精氨酸聯(lián)合生物活性玻璃對(duì)乳牙釉質(zhì)齲再礦化影響的研究

張 芮，貢 敏，祁建艷，周紅艷，劉 茜，王 玨，梅予鋒，3

齲病已經(jīng)被證明是影響兒童最普遍的慢性病之一，影響著全球數(shù)百萬(wàn)6歲以下的兒童[1]。目前，全球約有6.21億患有齲病的兒童未接受治療[2]。如此高的患病率和未治療率使得低齡兒童齲的預(yù)防和治療成為公共衛(wèi)生服務(wù)的重點(diǎn)。氟化物被證明可以有效逆轉(zhuǎn)早期齲，促進(jìn)再礦化的進(jìn)程[3]。然而對(duì)于高齲風(fēng)險(xiǎn)者，氟化物的作用被證明是有限的[4]。因?yàn)榉镌趐H<4.5時(shí)作用效果有限，并且單純的氟仍然需要額外的鈣、磷等其他離子來(lái)協(xié)同再礦化。此外，氟化物的應(yīng)用可能存在一定的氟牙癥、氟骨癥以及氟中毒[5-6]的風(fēng)險(xiǎn)，因此，6歲以下兒童不推薦使用含氟1 000 mg/kg以上的產(chǎn)品[4]。因此，不少學(xué)者把目光聚焦到其他材料上，希望通過(guò)使用更健康、更安全的材料來(lái)改善氟化物在防齲應(yīng)用方面的局限性和潛在毒性。

近年來(lái)，生物活性玻璃(bioactive glass，BAG)由于其良好的生物相容性被廣泛應(yīng)用于口腔眾多領(lǐng)域。與其他鈣磷基復(fù)合物不同，生物玻璃釋放的離子可以直接形成羥基碳酸鹽磷灰石層，沒(méi)有中間階段的無(wú)定型磷酸鈣(ACP)相[7]。我們課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)表明6%的生物活性玻璃可以有效再礦化乳牙釉質(zhì)早期齲。然而其生成的礦化物鈣磷比低于正常釉質(zhì)，提示其再礦化能力的局限。Bijle等發(fā)現(xiàn)2%的精氨酸(arginine，Arg)可以有效提高氟化鈉的再礦化釉質(zhì)的效果。精氨酸作為產(chǎn)堿底物，可通過(guò)參與口腔內(nèi)的產(chǎn)堿代謝，調(diào)高周?chē)h(huán)境pH[8]，被認(rèn)為是一種很有前景的防齲策略[9]。目前罕見(jiàn)研究報(bào)道精氨酸聯(lián)合生物活性玻璃的再礦化效果。我們選擇乳牙為研究對(duì)象，利用體外pH循環(huán)法探究?jī)烧呗?lián)用對(duì)乳牙早期釉質(zhì)齲的再礦化效果，為安全有效地預(yù)防兒童齲病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

該實(shí)驗(yàn)獲得了南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(PJ2021-004-01)。2021年4月收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科60個(gè)拔除的乳切牙，要求牙冠完整，無(wú)齲壞、裂紋及釉質(zhì)發(fā)育不全等。低速切割機(jī)截除牙根，將牙冠用環(huán)氧樹(shù)脂包埋，僅唇面暴露，用碳化硅紙(800,1 200,2 000目)拋光。將釉質(zhì)面除開(kāi)窗區(qū)(3 mm×3 mm)以外的部分用抗酸指甲油雙層封閉，超聲清洗5 min，在4 ℃冰箱保存。

1.2 溶液制備與分組

A組：6%BAG(大清生物，北京)溶液(n=10)；B組：6%BAG+1%Arg(麥克林，上海)溶液(n=10)；C組：6%BAG+2%Arg溶液(n=10)；D組：6%BAG+4%Arg溶液(n=10)；E組：去離子水(DDW)(n=10)；F組：正常組(n=5)；G組：脫礦組(n=5)

1.3 脫礦液及再礦化液的制備

脫礦液：2.2 mmol/L CaCl2、2.2 mmol/L KH2PO4和0.05 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH為4.5。再礦化液：1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L NaH2PO4和0.15 mol/L KCl，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

