2000 marker；1—3：MdWRKY40 552 bp片段的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)The three biological replicates of the 552 bp fragment of MdWRKY40b。B：pB7GWIWG2(Ⅱ)::MdWRKY40b載體示意圖Schematic illustration of pB7GWIWG2(Ⅱ)::MdWRKY40b vector。C：MdWRKY40b連接表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)的雙酶切檢測Double enzyme digestion detection of MdWRKY40b linked vector pB7GWIWG2(Ⅱ)。M：DL 2000 marker；M1：DL 15000 marker；CK：pB7GWIWG2(Ⅱ)空載pB7GWIWG2(Ⅱ) vector；CK1：pB7GWIWG2(Ⅱ) ::MdWRKY40b載體pB7GWIWG2(Ⅱ) ::MdWRKY40b vector。D：載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR檢測PCR detection of Agrobacterium of vector transformation。M：DL 2000 marker；1—6：MdWRKY40 552 bp片段的6個(gè)生物學(xué)重復(fù)The six biological replicates of the 552 bp fragment of MdWRKY40b

2.3 抗性基因的表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)，對轉(zhuǎn)基因植株和表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖3所示，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的和均顯著上調(diào)表達(dá)，的表達(dá)量無顯著變化。以上結(jié)果說明沉默增強(qiáng)了抗性基因的表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系白粉病抗性表型觀察

為探究RNAi-轉(zhuǎn)基因株系對白粉病抗性表型，選取長勢一致的‘嘎拉’蘋果和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行白粉病菌的接種試驗(yàn)，白粉病菌處理后的蘋果葉片表型（圖4）以及病斑面積統(tǒng)計(jì)（圖5）結(jié)果顯示，3個(gè)RNAi-轉(zhuǎn)基因蘋果株系相較其對照植株葉片上的粉狀病斑面積顯著減少，且RNAi-1號(hào)轉(zhuǎn)基因株系葉片上的病斑面積最小。

2.5 蘋果葉片活性氧和過氧化氫含量

采集白粉病菌處理0、5、10、15和20 d后的RNAi-轉(zhuǎn)基因株系及對照植株葉片，進(jìn)行氯化硝基四氮唑藍(lán)液（NBT）（圖6）和二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）（圖7）染色和脫色處理，并對染色后的形態(tài)進(jìn)行對比觀察。結(jié)果顯示，隨著白粉病菌處理時(shí)間的延長，葉片染色面積逐漸加大，顏色逐漸加深，分別對應(yīng)超氧陰離子和過氧化氫在葉片中的積累量越來越多。在處理0—20 d內(nèi)，葉片中超氧陰離子和過氧化氫的含量在持續(xù)增長，其中，在15 d時(shí)，野生型株系的超氧陰離子就幾乎遍布整個(gè)葉片，在20 d時(shí)，野生型株系的過氧化氫也基本遍布整個(gè)葉片，而RNAi-轉(zhuǎn)基因株系的超氧陰離子和過氧化氫的積累量相較同一時(shí)期的野生型要少得多，且RNAi-1號(hào)株系中的超氧陰離子和過氧化氫的含量在同時(shí)期的轉(zhuǎn)基因株系中是最少的。

A：轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定PCR identification of transgenic plants。1：野生型植株Wild-type (WT) line；2：pB7GWIWG2(Ⅱ)-MdWRKY40b表達(dá)載體pB7GWIWG2(Ⅱ)-MdWRKY40b vector；3、4：非陽性植株Non-positive line；5：DL 5000 marker；6—8：陽性植株P(guān)ositive line；9：水water。B：轉(zhuǎn)基因植株MdWRKY40b表達(dá)量分析expression level analysis of MdWRKY40b in transgenic plants。C：轉(zhuǎn)基因株系transgenic line

圖3 轉(zhuǎn)基因株系抗性基因的表達(dá)分析

圖4 接種白粉病菌后25 d的表型觀察

A：病斑面積占葉片總面積百分比。平均百分比由20個(gè)葉片生物學(xué)重復(fù)計(jì)算得來，誤差線表示的是數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)誤，根據(jù)Tukey和Games-Howell的顯著性檢驗(yàn)（p＜0.01），與對照相比存在顯著性差異用星號(hào)標(biāo)識(shí)Percentage of lesion area in total leaf area. Average percentage was calculated from 20 biological replicates. Error bars show the standard errors of the mean. Statistically significant differences in the comparisons with CK, according to the Tukey and Games-Howell post hoc tests (p＜0.01), are indicated with asterisks。B：接種白粉病菌后25 d的葉片表型The observation of the leaf phenotype 25 days after inoculated with P. leucotricha

