牦牛UCP1基因生物學(xué)特性及組織表達(dá)分析

趙 丹，熊 燕，華永琳，岳永起，郭 玉，熊顯榮，字向東，殷 實(shí)，李 鍵

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)被稱為“世界屋脊”和地球“第三極”，氧分壓很低，年平均氣溫常處于0 ℃以下，七八月的平均氣溫也不足10 ℃，這種極端環(huán)境成為高原動(dòng)物面臨的主要生存挑戰(zhàn)[1]．牦牛(Bosgrunniens)作為該區(qū)域特有畜種及遺傳資源，可適應(yīng)低溫、低氧、強(qiáng)輻射、晝夜溫差大的嚴(yán)酷環(huán)境[2]，造就了牦牛耐低氧耐寒的生理特性[3]．但是目前關(guān)于牦牛耐低氧耐寒的分子遺傳機(jī)制尚不完全清楚．

解偶聯(lián)蛋白(Uncoupling proteins, UCPs)屬于線粒體負(fù)離子載體家族成員，位于線粒體內(nèi)膜．UCPs幾乎在所有的真核細(xì)胞中被確認(rèn)，包括哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行動(dòng)物、魚(yú)類、昆蟲(chóng)、植物、真菌等[4-5]．已知的解偶聯(lián)蛋白家族成員包括UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5，其具有不同的組織分布以及功能特征．其中，UCP2組織分布廣泛，在不同的組織中有不同的作用，例如在肝以及棕色脂肪組織中主要調(diào)節(jié)產(chǎn)熱和能量代謝，在腦組織中會(huì)減少自由基的產(chǎn)生，與氧化應(yīng)激對(duì)腦細(xì)胞損傷作用有關(guān)[6]．UCP4和UCP5主要在動(dòng)物的腦部高表達(dá)，在其它組織中也有分布，具有調(diào)節(jié)能量代謝、保護(hù)神經(jīng)以及調(diào)節(jié)體溫的作用[7]．在牦牛中，UCP3主要分布在骨骼肌中，并在胸肌和腿肌中高表達(dá)，與能量代謝有關(guān)[8-9]．UCP1是產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞的標(biāo)志基因，大多位于棕色脂肪以及白色脂肪中，參與維持機(jī)體體溫的恒定[10]．牦牛具有極強(qiáng)的抗寒適應(yīng)性，UCP1是否參與牦牛體溫調(diào)節(jié)尚不清楚．

研究顯示UCP1通過(guò)解偶聯(lián)作用進(jìn)行產(chǎn)熱，維持動(dòng)物體溫的恒定、調(diào)節(jié)體重以及能量平衡[11-12]．當(dāng)動(dòng)物遭受寒冷刺激時(shí)，解除了正常生理狀態(tài)下UCP1與嘌呤核苷酸的結(jié)合，使UCP1質(zhì)子通道打開(kāi)，導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)而產(chǎn)熱[13]．然而在缺乏UCP1的情況下，機(jī)體會(huì)通過(guò)肌酸循環(huán)的機(jī)制，維持體溫的穩(wěn)定[14]．最近的證據(jù)表明，線粒體解偶聯(lián)的誘導(dǎo)不僅影響線粒體呼吸，會(huì)誘導(dǎo)線粒體解偶聯(lián)導(dǎo)致氧化磷酸化減少[15]，而且會(huì)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括自噬、活性氧產(chǎn)生、蛋白質(zhì)的分泌等[16-17]．在家畜研究中，牛UCP1基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)(C+G)%的含量高低與動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境溫度成正比，證明了UCP1與?？购源嬖陉P(guān)聯(lián)[18]．在敲除小鼠UCP1基因時(shí)，小鼠不能在棕色脂肪中產(chǎn)生熱量，推測(cè)非顫栗性產(chǎn)熱依賴于UCP1蛋白的功能[19-20]．以上研究推測(cè)UCP1基因與動(dòng)物的抗寒適應(yīng)性密切相關(guān)．目前UCP1基因的功能研究主要集中在人及小鼠等模式動(dòng)物，而牦牛UCP1基因序列未知，并且其是否參與牦牛的高原適應(yīng)性尚不清楚．

