載辛伐他汀PCL-Gt/PCL屏障膜對兔顱骨缺損修復(fù)作用的研究

黃崇上，朱慧勇

在臨床中由于各種原因?qū)е碌墓侨睋p十分常見，現(xiàn)有的骨缺損修復(fù)治療方法包括自體骨移植、同種異體骨移植以及人工骨替代品移植。引導(dǎo)骨再生技術(shù)[1](guided bone regeneration, GBR)是近年來臨床中用于治療骨缺損的主要方法，其中屏障膜的使用能夠選擇性阻斷缺損區(qū)域上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞長入，為成骨細(xì)胞增殖，新骨形成提供空間，是治療成功的關(guān)鍵因素[2]。然而當(dāng)下臨床中所使用的屏障膜因缺乏成骨誘導(dǎo)作用，需要協(xié)同使用不可吸收的人工骨替代物來促進(jìn)骨組織再生。因此，尋找既具有良好的屏障功能，又能夠加載生物活性因子并進(jìn)行緩慢釋放的生物膜成為骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點。

靜電紡絲技術(shù)能夠通過對噴絲嘴施加高壓，使不同的聚合物溶液形成核殼結(jié)構(gòu)，制備出具有相互連接的三維多孔結(jié)構(gòu)和巨大表面積的生物膜，被用作緩釋系統(tǒng)搭載藥物、生長因子或基因，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域[3-4]。我們曾利用靜電紡絲技術(shù)成功制備了載有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)的聚乙二醇/聚己內(nèi)酯(PEG/PCL)膜，體內(nèi)和體外實驗證實了該膜能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和新骨形成[5]。但是，BMP-2價格昂貴，容易失活，在機(jī)體內(nèi)使用可能引起免疫反應(yīng)，在臨床應(yīng)用中受到較大限制。

辛伐他汀是一種脂溶性藥物，能夠通過提高BMP-2的表達(dá)來促進(jìn)體內(nèi)外成骨[6-7]。在臨床中，辛伐他汀主要通過口服攝入并作用于肝細(xì)胞，較難在骨髓中達(dá)到有效濃度，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的生物學(xué)行為。有學(xué)者通過皮下注射來達(dá)到局部應(yīng)用辛伐他汀的目的，但需一天多次注射以維持局部濃度，且存在增加炎癥發(fā)生的風(fēng)險，限制了它在臨床中的應(yīng)用[8-10]。因此，設(shè)計并制備能夠加載難溶性辛伐他汀的生物膜，能夠局部緩慢釋放藥物，顯得至關(guān)重要。本研究擬通過同軸靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建能控釋辛伐他汀的PCL-Gt/PCL膜，評價其穩(wěn)定性和對骨缺損愈合的影響，為該膜在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為新型骨生物材料的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取雄性新西蘭大白兔18只(浙江大學(xué)動物實驗中心提供)，體重2.0～2.5 kg。隨機(jī)分為空白組、陰性對照組和實驗組，每組6只?？瞻捉M不植入生物膜，陰性對照組植入PCL-Gt/PCL膜，實驗組植入PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜。本實驗經(jīng)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 載辛伐他汀Gt/PCL膜的制備及表征 將明膠(gelatin，Gt)溶解在三氟乙醇(2,2,2-trifluroroethanol，TFE)中，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的溶液；辛伐他汀溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)溶液中，最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%。同軸靜電紡絲過程參照已有研究進(jìn)行[11]。Gt/TFE溶液用于制備外殼；而含有辛伐他汀的PCL/TFE溶液用于制備內(nèi)核，獲得Gt/PCL-辛伐他汀膜。此后利用單射流將單純PCL膜與Gt/PCL-辛伐他汀膜進(jìn)行混紡，最終獲得雙層PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜(圖1A)。同時制備不含辛伐他汀的PCL-Gt/PCL膜，所有膜于常溫下避光保存。

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜的Gt/PCL-辛伐他汀面及PCL面的表面結(jié)構(gòu)，并測量兩個面的平均孔徑大小(樣本量100)。

1.2.2 辛伐他汀緩釋檢測 將PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜(10 mm× 10 mm)置入離心管中，在37 ℃環(huán)境下用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡。每日收集200 μL上清液置于-20 ℃冰箱中保存，并加入200 μL新鮮PBS，持續(xù)28 d。使用高效液相色譜儀測定上清液中辛伐他汀的濃度，繪制累積釋放曲線。