1.4 早期釉質(zhì)齲的制備

除正常組外，將其余55個(gè)樣本置于脫礦液中,37 ℃下浸泡48 h。脫礦完成后，超聲清洗5 min終止脫礦。

1.5 pH循環(huán)

分別在上午09:00和下午18:00進(jìn)行兩次pH循環(huán)，共14 d。將樣本置于脫礦液10 min后用去離子水沖洗，使用微刷將各實(shí)驗(yàn)組溶液均勻地涂布在釉質(zhì)開(kāi)窗面，涂布5 min。涂布完成后，流水下沖洗表面，擦干后置于再礦化液中，37 ℃培養(yǎng)箱中以模擬口腔環(huán)境。

1.6 再礦化后性能測(cè)試

1.6.1 表面顯微硬度 除正常組和脫礦組外，各實(shí)驗(yàn)組每組分別隨機(jī)選取5個(gè)樣本，用維氏顯微硬度儀測(cè)量脫礦前后及再礦化后的顯微硬度值，分別記為VHN0、VHN1、VHN2。載荷為0.49 N, 作用時(shí)間為10 s，每個(gè)樣本測(cè)量5個(gè)點(diǎn)，取均值。硬度恢復(fù)率的定義如下：硬度恢復(fù)率(REMH) =(VHN2-VHN1)÷(VHN0-VHN1)×100%。

1.6.2 釉質(zhì)表面微觀形貌及元素組成 正常組、脫礦組以及各個(gè)實(shí)驗(yàn)組每組選取5個(gè)樣本，乙醇梯度脫水，室溫干燥，噴金，使用掃描電鏡觀察牙釉質(zhì)表面形貌。每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域進(jìn)行能譜分析，以定量研究各組鈣、磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及鈣/磷的原子比(Ca/P)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)處理。硬度值及硬度恢復(fù)率使用單因素方差分析和圖基事后多重檢驗(yàn)。鈣、磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Ca/P使用Welch方差分析和Games-Howell檢驗(yàn)兩兩比較，統(tǒng)計(jì)顯著性水平設(shè)為α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 表面硬度

在基線(P=0.993)和脫礦48 h后(P=0.592)，各組間的硬度值無(wú)明顯差別。再礦化14 d后，精氨酸與生物活性玻璃聯(lián)用組的硬度值均顯著高于單獨(dú)應(yīng)用組，其中C組硬度值最高。各組硬度恢復(fù)率均為正值，但各組間差異顯著(P<0.001)。各實(shí)驗(yàn)組的硬度恢復(fù)程度均顯著高于DDW組。聯(lián)用組組間的硬度恢復(fù)率無(wú)明顯差異，均顯著高于A組，其中C組的硬度恢復(fù)率最高，為67.00%±2.03%，見(jiàn)表1。

表1 各組硬度值及硬度恢復(fù)率的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

2.2 掃描電鏡結(jié)果

單一應(yīng)用組及協(xié)同組均形成了新的片狀鈣化層，層層覆蓋，恢復(fù)了釉質(zhì)表面的完整性。C組及D組釉質(zhì)表面最為平坦，沉積物致密完整，未見(jiàn)明顯孔隙。去離子水組可見(jiàn)脫礦后暴露的釉質(zhì)，部分區(qū)域形成了少許沉積物，沉積物較薄且分布不均，見(jiàn)圖1。

a：6%BAG；b：6%BAG+1%Arg；c：6%BAG+2%Arg；d：6%BAG+4%Arg；e:DDW組；f:正常組；g：脫礦組

2.3 元素分析結(jié)果

脫礦后鈣和磷含量均顯著降低。 pH循環(huán)后，各組鈣、磷含量均顯著增加,E組增加幅度最低。精氨酸聯(lián)用組的鈣、磷沉積量均顯著高于單獨(dú)應(yīng)用組，其中D組鈣、磷含量最高。脫礦后鈣磷比降低為1.50±0.03，再礦化處理后，單獨(dú)應(yīng)用生物活性玻璃組的鈣磷比升高，但與正常釉質(zhì)的鈣磷比仍有差距。協(xié)同應(yīng)用精氨酸后，鈣磷原子比顯著上升，且C組及D組的鈣磷比與正常釉質(zhì)相似,見(jiàn)表2。