因此，本實(shí)驗(yàn)以牦牛皮下脂肪cDNA為模板，克隆獲得牦牛UCP1基因序列，并利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)UCP1蛋白的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及物種間的同源性進(jìn)行了詳細(xì)的分析，利用qPCR方法檢測(cè)了UCP1在牦牛各個(gè)組織中的表達(dá)差異，豐富了牦牛UCP1基因的功能研究數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步研究牦牛UCP1功能提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

由四川省阿壩羌族藏族自治州金川縣慶林鄉(xiāng)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供的4～5歲金川公牦牛和4～5歲麥洼公牦牛各3頭為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物．將牦牛清晨空腹屠宰后，用無(wú)菌剪刀分別取其心、肝、脾、肺、腎、肌肉和皮下脂肪組織，快速置于液氮中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 主要試劑及儀器

Trizol、qPCR試劑盒、DL 5000 DNA Marker、氨芐青霉素、及LA Taq酶均購(gòu)自TaKaRa公司．瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購(gòu)自Biowest公司．膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒、pGM-T載體與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞全部購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司．PCR儀(C1000)以及電泳儀均購(gòu)自Bio-Rad公司．

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中牦牛UCP1的預(yù)測(cè)序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：XM_005895812)以及牦牛內(nèi)參基因PPIA的序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：NM_178320)，利用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息如表1所示．

表1 引物信息

1.3.2 RNA提取及cDNA合成

經(jīng)典Trizol法提取牦牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和皮下脂肪等組織的總RNA，利用微量核酸濃度分析儀(Nanodrop ND-1000美國(guó))測(cè)定RNA濃度和純度，其中將OD260/OD280比值在1.8～2.0的樣品按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增和目的片段膠回收

PCR反應(yīng)體系為15 μL：PCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA1 μL，ddH2O5.5 μL．反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃5 min，94 ℃30 s，61 ℃40 s，72 ℃1 min，設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存．

配制1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將長(zhǎng)度符合的目的片段切下裝入新的EP管中稱量，參照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收．

1.3.4UCP1基因T載體構(gòu)建及測(cè)序

將純化后的產(chǎn)物與pGM-T載體連接并置于16 ℃過(guò)夜，后將10 μL連接產(chǎn)物加入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后加入300 μL LB液體培養(yǎng)基震蕩搖勻后培養(yǎng)45 min，使得菌體復(fù)蘇．將復(fù)蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL氨芐的LB固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)12～16 h．在長(zhǎng)出菌落的固體培養(yǎng)基中挑3個(gè)單克隆分別加入到3個(gè)裝有含氨芐的液體培養(yǎng)基的離心管中37 ℃、200 rmp、搖4～6 h．進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.3.3．用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，若得到目的條帶，將陽(yáng)性克隆送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，得到UCP1基因的序列．

1.3.5 熒光定量PCR

試驗(yàn)以PPIA為內(nèi)參基因，qRT-PCR的反應(yīng)體系：7.5 μLSYBR?Premix Ex Taq酶、上下游引物各0.5 μL(10 μM)、3.5 μL ddH2O、最后加入3 μLcDNA(20 ng/μL)．反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min；(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，檢測(cè)UCP1基因在牦牛各個(gè)組織中的表達(dá)情況．

1.4 生物信息學(xué)分析

先在NCBI的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開(kāi)放閱讀框，獲得氨基酸序列；ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析牦牛UCP1基因的理化性質(zhì)；Prot Scale(https://web.expasy.org/protscale/)在線進(jìn)行親疏水預(yù)測(cè)；TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)在線對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；SPOMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)在線進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；NCBI在線BLAST進(jìn)行序列比對(duì)；最后利用MEGA 5.05軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建．

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量PCR數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用GraphPad Prism 8分析軟件中的 ANOVA 程序進(jìn)行單因素方差分析以及多重比較．