1.2.3 骨缺損模型建立 4%戊巴比妥鈉1 mL/kg兔耳緣靜脈注射麻醉。麻醉成功后，顱頂備皮消毒，無菌條件下切開顱骨外側(cè)皮膚，暴露顱骨面，于頭部正中額頂交界正中線一側(cè)，用牙科低速球鉆，0.9%生理鹽水充分冷卻下制備直徑15 mm洞穿性全厚圓形骨缺損(圖1B)，置入相應(yīng)膜。陰性對照組及實驗組Gt/PCL面對準(zhǔn)缺損區(qū)，空白組徹底去除骨膜。軟組織復(fù)位，可吸收線分層嚴(yán)密縫合。

A：屏障膜大小為20 mm×20 mm；B：于兔顱骨正中制備15 mm圓形缺損

1.2.4 樣本獲取及Micro-CT檢測 手術(shù)后4周及12周處死實驗動物獲取樣本，4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行Micro-CT掃描，觀察缺損區(qū)新生骨情況，檢測骨體積/組織總體積百分比(BV/TV)、新生骨體積(new bone volume)。

1.2.5 HE染色 樣本固定結(jié)束后，浸入0.5 mol/L的EDTA溶液中室溫脫鈣4周。經(jīng)乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，組織切片厚度為4 μm，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察缺損區(qū)內(nèi)新骨形成情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間比較采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜表面結(jié)構(gòu)

通過同軸靜電紡絲技術(shù)制備的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜具有光滑的納米纖維(圖2)。Gt/PCL-辛伐他汀面為疏松層，交錯纖維所形成的空隙平均最大直徑為(31.71±4.23)μm；PCL面為致密層，空隙間平均最大直徑為(14.05±3.41)μm。

圖2 PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜電鏡圖Fig.2 Electron microscopic view of PCL-GT/PCL-simvastatin membrane

2.2 辛伐他汀緩釋曲線

PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜中辛伐他汀的累積釋放曲線如圖3所示。在前15 d，辛伐他汀的釋放量與時間呈線性關(guān)系，25 d后釋放稍趨于平緩，至28 d時仍有辛伐他汀釋放至PBS溶液中。

圖3 辛伐他汀緩釋曲線圖Fig.3 Simvastatin sustained release curve

2.3 Micro-CT檢測

在術(shù)后4周及12周，處死對應(yīng)組別實驗動物并獲取樣本(圖4)。所獲樣本進(jìn)行Micro-CT掃描，觀察骨缺損區(qū)域新骨形成情況(圖5A)。在4周時，三組在骨缺損邊緣均可見少量新生骨組織，在12周時新生骨組織均較4周時增加，PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組術(shù)區(qū)骨缺損已基本愈合，僅余少量缺損區(qū)，顯著優(yōu)于空白組及PCL-Gt/PCL組。組間t檢驗統(tǒng)計分析結(jié)果提示，在4周及12周，無論是新生骨體積及相對骨體積，PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均顯著高于空白組及PCL-Gt/PCL組。

圖4 樣本大體照片F(xiàn)ig.4 General picture of sample

A：空白組、PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組在4周及12周時骨缺損橫截面新生骨形成情況；B：新生骨體積(new bone volume，NBV)；C：相對骨體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)。*：P<0.05

2.4 組織學(xué)特點

在4周及12周時獲取標(biāo)本，進(jìn)行骨缺損橫截面HE染色。結(jié)果如圖6所示，在骨缺損愈合初期(4周)時，空白組骨缺損邊界區(qū)仍為大量的纖維結(jié)締組織，未見明顯新生骨組織，而PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均可見新生骨島形成，且可見輕微免疫炎癥反應(yīng)。12周時，三組的纖維結(jié)締組織中均可見新生骨形成，未見顯著炎癥反應(yīng)，且PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組較其余兩組可以觀察到更多的新生骨組織。

在4周時，PCL-Gt/PCL組及PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組均可見新生骨組織；12周PCL-Gt/PCL組-辛伐他汀組新生骨組織較4周時顯著增多，且其成骨效果優(yōu)于空白組及PCL-Gt/PCL組；NBI(New bone island)：新生骨島；標(biāo)尺：400 μm

3 討 論

設(shè)計及制備既能夠調(diào)控細(xì)胞功能，又能促進(jìn)組織再生的生物膜，是骨缺損再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵，因此大量生物活性材料及藥物被用于優(yōu)化生物膜結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)骨再生醫(yī)學(xué)的目標(biāo)。本研究制備了PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜，代替GBR術(shù)中使用的生物膜，結(jié)果表明，該膜不僅能防止纖維細(xì)胞爬入缺損區(qū)，還能穩(wěn)定釋放辛伐他汀，有效促進(jìn)缺損區(qū)域骨再生。

