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    TGF-β1受體對ClC-3氯通道在正畸骨代謝中表達的影響

    2022-01-17 13:18:44盧曉琳金作林
    口腔醫(yī)學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:成骨成骨細胞毒性

    盧曉琳,王 歡,曹 猛,金作林

    牙槽骨改建是維持顱頜面骨骼正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要環(huán)節(jié),也是正畸牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ)。牙槽骨在正畸力的作用下處于骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡過程,壓力側(cè)破骨細胞分化成熟,促進骨吸收;張力側(cè)成骨細胞增殖分化,增強新骨形成[1]。但是關(guān)于牙槽骨代謝的具體作用機制目前尚不明確。ClC型氯通道是一種電壓門控型氯通道。其中,ClC-3作為電壓門控型氯通道之一,存在于細胞膜或細胞器膜上,參與調(diào)節(jié)細胞容積、細胞遷移、增殖與凋亡以及細胞器酸化等多種生物活動[2-3]。而且,ClC-3氯通道在骨代謝方面也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,其基因敲除小鼠自出生后就表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、鈣磷代謝異常等骨骼畸形,伴隨較高的死亡率[4-6]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)調(diào)控相應(yīng)靶基因表達的前提是通過TGF-β1受體(TGF-β1 receptor,TβR)介導(dǎo)的,即處于活化狀態(tài)的TGF-β1分子與細胞膜上的TβR相結(jié)合。TβR主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種,其中Ⅰ型和Ⅱ型受體位于細胞膜上,直接參與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),在ClC-3氯通道調(diào)控成骨分化過程中,TGF-β1信號分子的表達與ClC-3氯通道有十分密切的聯(lián)系[9]。

    ClC-3氯通道和TβR在促進成骨分化中是否具有某種內(nèi)在的聯(lián)系,目前還不明確。本研究旨在初步探索TβR對ClC-3氯通道在成骨細胞中的促成骨分化作用,擬通過觀察成骨細胞中不同表達水平的ClC-3氯通道和TβR表達的相互影響,為ClC-3氯通道在促成骨分化機制方面研究提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    α改良伊格爾基本成分(α-MEM)培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Hyclone公司,美國);MC3T3-E1細胞系(此細胞株是小鼠成骨前體細胞,可以分化為成熟的成骨細胞。由西安飛揚生物科技有限公司提供);TGF-β1受體抑制劑(LY2109761,Selleck公司,美國);CCK-8試劑(Sigma公司,美國);Trizol(Invitrogen公司,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,日本);Real-Time PCR試劑盒(TaKaRa公司,日本);脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000,Invitrogen公司,美國);ClC-3抗體(CST,美國);二抗(CST,美國)。

    1.2 TβR抑制劑(LY2109761)的配制

    將5 mg TβR抑制劑(LY2109761)溶解于1.132 45 mL的二甲基亞砜(DMSO)溶液中,得到濃度為10 mmol/L的儲存液,以每管20 μL分裝于EP管中,-80 ℃保存?zhèn)溆?。工作液是將儲存液按濃度梯度稀釋到所需?0、2、0.2 μmol/L的濃度。

    1.3 細胞培養(yǎng)與分組

    將細胞系MC3T3-E1以1×104個/mL的密度接種于六孔板中,選取細胞生長狀況良好,融合面積為80%左右的細胞給予LY2109761的刺激。分為三大組,A:空白對照組;B:0.2、2、20 μmol/L作用24 h組;C:0.2、2、20 μmol/L作用48 h組。

    1.4 LY2109761細胞毒性檢測(CCK-8比色法)

    以每孔約100 μL的細胞懸液(2×104個/mL)接種到96孔板中,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁。向培養(yǎng)板中加入10 μL三種濃度的抑制劑(LY2109761)分別培養(yǎng)24和48 h。向每孔中分別加入10 μL的CCK-8溶液后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,測定各組細胞在450 nm處的吸光度值,以上實驗步驟重復(fù)至少三次。其中細胞死亡率=100%-細胞活力,細胞活力=(A(加藥)-A(空白))/(A(0加藥)-A(空白))×100%。A(加藥)為具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度;A(空白)為具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度;A(0加藥)為具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

    1.5 RNA 提取和Real-time PCR

    按照Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA,將LY2109761不同濃度不同作用時間處理后的各組細胞提取總RNA:選取生長良好的細胞,棄去培養(yǎng)液,使用PBS輕輕沖洗兩遍;在每孔中加入Trizol,裂解,靜置。轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管。在上清液中加入氯仿,至樣品分為透明上清、白色蛋白和有機物三層。吸出透明血清,加入異丙醇,棄去上清液。向沉淀物中加入75%的乙醇,棄去上清液。向沉淀中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水,使用分光光度計將提取物定量。

    按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,然后將其稀釋10倍,將稀釋后的cDNA進行Real-time PCR反應(yīng)。特異性引物序列如下(表1)。