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛UCP1基因序列分析

本實(shí)驗(yàn)以牦牛皮下脂肪CDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得UCP1基因目的條帶為954 bp(圖1A)．將菌液送往公司測(cè)序，利用NCBI ORF Finder 在線獲得UCP1序列的開(kāi)放閱讀框，得到UCP1基因ORF全長(zhǎng)為942 bp，編碼313個(gè)氨基酸，結(jié)果與預(yù)期實(shí)驗(yàn)相符(圖1B)，并將所獲得的UCP1基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其GenBank登錄號(hào)為MW345537．

圖1 牦牛UCP1基因克隆

2.2 牦牛UCP1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線分析UCP1的理化參數(shù)，結(jié)果顯示UCP1蛋白的氨基酸數(shù)目為313個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為33 952.48，理論pI值為8.94．由20種氨基酸組成，帶有25個(gè)負(fù)電荷殘基數(shù)，18個(gè)正電荷殘基數(shù)(表2)．UCP1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為34.62．第62位的氨基酸的分值最高(2.311)，疏水性最強(qiáng)；309位的氨基酸分值最低(-3.033)，親水性最強(qiáng)．經(jīng)過(guò)計(jì)算得到總平均親水性系數(shù)為0.134，則推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定疏水性蛋白(圖2)．

表2 牦牛UCP1蛋白的氨基酸組成

圖2 牦牛UCP1蛋白親疏水性分析

2.2.2 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及磷酸化位點(diǎn)分析

利用TMpred軟件在線分析發(fā)現(xiàn)UCP1蛋白在第14～32、115～135、214～231、271～291位氨基酸之間分別存在19、18、21、20個(gè)由膜內(nèi)向膜外跨膜的氨基酸，在第12～34、115～135、214～234、268～287位氨基酸之間分別存在23、21、21、20個(gè)由膜外向膜內(nèi)跨膜的氨基酸(圖3A)．磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，UCP1蛋白一共有31個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)(第5、12、31、36、49、61、64、68、98、104、105、120、121、132、153、155、164、165、169、175、176、180、188、192、224、225、236、247、258、300、305位)，20個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)(第7、19、50、51、76、87、90、110、113、116、143、216、228、229、241、242、248、263、272、278位)，9個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(第55、75、96、152、156、159、193、246、307位)．結(jié)果見(jiàn)圖3B．

圖3 UCP1蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域以及磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Transmembrane domain and phosphorylation site analysis of UCP1 protein

2.2.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

根據(jù)SOPMA進(jìn)行預(yù)測(cè)，牦牛UCP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由46.33%的α螺旋(Hh)、32.59%的無(wú)規(guī)卷曲(Cc)組成和15.34%延伸鏈(Ee)組成，而β轉(zhuǎn)角(Tt)僅占5.75%(圖4A，4B)．UCP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致，由無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈三者交替出現(xiàn)，并且預(yù)測(cè)得到線粒體解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)寡聚狀態(tài)為單體(圖4C)．

圖4 UCP1蛋白質(zhì)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A-B.藍(lán)色線表示α螺旋、紫色線表示無(wú)規(guī)則卷曲和紅色線表示延伸鏈．C.UCP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 牦牛UCP1基因在不同物種之間的同源性對(duì)比

利用在線BLAST對(duì)牦牛和其他物種的UCP1基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)(表3)，發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛、山羊及綿羊的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最高，與斑馬魚(yú)的核苷酸序列和氨基酸序列相似度較低，僅分別為62.58%和64.29%．基于UCP1基因序列利用MEGA 5.05對(duì)牦牛與其他物種進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果與序列結(jié)果比對(duì)一致，牦牛與普通牛的親緣關(guān)系最近，其次是山羊和綿羊，與斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5)．