隨著生物材料的不斷發(fā)展，當(dāng)下對屏障膜的要求已不僅限于屏蔽纖維長入，屏障膜能否為缺損區(qū)組織細(xì)胞提供合適的生長空間對于骨缺損修復(fù)也至關(guān)重要。骨缺損區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞通過跨膜蛋白或整合素相互交流，這些蛋白或整合素作為細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接，允許鈣、細(xì)胞因子和前列腺素等信使通過。因此屏障膜的孔隙大小不僅影響細(xì)胞的生長，也影響細(xì)胞間的物質(zhì)連接與交換，從而影響骨修復(fù)過程[12]。本研究所構(gòu)建的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜具有三維結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞粘附和遷移的多孔結(jié)構(gòu)。PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜的疏松載藥面孔徑為(31.71±4.23)μm，能夠為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的附著、增殖和分化提供合適的網(wǎng)絡(luò)，致密面孔徑大小為(14.05±3.41)μm，能夠在滲透足夠營養(yǎng)進(jìn)入缺損區(qū)的同時阻止纖維細(xì)胞移入，從而更好地誘導(dǎo)骨缺損區(qū)域組織再生。

單純的生物膜在常規(guī)骨缺損治療中雖然能夠防止纖維長入，加快缺損愈合，在面臨骨極限缺損時，它對骨再生的促進(jìn)作用仍然有限。骨極限缺損的概念最早由Schmitz等[13]提出，指在特定骨組織上造成的無法自行愈合的最小缺損，兔顱骨極限缺損直徑為15 mm[14]，因此本研究通過體內(nèi)制備骨極限缺損模型明確機(jī)體和PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜之間的相互關(guān)系。辛伐他汀主要應(yīng)用于治療高脂血癥及動脈粥樣硬化等疾病。近年來的研究證實辛伐他汀不僅能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞合成BMP-2，還能夠促進(jìn)骨鈣素、骨橋蛋白及Ⅰ型膠原等成骨標(biāo)志性因子的表達(dá)[15]。無論是全身應(yīng)用或局部應(yīng)用辛伐他汀[16-18]，都具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及新骨形成的作用。我們的結(jié)果證實在骨極限缺損條件下，PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜組在術(shù)后4周及12周骨缺損區(qū)域可見更多的骨組織，表明該膜能夠有效促進(jìn)缺損區(qū)的新骨再生，誘導(dǎo)缺損自然愈合。然而，骨缺損修復(fù)不僅需要防止纖維細(xì)胞爬入，還需要提供足夠的骨修復(fù)空間，本實驗所使用的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜不具備支撐作用，用于臨床中可能出現(xiàn)凹陷，在未來需繼續(xù)改進(jìn)屏障膜特性，從而獲得既具有支撐作用又能夠誘導(dǎo)骨生成的屏障膜。

在骨缺損修復(fù)治療過程中，不僅應(yīng)該明確載藥生物膜在機(jī)體骨愈合過程中的作用，是否能進(jìn)行可控給藥也是非常重要。與生長因子或基因治療相比，在機(jī)體局部應(yīng)用辛伐他汀具有較低的風(fēng)險。但有學(xué)者研究表明，辛伐他汀快速大量釋放，在局部高濃度聚集，有導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的風(fēng)險，并且緩釋辛伐他汀更加有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[19-20]。因此，需要一種緩慢釋放辛伐他汀的載體，使其在較長時間內(nèi)發(fā)揮作用，同時限制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。通過靜電紡絲技術(shù)制備的PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜，能夠緩慢釋放辛伐他汀。辛伐他汀的累積釋放曲線與膜在PBS中的孵育時間呈線性相關(guān)，且所釋放的辛伐他汀仍具有良好的生物活性，能夠在體內(nèi)長期有效促進(jìn)新骨形成，表明了PCL-Gt/PCL膜是一種非常穩(wěn)定的載藥控釋系統(tǒng)。

綜上所述，PCL-Gt/PCL-辛伐他汀膜在體內(nèi)不僅能夠阻止纖維細(xì)胞爬入骨缺損區(qū)域，還能夠緩慢釋放辛伐他汀，有效誘導(dǎo)骨愈合過程啟動，促進(jìn)骨缺損區(qū)域新骨形成，為骨組織工程領(lǐng)域提供一種有應(yīng)用前景的新型骨生物材料。