    表1 PCR引物序列及引物大小

    1.6 Western Blot檢測

    將細胞置于冰上,加入蛋白裂解液,離心,提取細胞總蛋白,蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)法進行蛋白定量。將蛋白放至100 ℃加熱5 min使其變性,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育一抗4 ℃過夜,孵育二抗,化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)發(fā)光,使用Image-J軟件對蛋白進行掃描及灰度值分析。

    1.7 siRNA基因轉(zhuǎn)染

    將MC3T3-E1細胞以2×104個/mL接種于六孔板中,待細胞密度融合至70%左右時進行siRNA的轉(zhuǎn)染。分別使用Opti-MEM稀釋ClC-3 siRNA和Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑,使轉(zhuǎn)染細胞的最終濃度為50 nmol/L,二者輕輕混合,室溫下靜置20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細胞中,孵育6 h,更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

    以上實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用單因素方差分析各實驗組。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同作用方式的TβR抑制劑細胞毒性的結(jié)果

    與空白對照組相比,0.2、2、20 μmol/L濃度的TβR抑制劑分別作用24 h和48 h對MC3T3-E1細胞都具有細胞毒性(P<0.05)。相同作用時間時,抑制劑的細胞毒性隨作用濃度的增大而增大,不同作用濃度的抑制劑之間對細胞毒性作用均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),其中0.2、2 μmol/L濃度的抑制劑作用24 h時的細胞毒性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TβR抑制劑在相同作用濃度時,作用時間越短,細胞毒性越小(P<0.05),以濃度為0.2 μmol/L的TβR抑制劑作用24 h對細胞的毒性作用最小(圖1)。

    A:不同作用濃度的TβR抑制劑在相同作用時間對細胞毒性的影響;B:相同作用濃度的TβR抑制劑在不同作用時間對細胞毒性的影響;*:P<0.05,**:P<0.01

    2.2 TβR抑制劑對TβRⅠ、TβRⅡ基因表達的影響

    Real-Time PCR結(jié)果顯示,0.2、2 μmol/L濃度的TβR抑制劑作用MC3T3-E1細胞24 h后,都可以抑制TβRⅠ、TβRⅡ基因的表達(P<0.05)。而對TβRⅠ、TβRⅡ基因表達的抑制效果隨濃度增大而增強(P<0.05)(圖2)。

    *:P<0.05,**:P<0.01

    2.3 TβRⅠ、TβRⅡ?qū)lC-3氯通道表達的影響

    濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑對MC3T3-E1細胞作用24 h后的Real-Time PCR和Western結(jié)果表明,與空白對照組相比,TβR抑制劑組促進ClC-3氯通道基因和蛋白的表達(圖3)。

    A:阻斷TβRⅠ、TβRⅡ的表達對ClC-3基因的影響;B:阻斷TβRⅠ、TβRⅡ的表達對ClC-3蛋白的影響;C:ClC-3蛋白灰度分析;*:P<0.05

    2.4 ClC-3氯通道對TβRⅠ、TβRⅡ表達的影響

    對MC3T3-E1細胞進行ClC-3 siRNA基因轉(zhuǎn)染,ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染序列如下,Sense:5′-CGA GAG AAG UGU AAG GAC ATT-3′;Anti-sense:5′-UGU CCU UAC ACU UCU CUC GTT-3′。轉(zhuǎn)染序列的有效性在前期實驗已得到驗證。Real-Time PCR結(jié)果顯示,阻斷ClC-3氯通道的表達,可以促進TβRⅠ和TβRⅡ基因的表達(P<0.05)(圖4)。

    *:P<0.05,**:P<0.01

    2.5 TβR對成骨分化相關(guān)基因(Alp、Runx2)表達的影響

    分別使用ClC-3 siRNA和TβR抑制劑阻斷氯通道和TβR的表達,觀察Alp、Runx2的變化。Real-Time PCR結(jié)果顯示,TβR抑制劑組的Alp和Runx2的表達均升高(P<0.05),而ClC-3抑制劑組的Alp和Runx2基因表達下降(P<0.05)(圖5)。

    與空白對照相比,*:P<0.05,**:P<0.01

    3 討 論

    正畸牙齒的移動是通過壓力側(cè)牙槽骨吸收,張力側(cè)牙槽骨新骨形成穩(wěn)定在新的位置。ClC-3氯通道作為電壓門控型氯通道之一,存在于細胞膜或細胞器膜上,在正畸骨改建過程中,ClC-3氯通道被證實參與骨代謝的生物信號傳導(dǎo)過程[10]。ClC-3氯通道在小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞以及成骨前體細胞系中均可表達, 能夠促進成骨細胞的成骨分化[11]。TGF-β1生長因子在骨架形態(tài)發(fā)生和成骨細胞分化過程中具有重要作用[12-14]。研究表明,TGF-β1與ClC-3氯通道的表達有緊密聯(lián)系[9]。阻斷TGF-β1表達可促進ClC-3氯通道對骨代謝的調(diào)控。TGF-β1通常是以異構(gòu)受體復(fù)合體發(fā)揮作用,與TβRⅠ、TβRⅡ在細胞表面結(jié)合后引發(fā)后續(xù)的細胞應(yīng)答[15]。但是關(guān)于TβR在ClC-3氯通道調(diào)控成骨分化過程中的作用目前還未見相關(guān)研究。