圖5 牦牛與其他物種的UCP1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 牦牛UCP1基因組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法檢測(cè)出了UCP1基因在牦牛不同組織中的相對(duì)mRNA的表達(dá)量．結(jié)果顯示，UCP1在牦牛各個(gè)組織中均有表達(dá)(圖6A)，在腎中的表達(dá)量最高，并顯著高于其他組織(P<0.05)，除腎之外其他組織之間沒(méi)有差異顯著性．由于金川牦牛與麥洼牦牛肌內(nèi)脂肪以及肉質(zhì)有一定程度的差異[21]，于是我們進(jìn)一步研究了UCP1基因在金川牦牛和麥洼牦牛的肝、脂肪、半腱肌、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量(圖6B)，發(fā)現(xiàn)UCP1基因在金川與麥洼牦牛的脂肪、半腱肌中沒(méi)有差異，在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量麥洼牦牛顯著高于金川牦牛(P<0.05)，并且UCP1基因在麥洼牦牛肝中的表達(dá)量極顯著高于金川牦牛(P<0.0001)．

圖6 牦牛UCP1基因的組織表達(dá)分析

3 討論

UCP1屬于解偶聯(lián)蛋白家族成員，可以激活線粒體的解偶聯(lián)呼吸而產(chǎn)生熱量(非顫栗產(chǎn)熱)，維持動(dòng)物體溫的恒定[22]．在模式動(dòng)物中，關(guān)于UCP1基因的功能研究較為深入，但對(duì)于UCP1基因在牦牛上的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道．此次試驗(yàn)以牦牛皮下脂肪CDNA為模板，利用PCR克隆獲得UCP1基因的全長(zhǎng)954 bp，ORF全長(zhǎng)為942 bp，編碼313個(gè)氨基酸．生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到，牦牛UCP1蛋白為一種不穩(wěn)定疏水性蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)域及多個(gè)磷酸化位點(diǎn)．與前人研究結(jié)果一致，UCP1已經(jīng)證實(shí)有6個(gè)疏水區(qū)存在跨膜結(jié)構(gòu)[23]．UCP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋，無(wú)規(guī)卷曲以及少數(shù)延伸鏈組成．同源比較發(fā)現(xiàn)牦牛UCP1基因與普通牛的同源性最高，雖與其他物種之間也有一定的同源性，但同源性較低，因此推測(cè)UCP1基因在不同物種間可能具有特異性．

之前大多數(shù)研究UCP1基因主要集中在脂肪組織中表達(dá)，最近的研究發(fā)現(xiàn)UCP1在小鼠的胸腺中也有表達(dá)[24]．孫國(guó)權(quán)等研究發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在肉牛的睪丸、腎、肋間肉、心、胰、背膘、肩肉、肝、網(wǎng)脂、腸脂、脾、肺、背最長(zhǎng)肌和淋巴等很多組織中均有表達(dá)，但在背膘中的表達(dá)高于其他組織，并認(rèn)為UCP1與產(chǎn)熱和維持體溫有關(guān)[25]．在綿羊研究中發(fā)現(xiàn)UCP1在腎周脂肪中的基因表達(dá)明顯高于其他組織，而淺表脂肪中的基因表達(dá)低于深層脂肪，在2月齡綿羊腎周圍脂肪組織中的mRNA表達(dá)量最高，然后隨著年齡的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[26]．在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在牦牛心、脾、肺、腎、脂肪、肝、背最長(zhǎng)肌和半腱肌中均有表達(dá)，在腎中的表達(dá)量最高，并且腎與其他組織之間差異顯著(P<0.05)，這可能是由于UCP1參與腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激．研究報(bào)道UCP1位于腎臟的腎小管上皮細(xì)胞，在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中呈時(shí)間依賴性下調(diào)．UCP1的缺失會(huì)增加小鼠腎臟的氧化應(yīng)激，UCP1過(guò)表達(dá)會(huì)減少缺氧處理的腎小管上皮細(xì)胞中線粒體活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生和凋亡，并且小鼠腎臟中過(guò)氧化物酶體增殖物激活物受體PPARγ調(diào)節(jié)會(huì)影響UCP1的表達(dá)[27]．因此推測(cè)這種表達(dá)模式可能是因?yàn)閁CP1參與腎的抗氧化功能，關(guān)于UCP1在牦牛腎臟中的具體功能還需進(jìn)一步的探究．