2.6 蘋果葉片相關(guān)抗氧化酶活性

為了進(jìn)一步探究蘋果防御白粉病過程與相關(guān)酶活性的關(guān)系，測定了各侵染時(shí)間點(diǎn)相關(guān)酶的活性（圖8）。在白粉病菌侵染后的15 d，SOD與CAT活性在4個(gè)株系中達(dá)到峰值，之后轉(zhuǎn)基因株系的酶活性趨于平穩(wěn)，而野生型株系的酶活性開始快速降低；經(jīng)白粉病菌處理的葉片POD活性隨侵染時(shí)間不斷增加，在侵染后10 d達(dá)到峰值；在白粉病菌侵染過程中，4個(gè)株系葉片的-1,3-葡萄糖酶活性一直急劇上升到侵染后5或10 d達(dá)到峰值，隨后酶活性急劇下降。在整個(gè)白粉病菌侵染過程中，轉(zhuǎn)基因株系中的4種酶活性始終高于對照株系的酶活性。在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，RNAi-1號(hào)株系中的4種酶活性在白粉病菌侵染后期較RNAi-2號(hào)和RNAi-3號(hào)株系的酶活性高。

圖6 接種白粉病菌后葉片超氧陰離子積累量

圖7 接種白粉病菌后葉片過氧化氫積累量

圖8 接種白粉病菌后葉片抗性酶活性定量分析

3 討論

活性氧產(chǎn)生是有氧代謝的必然結(jié)果，包括氧的一電子還原產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）和二電子還原產(chǎn)物過氧化氫等[21]。病原菌脅迫會(huì)使植物體細(xì)胞大量累積活性氧，低濃度的活性氧可以作為信號(hào)分子來調(diào)控植物的抗病性[22]，但是如果植物體長時(shí)間處于脅迫條件下，植物體內(nèi)的活性氧含量會(huì)隨時(shí)間不斷累積，研究表明，過多的活性氧會(huì)氧化細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和蛋氨酸的含硫基團(tuán)，使Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和卡爾文循環(huán)中的一些酶類失活，它也能氧化蛋白激酶、磷酸酶以及含硫醇?xì)埢霓D(zhuǎn)錄因子，損傷植物體的細(xì)胞組織，最終影響植物正常的生長代謝[23]。因此，增強(qiáng)植物對超氧陰離子的清除能力是增強(qiáng)植物抗逆能力的一種途徑。

活性氧合成、清除以及信號(hào)介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在植物防御病原菌入侵中起著重要作用[24]?；钚匝醯漠a(chǎn)生和清除二者間必須達(dá)到完全平衡才能避免氧化脅迫，植物體酶促反應(yīng)通過調(diào)節(jié)活性氧的代謝來達(dá)到清除活性氧的目的，主要包括SOD、POD及CAT等[25]。黃世文等[26]以對紋枯病具有不同抗性的水稻品種為研究對象，發(fā)現(xiàn)在接種病菌條件下，抗性強(qiáng)的水稻品種中SOD和POD的活性顯著高于感病品種；LJl是從土壤中分離得到的一株對瓜類白粉病有良好防治效果的生防細(xì)菌，谷醫(yī)林[27]在驗(yàn)證生防菌防治黃瓜白粉病的過程中發(fā)現(xiàn)，噴施生防菌LJ1可以誘導(dǎo)黃瓜內(nèi)SOD和POD等抗氧化酶活性的增強(qiáng)；Polidoros等[28]研究表明，在煙草中異源表達(dá)玉米的可以顯著增加煙草對病原菌的抗病性；張亮等[29]在篩選對番茄枯萎病有廣譜防治效果生防菌的過程中發(fā)現(xiàn)，-1,3-葡萄糖酶響應(yīng)真菌的侵染并可以提高番茄的抗病性。

在抵御病原菌侵染的過程中抗性酶活性的提高往往受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如WRKY轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，通過增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)，維持活性氧動(dòng)態(tài)平衡和膜脂穩(wěn)定性來正調(diào)控?cái)M南芥對生物脅迫的響應(yīng)[30]；在提高葡萄對白粉病抗性的研究中發(fā)現(xiàn)，的過表達(dá)提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性，而且防御相關(guān)基因的表達(dá)量也隨之增加[10]；在黃瓜霜霉病菌（）的侵染下，黃瓜的過表達(dá)植株中抗氧化酶表達(dá)水平相較對照植株更高，積累的活性氧較少，水楊酸和茉莉酸信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量顯著增加[31]。本研究將蘋果品種‘嘎拉’中白粉病相關(guān)基因沉默表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中、和的表達(dá)量增加，在接種白粉病菌的條件下，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對白粉病的抗病性增強(qiáng)，抗氧化酶活性提高，產(chǎn)生的活性氧更少。結(jié)合前人研究結(jié)果，筆者推測轉(zhuǎn)基因植株中抗性基因的上調(diào)表達(dá)提高了蘋果植株對白粉病的基礎(chǔ)抗性，使得轉(zhuǎn)基因植株中的抗性酶活性提高，導(dǎo)致植物體對超氧陰離子的清除能力增加，維持了植物體在響應(yīng)病菌侵染過程中的低濃度超氧陰離子含量，從而減少高濃度超氧陰離子對植物的損傷。隨著病菌侵染時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因植株也無法維持活性氧產(chǎn)生和清除的平衡，但是轉(zhuǎn)基因植株的這一失衡點(diǎn)時(shí)間較野生型植株的晚。