表2 鈣、磷元素的質(zhì)量百分比和鈣磷原子比

3 討 論

顯微硬度已被證明是評(píng)估牙齒硬組織變化的有效方法之一，它可以提供釉質(zhì)表面物理特性的信息[10]。顯微硬度的變化與牙齒結(jié)構(gòu)中的礦物成分的變化相關(guān)[11]。乳牙釉質(zhì)中的無(wú)機(jī)物含量低于恒牙釉質(zhì)，因此乳牙釉質(zhì)的表面硬度稍低于恒牙釉質(zhì)。我們的研究顯示，正常乳牙釉質(zhì)的表面顯微硬度為330.48±8.78至333.12±9.05，該數(shù)值與Molla Asadollah等[12]的研究結(jié)果一致。本研究中，pH循環(huán)結(jié)束后各組的表面硬度值均升高，表明各組均發(fā)生了一定程度的再礦化。添加精氨酸后，顯著提高了釉質(zhì)表面性能的恢復(fù)能力，其中添加2%精氨酸的效果最佳。Yesilyurt等[11]也發(fā)現(xiàn)，精氨酸與碳酸鈣的產(chǎn)品可以顯著提高牙齒表面的硬度值，提出主要?dú)w因于精氨酸作為堿性氨基酸，可以進(jìn)一步提高牙齒周?chē)h(huán)境的pH值，從而較快達(dá)到促進(jìn)鈣磷離子沉積的環(huán)境。

生物活性玻璃處理后的表面可以觀察到大量的納米微球，彼此連接成片狀，覆蓋病變表面。添加精氨酸后，孔隙繼續(xù)減少，提示可能吸附了更多的離子沉積，能譜分析結(jié)果進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。與單獨(dú)應(yīng)用生物活性玻璃相比，加入不同濃度的精氨酸后，鈣和磷離子的含量均有顯著提升，提示精氨酸具備更好的吸附鈣磷離子沉積的能力。精氨酸作為唾液黏蛋白的一種成分，能夠有效粘附在牙齒表面，進(jìn)而調(diào)節(jié)離子間的動(dòng)態(tài)平衡[13]。此外，精氨酸同時(shí)暴露羧基和氨基側(cè)鏈，靜電吸引周?chē)拟}、磷離子。另一方面，精氨酸還可以通過(guò)化學(xué)鍵的作用形成高穩(wěn)定系數(shù)的精氨酸-鈣-磷復(fù)合物[14]。

牙釉質(zhì)的主要成分為羥基磷灰石，也可能存在雜質(zhì)(如碳酸鹽)，這些雜質(zhì)從一定程度上降低了鈣磷比[15]，本實(shí)驗(yàn)收集的正常無(wú)齲壞的乳牙釉質(zhì)表面的鈣磷比為1.60，低于理論值1.67。6%生物活性玻璃對(duì)病變表面成分的鈣磷比恢復(fù)有限，添加精氨酸后，顯著提高了釉質(zhì)表面的鈣磷比，其中添加了2%及4%精氨酸后，鈣磷比與正常釉質(zhì)無(wú)異。Tavafoghi等體外研究表明精氨酸有促羥基磷灰石(HA)成核的能力，可以誘導(dǎo)生成鈣磷比為1.80的礦化物[14]，與人體HA相似。鈣磷比越高，抗酸能力越強(qiáng)[16]。因此，將精氨酸加入生物活性玻璃中對(duì)乳牙齲病防治是有意義的。

我們的研究證明了精氨酸與生物活性玻璃對(duì)乳牙釉質(zhì)早期齲有協(xié)同再礦化的效果。形成了鈣磷比接近于正常釉質(zhì)的類(lèi)羥基磷灰石的鈣化物，并恢復(fù)了表面硬度和形貌。其中添加了2%精氨酸的生物活性玻璃，綜合再礦化性能最佳。精氨酸作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)兒童較為安全[17]，因此在乳牙早期齲的防治方面有著優(yōu)越的前景。