    TβR抑制劑按作用方式分為選擇性單獨抑制TβRⅠ或TβRⅡ以及同時抑制TβRⅠ和TβRⅡ表達等幾種類型[16]。本研究通過選用同時抑制TβRⅠ和TβRⅡ表達的小分子受體激酶抑制劑(LY2109761)來阻斷TGF-β1下游受體,觀察對ClC-3氯通道在成骨分化過程中的作用。首先,本實驗將TβR抑制劑對TβRⅠ和TβRⅡ基因的最佳作用方式進行篩選,根據(jù)細胞的不同,許多文獻研究使用了0.2~10.0 μmol/L的濃度范圍的同種抑制劑作用不同時間來研究細胞功能[17-18],但是還沒有對TβR抑制劑作用于MC3T3-E1細胞進行過多的研究。經(jīng)過預(yù)試驗的篩選,最終選取了0.2、2、20 μmol/L三種濃度梯度分別作用24 h和48 h來觀察TβRⅠ和TβRⅡ抑制劑對MC3T3-E1的細胞毒性。細胞毒性試驗結(jié)果表明隨著抑制劑濃度增大、作用時間延長其細胞死亡率也在升高,這說明抑制劑對細胞的毒副作用隨著劑量和作用時間而增大,并且抑制劑在0.2 μmol/L和2 μmol/L的濃度作用24 h時細胞的死亡率并無統(tǒng)計學(xué)意義,這可能說明TβR抑制劑在對MC3T3-E1細胞作用時間較低時,作用濃度在較小的范圍之間發(fā)生波動對細胞的毒性沒有太大影響,而超出一定濃度,則會提高細胞的死亡率。而將0.2 μmol/L和2 μmol/L兩種濃度梯度的抑制劑作用24 h來觀察TβRⅠ和TβRⅡ兩種受體基因的表達結(jié)果顯示,2 μmol/L的TβR抑制劑對TβR I、TβRⅡ基因表達的抑制效果強于0.2 μmol/L濃度。濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑作用于MC3T3-E1細胞24 h對TβRⅠ和TβRⅡ基因的抑制效果已經(jīng)達到65%左右,并且產(chǎn)生的細胞毒性在可接受的范圍內(nèi),不會對細胞的生長和增殖產(chǎn)生過度的抑制。

    綜上,本研究選取濃度為2 μmol/L的TβR抑制劑作用MC3T3-E1細胞24 h作為最佳作用方式抑制TβR的表達,并進一步觀察其對ClC-3氯通道的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)抑制TβR表達時,ClC-3氯通道的基因和蛋白水平表達升高。另一方面,當(dāng)阻斷ClC-3氯通道表達時,同樣也會促進TβR的表達。這說明TβR和ClC-3氯通道的表達是相互抑制的。由此猜想,這可能和TβRⅠ、TβRⅡ以及ClC-3氯通道的細胞內(nèi)定位有關(guān)。TβRⅠ、TβRⅡ位于細胞膜上,ClC-3氯通道細胞膜和細胞器膜上也有表達,基于此推測,TβR和ClC-3在細胞膜上的表達存在競爭性關(guān)系,當(dāng)其中一個的表達被抑制時,可促進對方的表達,因此,ClC-3氯通道與TβR的表達可能表現(xiàn)為相互影響的關(guān)系。我們在干擾ClC-3氯通道表達時,TβRⅡ的表達與空白對照組相比升高了80%,而TβRⅠ表達升高了50%,這說明,TβRⅡ?qū)Σ煌磉_水平的ClC-3氯通道更敏感,這可能和TβRⅡ本身的生物學(xué)特性有關(guān),TβRⅡ通常首先通過自身的激活,才能使TGF-β1配體和胞膜上活化的Ⅱ型受體結(jié)合,形成異源二聚體,然后再結(jié)合Ⅰ型受體形成異三聚體復(fù)合物。本研究發(fā)現(xiàn)抑制TβR的表達,可促進成骨相關(guān)基因(Alp、Runx2)的表達,而ClC-3抑制劑組的成骨相關(guān)基因表達與對照組相比卻下降,其中TβR抑制劑組的Alp基因升高程度較Runx2基因明顯。Alp是成骨分化過程中的早期標(biāo)志物,在骨形成早期活性較高[19],Runx2是成骨細胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,發(fā)揮中心調(diào)控的作用[20-21]。由此推測TβR在早期對ClC-3氯通道調(diào)控成骨分化的影響更顯著。綜上所述,在正畸骨改建過程中,TβR可抑制ClC-3氯通道對成骨細胞分化的調(diào)控,但是其具體的分子機制還有待進一步深入的研究。

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