4 結(jié)論

以蘋果品種‘嘎拉’為材料，利用RNAi技術(shù)獲得3個(gè)沉默的轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株中的、和表達(dá)量顯著增加；在接種白粉病菌后，發(fā)現(xiàn)的沉默使得蘋果對白粉病的抗病性增強(qiáng)，超氧陰離子和過氧化氫的積累量顯著降低，SOD、CAT、POD等調(diào)節(jié)植物超氧陰離子代謝的抗氧化酶以及抗病相關(guān)的-1,3-葡聚糖酶活性顯著增強(qiáng)。綜上推測，轉(zhuǎn)基因植株中、、的上調(diào)表達(dá)提高了相應(yīng)酶的活性，導(dǎo)致植物對超氧陰離子的清除能力增加，減少了高濃度超氧陰離子對植物的損傷，最終表現(xiàn)為蘋果植株對白粉病基礎(chǔ)抗性的提高。

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The Resistance Mechanism of apple Transcription Factor MdWRKY40b to powdery mildew

SHA Renhe1, LAN Liming1, WANG Sanhong1,LUO Changguo2

1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Institute of Fruits Sciences, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006

【Objective】The research aims to explore the mechanism of apple resistance to powdery mildew regulated by transcription factor gene, and to provide a theoretical basis for apple powdery mildew resistance breeding.【Method】the 552 bp specific fragment ofwas cloned using the cDNA obtained from the ‘Gala’ leaf tissue, the forward and reverse sequence of this gene specific fragment was constructed into the RNAi expression vector pB7GWIWG2(Ⅱ) by the Gateway technique, and then transgenic plants were obtained by an-mediated method. Notably, the young leaves at the stem tips of tissue culture seedlings were chosen as the materials for-mediated infection experiments. The expression levels of, superoxide dismutase gene (), catalase gene (), peroxidase gene (), andin transgenic plants were analyzed by RT-qPCR technology. Furthermore, using one-year-old plants as materials, the resistance of transgenic plants to powdery mildew was analyzed through the inoculation test of the powdery mildew pathogen (). The leaves of transgenic and control plants at 0, 5, 10, 15, and 20 d after inoculation withwere used as materials, and the accumulation of superoxide anion and hydrogen peroxide in plant materials duringinfection was analyzed by staining with nitrotetrazolium chloride solution (NBT) and diaminobenzidine (DAB). Furthermore, the activities of SOD, POD, CAT, and-1,3-glucanase in plants were determined duringinfection.【Result】Threegene silencing lines were identified by PCR detection. The RT-qPCR results showed that the gene silencing efficiency of RNAi-1, RNAi-2, and RNAi-3 was 95.2%, 92.2%, and 79.8%, respectively. The expression level of,, andin transgenic plants was significantly up-regulated compared with the wild-type. Under the condition ofinfection, compared with wild-type plants, the area of powdery disease spots in the leaves of transgenic plants decreased significantly, the accumulation of superoxide anion and hydrogen peroxide was reduced significantly, and the activities of antioxidant enzymes such as SOD, CAT, and POD regulating superoxide anion metabolism and-1,3-glucanase related to disease resistance were significantly enhanced. 【Conclusion】The silencing ofenhances the resistance of apple plants to powdery mildew. It is speculated that the up-regulated expression level of,, andin transgenic plants improves the basic resistance of apple plants to powdery mildew, and increases the scavenging ability of plants to superoxide anions. It can maintain a low concentration of superoxide anion content in response toinfection, so as to reduce the damage of high concentrations of superoxide anion to plants.

apple; powdery mildew;; transgene;reactive oxygen species (ROS); antioxidant enzyme

2021-04-19；

2021-05-31

國家自然科學(xué)基金（31560551）、貴州省落葉果樹特色種質(zhì)資源收集保存和創(chuàng)新利用（黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)字（2014）08號(hào)）

沙仁和，E-mail：1091595079@qq.com。通信作者王三紅，E-mail：wsh3xg@njau.edu.cn。通信作者羅昌國，E-mail：376258195@qq.com

（責(zé)任編輯 岳梅）