目前在牦牛中已有UCP3被克隆[28]，并有研究發(fā)現(xiàn)解偶聯(lián)蛋白家族中的UCP2和UCP3基因可作為家畜胴體生長(zhǎng)與肉質(zhì)性狀的候選基因[29]．在牛中，UCP1基因在骨骼肌中的表達(dá)顯著低于棕色脂肪組織，并且定位研究發(fā)現(xiàn)UCP1蛋白在骨骼肌中高表達(dá)，但在骨骼肌中的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞未檢測(cè)到[30]．在綿羊的多態(tài)性檢測(cè)研究中發(fā)現(xiàn)，UCP1基因內(nèi)含子5區(qū)和外顯子6區(qū)共有8個(gè)核苷酸突變，內(nèi)含子5區(qū)變異對(duì)綿羊的生長(zhǎng)速度存在性別差異，同時(shí)對(duì)胴體性狀具有一定影響．含有等位基因C1的公羔群體較其他群體有更高的斷尾重，缺失等位基因A1的母羔群體具有更高的初生重[31]．之前有研究表明金川牦牛肉肌肉剪切力低，肉質(zhì)相對(duì)于麥洼牦牛較細(xì)嫩，并且肌內(nèi)脂肪含量較高[32]，因此我們比較研究了金川牦牛和麥洼牦牛肌肉中UCP1基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)UCP1基因在麥洼牦牛背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著高于金川牦牛，推測(cè)UCP1基因的表達(dá)水平可能與牦牛肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)．

本研究發(fā)現(xiàn)UCP1基因在麥洼牦牛肝中的表達(dá)量極顯著高于金川牦牛(P<0.0001)．之前有研究布氏田鼠在低溫馴化過(guò)程中，肝臟在細(xì)胞水平上的呼吸酶活性及蛋白質(zhì)合成等方面均被激活，表明寒冷環(huán)境會(huì)促使肝臟代謝活力提高[33]．由于麥洼牦牛長(zhǎng)期生活的環(huán)境與金川牦牛相比海拔較高，溫度相對(duì)更低，可以推測(cè)肝臟基因表達(dá)和代謝狀態(tài)與環(huán)境溫度有關(guān)．在低溫環(huán)境中，為了滿足機(jī)體對(duì)ATP 的需求，同時(shí)通過(guò)產(chǎn)熱維持體溫恒定，肝臟呼吸速率顯著增強(qiáng)[34]．研究表明脂肪酸激活UCP1解偶聯(lián)生熱，肝臟對(duì)脂肪酸的生成和代謝具有重要作用[35-36]．在小鼠急性肝損傷后，UCP1蛋白表達(dá)減少、活化能力降低，導(dǎo)致棕色脂肪組織功能下降，機(jī)體產(chǎn)熱減少，從而影響代謝的穩(wěn)態(tài)[37]．這進(jìn)一步說(shuō)明UCP1基因表達(dá)與肝臟的代謝密不可分．

本實(shí)驗(yàn)克隆了牦牛UCP1基因并分析其生物學(xué)特性，研究了UCP1基因在牦牛各個(gè)組織中的表達(dá)，推測(cè)UCP1可能參與牦牛高原適應(yīng)性的調(diào)節(jié)，但對(duì)于UCP1參與介導(dǎo)牦牛骨骼肌的能量代謝以及在冷刺激下調(diào)控肝臟代謝的作用還需進(jìn)一步的研究．

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆出牦牛UCP1基因全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)為954 bp(GenBank No. MW345537)，ORF全長(zhǎng)為942 bp，共編碼313個(gè)氨基酸．生物學(xué)信息分析得到，UCP1蛋白為一種不穩(wěn)定疏水性蛋白．同源分析表明，牦牛UCP1基因與普通牛UCP1基因的同源性高．通過(guò)UCP1基因在牦牛不同組織的表達(dá)分析得到，UCP1在牦牛心、肝、脾等各個(gè)組織中均有表達(dá)，在牦牛腎中的表達(dá)量顯著高于其他組織．并且UCP1基因在麥洼牦牛背最長(zhǎng)肌以及肝中的表達(dá)量顯著高于金川牦牛．以上研究結(jié)果為UCP1蛋白在牦牛的功能研究奠定了基礎(chǔ)．